灭癌素链霉菌中磷硫酰化修饰DNA结合结构域的功能分析

[目的]DNA磷硫酰化(phosphorothioation,PT)是由硫原子取代DNA骨架磷原子上的非桥联氧原子形成的一种新型DNA修饰.PT修饰除参与组成限制修饰系统外,其更为广泛的生物学功能仍有待揭示.PT修饰现有的检测方法操作复杂、成本高、耗时长,而具有操作简便、成本低、耗时短等特点的酶联免疫检测(enzyme...     

基因组磷硫酰化修饰的研究进展及展望

DNA磷硫酰化修饰是DNA骨架上的第一例生理修饰。该修饰由dnd ABCDE编码的5个蛋白协同作用,以硫原子取代DNA磷酸二酯键上一个非桥接的氧原子。研究发现,DNA磷硫酰化修饰广泛存在于各种微生物中,在不同细菌中存在序列特异性,且具有R_P空间构象专一性。近年来,对DNA磷硫酰化修饰的研究取得了一系列的成果。为了对DNA磷硫酰化修饰有一个系统全面的了解,本文将就这一特殊生理修饰的发现过程,研究进展,未来所面临的机遇及挑战作一个简要的概述。     

平末端DNA随机连接构建重组质粒

目的:拼接DNA片段并克隆。方法:用T4DNA连接酶将DNA片段以平末端随机连接,随后用限制性内切酶切割,琼脂糖电泳分离酶切产物,挑选特定片段纯化回收,与线性化的载体质粒连接,转化大肠杆菌感受态细胞。结果:通过以上步骤,成功拼接了不同DNA片段,构建了含有目的拼接片段的重组质粒。结论:该方法简便、易行、可靠,可作为拼接、克隆DNA的备选方案,在分子生物学研究和基因工程中应用。     

合成生物学中的DNA组装技术

合成生物学旨在应用工程学的研究思路及手段去设计或改造生物系统,是一个综合了科学与工程的拥有发展潜力的新兴学科,在生物医药、农业、能源、环保等方面发挥着巨大作用。DNA组装技术是合成生物学中的关键技术,也是合成生物学快速发展的限制性技术。综述了众多DNA组装技术的发展及其在合成生物学研究中的意义和应用。     

PNAS：DNA骨架硫修饰研究获新成果

上海交通大学、武汉大学与美国麻省理工学院共同合作联合完成的论文《DNA磷硫酰化修饰在细菌基因组中广泛分布且量化存在》日前在美国《国家科学院院刊》上发表,这是DNA骨架上硫修饰研究领域又一个新的重大进展,也是邓子新团队与彼得·帝丹合作报道了DNA骨架上硫修饰化学本质后持续合作的新成果。     

基于酿酒酵母的大片段DNA组装与转移技术进展*

DNA组装与转移技术是合成生物学的核心使能技术之一,生命体设计改造的复杂度不断提升,使得对大片段DNA组装与转移技术的需求也日益旺盛。小片段DNA的组装与转移技术目前已经比较成熟,大片段DNA由于其分子量大、易断裂,使得体外操作繁琐且效率低下。聚焦酿酒酵母体内组装和转移的技术进展,详细介绍了基于酿酒酵母一次组装和迭代组装的不同方法,并从导入与导出的角度介绍了大片段DNA的转移技术,便于研究者更好地理解和选择酿酒酵母体内组装与转移技术。此外,还展望了将酿酒酵母开发为大片段DNA组装与转移通用平台实现更多物种基因组大尺度设计改造的愿景。     

MBD结构域和SRA结构域识别甲基化DNA的结构机理

DNA胞嘧啶5-甲基化修饰是表观遗传重要的修饰之一,其对基因表达的调控依赖下游的识别蛋白识别和传递甲基化信号.本文围绕两种主要的甲基化DNA识别结构域——MBD结构域和SRA结构域,综述了它们识别不同修饰形式DNA的结构基础以及发挥功能的分子机理.     

假单胞菌Pseudomonas fluorescens Pf0-1中转录调控因子SpfB负调控DNA磷硫酰化修饰

[目的]DNA磷硫酰化修饰是DNA骨架上非桥接的氧原子以序列选择性和R-构型被硫取代的一种新型DNA修饰。目前,磷硫酰化修饰在多种细菌、古生菌以及人类致病菌中多有发现,但其分子调控机制尚不清楚。为了全面解析磷硫酰化修饰的调控机制,本文选择荧光假单胞菌Pf0-1为研究对象,开展了其DNA磷硫酰化修饰的调控机制研究。[方法]首先,构建了spfB基因缺失和回补菌株,使用碘能特异性断裂磷硫酰化修饰DNA的方法,研究了该基因缺失对修饰表型的影响。利用cDNA在相邻同方向的基因间隔区进行PCR,确定了磷硫酰化修饰基因簇spfBCDE内的共转录单元。通过荧光定量RT-PCR,分析了spfB基因缺失突变株中磷硫酰化修饰基因的转录量。利用异源表达并纯化得到的重组蛋白SpfB进行了体外功能研究。通过EMSA实验,验证了SpfB蛋白具有与spfB启动子序列结合活性。通过DNase I footprinting实验,精确定位了SpfB蛋白与DNA结合序列。[结果]spfB基因的缺失加剧了磷硫酰化修饰DNA断裂所致电泳条带弥散的表型,spfB基因的回补能够恢复该表型,证明spfB基因负调控磷硫酰化修饰。鉴定了spf基因簇中只含有1个共转录单元,且该共转录单元在△spfB突变株中转录水平明显上升。通过EMSA和DNase I footprint实验,检测了SpfB蛋白与磷硫酰化修饰基因spfBCDE的启动子区域5''-TGTTTGT-3''相结合。[结论]SpfB作为转录调控因子负调控磷硫酰化修饰基因spfBCDE的表达,为解析磷硫酰化修饰的调控机制和全面理解基因组上的部分修饰特征奠定了基础。     

假单胞菌Pseudomonas fluorescens Pf0-1中转录调控因子SpfB负调控DNA磷硫酰化修饰（英文）

【目的】DNA磷硫酰化修饰是DNA骨架上非桥接的氧原子以序列选择性和R-构型被硫取代的一种新型DNA修饰。目前,磷硫酰化修饰在多种细菌、古生菌以及人类致病菌中多有发现,但其分子调控机制尚不清楚。为了全面解析磷硫酰化修饰的调控机制,本文选择荧光假单胞菌Pf0-1为研究对象,开展了其DNA磷硫酰化修饰的调控机制研究。【方法】首先,构建了spfB基因缺失和回补菌株,使用碘能特异性断裂磷硫酰化修饰DNA的方法,研究了该基因缺失对修饰表型的影响。利用cDNA在相邻同方向的基因间隔区进行PCR,确定了磷硫酰化修饰基因簇spf BCDE内的共转录单元。通过荧光定量RT-PCR,分析了spfB基因缺失突变株中磷硫酰化修饰基因的转录量。利用异源表达并纯化得到的重组蛋白SpfB进行了体外功能研究。通过EMSA实验,验证了SpfB蛋白具有与spfB启动子序列结合活性。通过DNase I footprinting实验,精确定位了Spf B蛋白与DNA结合序列。【结果】spf B基因的缺失加剧了磷硫酰化修饰DNA断裂所致电泳条带弥散的表型,spf B基因的回补能够恢复该表型,证明spf B基因负调控磷硫酰化修饰。鉴定了spf基因簇中只含有1个共转录单元,且该共转录单元在?spfB突变株中转录水平明显上升。通过EMSA和DNase I footprint实验,检测了SpfB蛋白与磷硫酰化修饰基因spf BCDE的启动子区域5′-TGTTTGT-3′相结合。【结论】SpfB作为转录调控因子负调控磷硫酰化修饰基因spf BCDE的表达,为解析磷硫酰化修饰的调控机制和全面理解基因组上的部分修饰特征奠定了基础。     

合成基因组学：设计与合成的艺术

随着基因组相关技术(测序、编辑、合成等)和知识(功能基因组学)的日益成熟,合成基因组学在本世纪迎得了发展的契机。病毒、原核生物的全基因组相继被化学合成并支持生命的存活,第1个真核生物合成基因组计划已经完成过半,人类基因组编写计划提上日程。在基因组合成的实践过程中,研究者们不断探索对基因组进行重编和设计所应遵循的规则,提高从头合成、组装和替换基因组的技术手段。合成基因组在工业、环境、健康和基础研究领域有着广阔的应用前景,同时也带来了相应的伦理问题。结合在Sc2.0计划中的基因组合成研究和近期合成基因组学所取得的重大进展,本文综述了基因组设计和合成相关的科学、技术和伦理内容,并探讨了未来发展所面对的挑战。作为合成生物学最重要的领域之一,合成基因组学方兴未艾。     

DNA拼接技术研究进展

基因组合成是合成生物学的一个重要环节,其发展将会对未来的生物、医药、农业、能源等方面的发展产生巨大的推动作用,同时DNA拼接作为基因组合成所需要的一种关键技术也日臻完备。回顾了多种DNA拼接技术,并对其中最具发展潜力的几种方法作了综述,探讨不同DNA拼接技术的原理和特点。     

合成生物学技术的研究进展——DNA合成、组装与基因组编辑

合成生物学作为一门新兴学科,其目标主要有两点:一是利用非天然的分子使其出现生命的现象,也就是―人造生命‖;二是―改造生命‖,比如利用一种生命体的元件(或经过人工改造),组装到另一个生命体中,使其产生特定功能。无论是哪种目的,对生命遗传物质DNA的操作都非常关键,其具体包括DNA的从头合成、组装和编辑等。同时,这些使能技术的进步也促进了合成生物学其他领域的发展。本文介绍了DNA操作相关的合成生物学使能技术的最新进展。