昆明小鼠心室肌细胞分离及钙电流观察

目的：探索建立简单实用的小鼠心肌细胞分离方法并观察其钙电流特征,以便有利于心肌细胞电生理和分子生物学研究。方法：采用下腔静脉灌流,原位主动脉插管和胶原酶Ⅱ消化法得单个心肌细胞。在倒置显微镜下观察细胞形态,台盼蓝染色判定心肌细胞活力,利用全细胞膜片钳技术记录钙电流。结果：分离得到的心肌细胞数量多、存活率高、杆状、横纹清晰、折光性好、静止、贴壁良好。逐步复钙后可获得50%～60%耐钙细胞,单个心肌细胞在全细胞膜片钳模式下可记录到典型的L-型钙电流,在细胞外液加入尼群地平后L-型钙电流消失。结论：该心肌细胞分离方法简单实用,重复性好,所获得的单个心肌细胞具有正常的电生理活性。     

小鼠心室肌细胞分离方法的改进

目的：探索更简单实用和重复性好的小鼠心肌细胞分离技术．方法：实验于2005～05／09在大连大学医学院医学研究中心完成．选择8～16周龄昆明小鼠150只，雌雄不拘，体质量30～40g，由大连大学医学院动物中心提供．采用原位主动脉插管和动脉夹固定法酶解分离小鼠心室肌细胞，并在室温下进行全细胞膜片钳记录．结果：可将主动脉插管的时间控制在1．5min内，所获心室肌细胞横纹清晰，一次性复钙可获得50％～60％的耐钙细胞，分离所得细胞可在全细胞膜片钳方式下记录到一过性外向钾电流（Ito）.     

一种快速的小鼠心室肌细胞分离方法

报道一种快速简便的小鼠心室肌细胞分离方法，获得形态结构完整，电生理学特征正常的钙耐受性上心肌细胞。     

大鼠心室肌细胞的分离及其钙电流的观察

目的：探讨大鼠心肌细胞酶急性分离的方法，并观察大鼠心室肌细胞膜钙电流。方法：采用Lngendorff灌流装置，用含胶原酶P(0．12g/L)的台式液，经主动脉逆行灌流心脏，分离心肌细胞；采用膜片钳全细胞记录的方法，观察记录大鼠心室肌细胞膜L型钙电流。结果：心肌细胞的存活率约70％-80％，形态呈长杆状，横纹清晰，膜良好。膜片钳全细胞记录出电压依赖性内向电流，其激活电位-30mV，最大激活电位0mV，反转电位50mV，并且此内向电流可被钙通道阻滞剂维拉帕米抑制。结论：用此法可分离出高存活率的心肌细胞，并具有正常的电生理特性。     

用于钙信号研究的小鼠心室肌细胞急性分离的优化

目的：建立一种可快速获取生理状态良好的用于钙信号研究的小鼠心室肌细胞的方法,同时比较两种细胞保存液对心室肌细胞钙信号的影响。方法取成年小鼠心脏,用改进的 Langendorff 心脏灌流系统行主动脉逆行灌流,利用酶联合法消化,取得心室肌细胞置于两种不同的细胞保存液中,在显微镜下观察并检测其状态。采用共聚焦显微镜观测细胞内钙信号,记录钙火花。结果该方法可以在较短的时间内得到65％以上的长杆状心室肌细胞,细胞能够正常存活12～24 h,并且可以立即用于钙火花观测实验研究。比较两种保存液,细胞保存液 A中富含高钾离子,细胞保存液B中含有正常的胞外钙离子浓度,观察到的钙火花细胞保存液B中比A液的频率高、幅度大,在达峰时间上比A液的时间短。结论通过严格控制各项实验条件,能够成功得到存活率高、纯度高、耐钙的可用于钙火花观测的小鼠心室肌细胞。细胞保存液中的钾离子含量少,并有适量的钙离子有助于观测钙火花的发生。     

适用于膜片钳实验的豚鼠心室肌细胞快速分离

获得正常的单个心肌细胞是细胞电生理实验中的膜片钳技术研究的基础，自从Kono和Powell等首先报道应用酶解法以来，实验者对各种方法进行了研究，但获得理想细胞的百分数不稳定，大多数与“钙反常”导致细胞死亡有关。我们参照商立军等方法加以改进，建立了一种简单、稳定、高效的耐钙心肌细胞的分离方法，并通过全细胞膜片钳记录证实该分离方法得到的细胞有正常的电生理特性，值得推广。     

豚鼠心室肌细胞Na^＋／Ca^2＋交换电流的记录方法

心肌细胞上存在Ｎａ＋／Ｃａ２＋ 交换系统，并可通过Ｎａ＋／Ｃａ２ ＋ 交换电流反映其功能活动。Ｎａ＋／Ｃａ２ ＋ 交换电流的记录采用全细胞电压钳技术，在细胞外灌流液和电极内液中分别加入多种膜通道阻断剂，利用斜坡电压脉冲程序记录在灌流液中加入ＮｉＣｌ２ 前后的电流－ 电压关系曲线，两者数字相减得到单一的Ｎａ＋／Ｃａ２＋ 交换电流。     

膜片钳技术研究中钙耐受的心室肌细胞分离方法

目的：探索并建立适合于膜片技术研究的心室肌细胞急性酶分离方法。方法：采用改进的自制的Langendorff心脏灌流系统,用无钙Tyrode液和酶解液逆行主动脉灌流之后,分次剪取心肌组织置于细胞保存液（KB液）中保存以供全细胞膜片钳方式记录膜电位和膜电流。结果：分离所得80%-90%的细胞呈杆状,边缘清楚,表面光滑,纹理清晰,可记录到典型的动作电位。结论：控制好分离心室肌细胞的实验条件以及熟练掌握实验操作的方法,是分离出适合于膜片钳实验的心室肌细胞的重要因素。     

不同局麻药对大鼠心室肌细胞内钙的影响

该研究从细胞水平比较了消旋布比卡因、左旋布比卡因和罗哌卡因对心肌细胞的直接抑制作用。从细胞内钙浓度抑制的角度对三种局麻药的心肌毒性进行了比较，对局麻药心肌毒性机理研究有一定帮助，并对临床应用有一定指导意义。     

白细胞介素-2参与缺氧/复氧引起的心肌功能损害

目的 :观察在缺氧 /复氧过程中白细胞介素 - 2 (IL- 2 )对心肌的影响及其可能机制。方法 :采用放射免疫法检测心肌组织中 IL- 2的含量 ;用视频跟踪系统和细胞内双波长钙荧光系统检测心肌细胞收缩和细胞内钙的变化。结果 :在缺血再灌注心肌组织中 IL- 2明显增多 [(14 .34± 5 .99vs2 2 .2 5± 3.6 8) ng/ g心肌组织 ]。在缺氧期间加 IL-2 (2 0 0 U/ ml) ,复氧期间心肌收缩和细胞内钙各参数回复的程度与单纯复氧的细胞相比均降低。IL- 2灌流后心肌线粒体丙二醛的含量在缺氧 /复氧后明显高于对照组 [(7.75± 0 .4 1vs6 .81± 0 .5 3) nmol/ mg蛋白 ]。结论 :IL- 2参与缺氧 /复氧引起的心肌功能损害 ,其机制可能与 IL- 2加重心肌线粒体脂质过氧化有关。     

纳洛酮减弱白细胞介素-2对大鼠心肌的抑制作用

目的 :研究白细胞介素 - 2 (IL - 2 )的心脏作用并探讨其相关机制。方法 :采用视频跟踪系统测定大鼠单个心室肌细胞的收缩 ;细胞内双波长钙荧光系统检测细胞内游离钙离子浓度 ;应用 Langendorff灌流装置 ,观察 IL - 2对完整心脏收缩力学的影响。结果 :与对照相比 ,IL - 2 (5、5 0 U/ml)显著抑制单个心室肌细胞的收缩幅度 [(74 .95±4 .79vs98.0 9± 5 .0 2 ) % ,(6 4.30± 5 .2 4 vs97.38± 4 .0 5 ) % ]、最大收缩速度 [(70 .2 3± 4 .85 vs98.0 9± 5 .4 6 ) % ,(6 1.15± 5 .2 0 vs97.38± 6 .85 ) % ]、最大舒张速度 [(71.2 2± 4 .79vs98.32± 6 .0 8) % ,(6 8.16± 5 .2 4 vs97.5 5±5 .0 0 ) % ]和舒张末细胞长度 [(88.2 8± 5 .84 vs97.95± 5 .5 2 ) % ,(84 .18± 6 .5 2 vs98.94± 6 .76 ) % ];IL- 2 (5、5 0 U/ml)显著降低电刺激诱导的心肌细胞内钙瞬变幅度 [(74 .94± 4 .90 vs98.0 9± 3.74 ) % ,(71.0 0± 5 .2 8vs97.38±5 .5 2 ) % ],使舒张末钙水平升高 [(113.91± 5 .93vs10 0 .10± 3.0 2 ) % ,(119.0 9± 7.12 vs10 0 .5 2± 6 .0 0 ) % ]。阿片受体阻断剂纳洛酮 (10 nmol/L)可阻断 IL- 2对心肌细胞收缩和细胞内钙的作用。在离体心脏 ,与对照相比 ,IL- 2 (5 0U/ml)可显著降低左心室     

SD大鼠肝脏枯否细胞分离方法改进研究

目的：研究一种简单、高效、实用并且稳定的SD大鼠肝脏原代枯否细胞( KCs)的提取及培养方法。方法选择体质量200 g左右的健康SD雄性大鼠,采用0．05% IV型胶原酶在体原位灌注法结合剪碎法,37℃水浴振荡20 min,经30%和60%Percoll密度梯度离心后,再经40% Percoll离心及贴壁法纯化提取KCs。倒置显微镜下观察细胞形态,并用台盼蓝染色实验鉴定细胞活力,吞墨实验观察细胞吞噬功能及流式细胞术鉴定细胞纯度。结果每只大鼠平均肝脏KCs的获得量为(1．00±0．20)×107(n=20),细胞活力为(92．34±0．15)%,细胞纯度均在(93．56±0．24)%。结论改良的SD大鼠肝脏KCs提取方法操作简单,效果可靠,可为今后KCs的研究奠定基础。     

镁离子对低氧心肌保护作用的离子通道机制探讨

探讨Ｍｇ２＋对低氧心肌细胞保护作用的离子通道机制。方法采用膜片钳全细胞记录技术及细胞内透析的方法观察低氧时Ｍｇ２＋对心肌细胞钾电流、钙电流、Ｎａ＋－Ｃａ２＋交换电流及短暂性内向电流的调节作用。结果对１０个细胞观察显示常氧时细胞内１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋对动作电位无明显影响，但可显著抑制低氧时动作电位时程的缩短（Ｐ＜０．０５），同时细胞内Ｍｇ２＋对１０分钟低氧引起的外向性钾电流有明显的抑制作用，对１０个细胞观察显示除极至０ｍＶ时其电流值从对照的２１３０±２４３ｐＡ降至１１８９±２１１ｐＡ，Ｐ＜０．０１；在常氧时细胞外１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋对Ｎａ＋、Ｃａ２＋交换电流有部分抑制作用，细胞外Ｍｇ２＋可显著降低复氧早期短暂性内向电流的诱发率。结论细胞内Ｍｇ２＋可抑制低氧心肌细胞Ｋ＋外流，并对维持细胞内高钾及心肌细胞膜的正常兴奋性有重要意义。而细胞外Ｍｇ２＋对防止心肌缺血再灌流引起的钙超载有一定的作用。     

心肌和骨骼肌对低血钙不同反应性机理的初步研究

本实验采用枸椽酸钠等静脉输入复制家兔低血钙。实验动物血钙显著下降,同时出现骨骼肌抽搐和心肌收缩性下降。测定骨骼肌匀浆钙含量在低血钙前、后均比心肌匀浆高。认为这两种肌肉细胞内固有钙含量的差异,是低血钙时骨骼肌收缩亢进和心肌收缩性下降的原因之一,其次为神经肌肉的兴奋性改变。     

自体内皮前体细胞移植对急性心肌梗死大鼠微血管新生及心功能的影响

目的探讨外周血来源的内皮前体细胞自体移植,对大鼠急性心肌梗死后微血管新生与心功能的影响。方法抽取SD大鼠外周动脉血,应用Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞。应用含有VEGF和bFGF的特定培养基体外培养,得到内皮前体细胞;结扎SD大鼠冠状动脉左前降支,建立急性心肌梗死模型;然后将得到的自体内皮前体细胞植入缺血心肌局部区域。对照组动物注入细胞培养液。结果与对照组比较,细胞移植组大鼠心功能明显改善,心肌收缩力显著优于对照组;梗死心肌微血管新生更为明显。结论急性心肌梗死心肌局部移植外周血来源的自体内皮前体细胞,能够促进血管新生;对局部梗死心肌组织结构有一定的保护作用,并可在不同时点不同程度恢复心肌收缩力,显著改善心功能。     

钙激活钾/氯通道对大鼠逼尿肌不稳定调节作用的实验研究

目的 研究钙激活钾／氯通道对逼尿肌不稳定的调节作用的变化，探讨其在逼尿肌不稳定(Detrusor instability，DI)发生中的作用。方法 采用Wistar大鼠DI模型，常规制备正常及DI逼尿肌条，体外张力测定其自发收缩频率和幅度，观察通道阻断剂及开放剂的作用。结果 DI组自发收缩频率与张力较对照组显著增加。大电导钙激活钾通道(Big conductance calcium activated potassium channel，BKca)阻断后，对照组频率降低而张力增加，DI组仅频率明显提高，开放后对照组频率与张力均降低，DI组仅频率明显下降。小电导钙激活钾通道(Sroall conductance calcium activated potassium channel，SKca)阻断后两组的频率与张力均明显增加，而开放后则对照组均降低，DI组仅频率下降。钾通道阻断或开放后对照组频率与张力的变化幅度明显高于DI组。钙激活氯通道(Calcium activated chloride channel，Clca)阻断后，DI组频率与张力下降，而对照组无明显改变。结论 钙激活钾／氯通道反馈调节逼尿肌的收缩，DI时Kca作用下调而Clca作用上调，提示钙相关的调节异常在DI的发生中具有重要作用。     

适合膜片钳实验的心肌细胞分离方法研究

目的：摸索并建立简便可行的适于做膜片钳实验的心肌细胞急性分离方法。方法：采用自行改进的Langendorff心脏灌流装置,用无钙台氏液和酶解液逆行主动脉灌流之后,剪取心肌组织置于KB液中保存以供全细胞膜片钳方式记录电流,结果：分离所得80％～90％的细胞呈杆状,边缘清楚,表面光滑,纹理清晰,可记录到典型的快钠电流。结论：控制好分离心肌细胞的实验条件以及熟练掌握实验操作的方法,是分离出适合于膜片钳实验的心肌细胞的重要因素。     

刺五加的心肌保护作用及其机制的研究

目的：研究刺五加对急性心肌缺血大鼠的心肌保护作用及可能机制。方法：将40只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组,模型组。刺五加高、中、低剂量（100、50、25mg／kg）组,每组各8只。采用结扎大鼠左冠状动脉前降支制备急性心肌梗死模型,观察刺五加对心肌缺血的保护作用;采用原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的d—UTP缺口末端标记（TUNEL）法检测刺五加对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的影响;采用激光扫描共聚焦技术检测刺五加对细胞内游离钙离子浓度的变化。结果：高剂量刺五加可缩小心肌梗死面积（火0．05）,改善缺血心肌的心功能,减少缺血心肌细胞凋亡（P〈O．05）,对60mmol／LKCl诱导的缺血细胞内游离钙离子浓度的升高有明显抑制作用（P〈0．05）。结论：刺五加对大鼠心肌缺血具有保护作用,其机制可能是通过下调细胞内游离钙离子浓度,抑制了心肌细胞凋亡。     

人脐血间充质干细胞体分离、培养及向脂肪细胞分化的实验研究

目的:探讨脐血间充质干细胞(UCB-MSCs)的分离培养及向脂肪细胞的分化潜能。方法:从足月儿脐血中获得间充质干细胞,体外培养传代,流式细胞检测细胞表面及抗原细胞周期;予10-6M地塞米松、100μg/ml1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤(IBMX)、50μg/ml抗坏血酸的IMDM培养基,对MSCs进行诱导向脂肪细胞分化,油红-O染色染色鉴定。结果:成功建立了脐血间充质干细胞分离及培养扩增的方法;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD105、CD29和CD44,不表达造血细胞表型CD34、CD45和内皮细胞表型CD31;经脂肪培养液诱导后在细胞胞浆里可见颗粒状红色脂滴形成。结论:脐血间充质干细胞能进行体外分离培养,并能诱导分化为脂肪细胞。