大鼠视皮层脑片锥体神经元树突膜片钳技术

目的建立树突膜片钳技术,观察全细胞记录模式下大鼠视皮层脑片锥体神经元树突部位电生理性质。方法 采用红外微分干涉相差显微镜结合电耦合式摄像机,利用膜片钳技术进行近端树突钳制,成功形成全细胞记录模式后将膜电位钳制在不同水平,记录大鼠视皮层锥体神经元树突部位的电生理性质。结果 成功记录到电流钳模式下树突部位膜电位,及膜电位钳制在不同水平时电压钳下记录到的突触后自发及诱发反应。结论 采用可视法树突膜片钳技术可以记录到树突部位膜电位、自发及诱发反应,这项新技术对树突部位电生理性质及其上分布的离子通道功能的深入研究具有重要意义。     

视杆细胞多焦视网膜电图

多焦视网膜电图技术越来越多地应用于科研与临床，常规记录是在明视条件下，反映的是视锥细胞的功能。近年出现视杆细胞多焦视网膜电图技术。本综述该技术的检测条件、反应波形和三维功能地形图特征、影响因素、功能评价和应用前景。     

视杆细胞多焦视网膜电图

多焦视网膜电图技术越来越多地应用于科研与临床 ,常规记录是在明视条件下 ,反映的是视锥细胞的功能。近年出现视杆细胞多焦视网膜电图技术。本文综述该技术的检测条件、反应波形和三维功能地形图特征、影响因素、功能评价和应用前景     

多电极阵列记录技术在大鼠视网膜生理研究中的应用

目的 采用多电极阵列（MEA）技术探索记录Sprague-Dawley（SD）大鼠视网膜电生理特征的方法。方法 实验研究。采用成年清洁级雄性SD大鼠6只。处死后急性分离出视网膜神经感觉层,将其转移到MEA生物芯片上,使神经节细胞一面贴于电极阵列,用充氧的Ringer′s液孵育15 min后,记录不同光照刺激或电刺激模式下大鼠视网膜电生理特征。所有数据经Shapiro-Wilk检验呈正态分布,以x±s进行描述。结果 MEA能够记录到SD大鼠视网膜典型的光刺激诱发场电位改变,这种光诱发场电位的幅值随刺激光亮度增加先增大后稳定。暗适应后给予高光亮度（256 cd/m2）刺激时,长时程光照后（6～10 s）,可记录到一个明显的撤光相关场电位改变,表现为一个负向偏折。根据光诱发神经节细胞的放电模式与光刺激的关系,可将神经节细胞分为ON、OFF及ON/OFF型。电刺激诱发神经节细胞的放电主要集中在刺激后的50 ms内。结论 MEA技术可以在保证视网膜神经回路完整的情况下,从多个方面（感觉细胞、双极细胞、神经节细胞3个水平）对视网膜的功能做出客观的评定。     

正常人闪烁光视网膜电图和闪烁光视诱发电位的定量分析

目的探讨闪烁光视网膜电图和闪烁光视诱发电位在正常人的变化规律。方法记录51例正常人10Hz闪烁光VEP和30Hz同陈光ERG，使用离散富里叶法分析波形的振幅和相位。结果应按20岁以下组、20～40岁组和40岁以上组对正常入进行记录。10Hz闪烁光VEP基波、二次谐波的振幅，二次谐波的相位，30Hz闪烁光ERG基波的振幅和相位是分析的主要指标。结论闪烁光视网膜电图和闪烁光视诱发电位能进一步分离视锥细胞功能，对视功能进行更好评价。     

培养大鼠视网膜神经节细胞的形态学与电生理学特性

目的比较不同培养天数大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)形态学特性与电生理功能,探讨其形态与功能的最佳培养时期。方法采用出生后0dLong Evans大鼠,取视网膜培养神经节细胞,分别于培养后第1d、4d、7d3个时间点观察细胞形态,并行膜片钳全细胞记录研究其静息膜电位(resting membrane potential,RMP)和动作电位(action potential,AP)的阈值、幅度及波宽。结果共记录到53个RGCs,根据AP类型RGCs分为单峰型(39个)、瞬变型(11个)和持续型(3个),其中以单峰型为主(占73.6%)。培养1d RGCs不易诱发AP,多数细胞需增加刺激强度后方可诱发出AP;培养4d时绝大多数RGCs给予20PA的刺激即可诱发出AP;培养7d时虽较容易诱发AP,但由于此时细胞存活状态较差,部分细胞(共记录28个细胞,其中8个不能诱发AP)给予不同强度的刺激,均不能诱发出AP。不同培养时期的RGCs静息膜电位和AP的特性无显著差异。结论随着培养时间的延长RGCs形态逐渐趋于成熟,但电生理功能仍处于幼稚状态;培养4d的RGCs形态和电生理状态最好。     

全氟丙烷气体长期滞留玻璃体腔对视网膜影响的观察

目的评价全氟丙烷（Ｃ３Ｆ８）长期滞留玻璃体腔对视网膜影响和诱发视网膜细胞凋亡的可能性。方法１３只兔眼进行玻璃体切除和纯Ｃ３Ｆ８注射,通过不同次数再注气,保持玻璃体腔气体８０％以上;应用光学显微镜和ＴＵＮＥＬ技术进行视网膜组织学检查,同时记录暗适应ＥＲＧ。结果１０只注气眼大气泡滞留时间分别是１５,３０,４５和６０天;手术前后ＥＲＧ记录无差异;除６０天１组的视网膜节细胞层有很少数凋亡细胞外,其它时间里无凋亡细胞发现,视网膜结构正常。结论玻璃体切除术后重复注入Ｃ３Ｆ８以长期保持大体积气泡推压视网膜,对视网膜功能和组织不产生有意义影响。     

rd12小鼠短波长敏感的视锥细胞变性过程研究

背景 视网膜色素变性是先天性盲的重要原因之一,由于视网膜色素变性患者视杆细胞为原发性变性,因此无法了解视细胞变性的机制和过程.研究发现Leber先天性黑矇(LCA)自发突变小鼠具有与视网膜色素变性类似的自然过程,有助于深入探讨视网膜色素变性的发病机制及确定疾病基因治疗靶点.目的研究视网膜色素变性模型LCA自发突变小鼠视网膜短波长敏感的视锥细胞自然变性过程. 方法 按出生后天数(P)取P14、P21、P35、P90的遗传性视网膜疾病LCA的自发突变动物模型Rpe65rd12(B6[A]-Rpe65 rd1 2/J,rd12)小鼠各5只,同时选择鼠龄匹配的野生型C57BL/6J(B6)小鼠作为对照.采用RolandQ450SC UV视觉电生理检测仪行小鼠视网膜电图(ERG)检查,采用单次白色发光二极管(LED)闪光刺激记录总视锥细胞反应,刺激强度分别为1.00 cds/m2和1.96 cds/m2;采用紫外光闪光刺激记录短波长紫外光(UV)敏感的视锥细胞反应,刺激波长为(363±6)nm,刺激强度分别为2.0 mWs/m2和3.0 mWs/m2.ERG记录后次日处死小鼠并制备视网膜铺片,分别采用FITC荧光标记的花生凝集素(FITC-PNA)和Cy3荧光染色法检测2个组不同鼠龄小鼠视网膜中总视锥细胞和UV敏感的视锥细胞的分布和数量变化. 结果 P14 rd12小鼠明适应ERG反应为负波型,各波潜伏期延长,UV敏感的视锥细胞ERG各波记录不到.P21 rd12小鼠视锥细胞ERG b波振幅较野生型B6小鼠下降了约75％,b波潜伏期为(102.80±11.39)ms,较B6小鼠的(43.40±5.60) ms明显延长,差异有统计学意义(t=-8.106,P=0.001);P21、P35和P90野生型B6小鼠UV敏感的视锥细胞ERG b波振幅分别为(59.60±36.00)、(82.40±12.22)和(68.43±17.63) μV,P21、P35和P90 rd12小鼠UV敏感的视锥细胞反应均记录不到.免疫荧光检测显示,P14野生型B6小鼠视网膜视锥细胞较多,呈绿色荧光,大量的视蛋白主要分布在视网膜腹部鼻侧象限UV敏感的视锥细胞中,呈红色荧光,P14、P21、P35 rd12小鼠视网膜中视锥细胞逐渐减少,绿色荧光逐渐减弱,UV敏感的视锥细胞呈散在表达.结论 rd12小鼠出生后早期即出现视锥细胞的数量减少和功能异常,短波长敏感的视锥细胞的丢失和功能异常更早于中长波长的视锥细胞.     

视网膜电图明视负向反应研究进展

视网膜电图（ERG）的明视负向反应（PhNR）是在明适应条件下用亮光刺激时在正向b波后记录到的一负向电位。灵长类动物实验研究及临床研究证实，PhNR的产生与视网膜神经节细胞（RGCs）及其轴突有关，而研究啮齿类动物发现，PhNR起源于无长突细胞的电活动。就灵长类动物PhNR记录条件的改进、不同记录条件下其波形特点、啮齿类动物PhNR的记录条件及特点，以及局部视网膜PhNR在临床应用中的新进展进行综述。     

负载紫红质通道蛋白2重组腺病毒的包装及功能鉴定

背景 紫红质通道蛋白2(ChR2)是从单细胞绿藻莱茵衣藻上分离的一种光敏感通道蛋白,可作为光刺激神经细胞的手段,与电、磁和超声波相比,光在时间和空间上对神经细胞的刺激将更精确. 目的 构建负载ChR2基因的重组腺病毒,并鉴定其功能.方法 将人胚肾293( HEK293)细胞在含质量分数10％胎牛血清的DF12培养基中进行培养及传代.腺病毒穿梭质粒pSB291-hCHR2-GFP与腺病毒包装质粒pBHGlox △E1,3 Cre共转染HEK293,包装得到少量负载ChR2基因的重组腺病毒(Ad-ChR2),经HEK293细胞扩增、CsCl梯度离心,Tris-HCl透析后得到纯化Ad-ChR2.获取4只出生1d的清洁级Long Evans大鼠视皮层组织,用组织块培养法利用无血清培养基原代培养视皮层细胞,用纯化的Ad-ChR2转染培养的视皮层细胞,当转染成功的视皮层细胞表达绿色荧光时给予460 nm蓝光刺激,应用膜片钳技术记录视皮层细胞的动作电位.结果 纯化浓缩后的Ad-ChR2滴度可达7.9×1010PFU/ml,HEK293细胞转染Ad-ChR2 24 h后倒置荧光显微镜下即可见细胞膜上有绿色荧光表达,转染13d可见细胞由扁平变为圆形.无血清培养的视皮层细胞转染纯化的Ad-ChR2后细胞膜上可见绿色荧光蛋白(GFP)的表达,460 nm蓝光刺激后用膜片钳技术可记录到蓝光诱发的视皮质细胞的动作电位.结论 本研究成功构建了负载ChR2基因的重组腺病毒表达载体,并证实ChR2能够感染有功能的视皮质细胞,这对视觉可塑性方面的研究非常重要.     

蛇毒制剂对体外培养的兔结膜下成纤维细胞的影响

目的　观察蛇毒制剂对体外培养的兔结膜下成纤维细胞与胶原黏附及细胞移行和增殖的影响。方法　将培养的第3～5代兔结膜下成纤维细胞于不同浓度的蛇毒制剂孵育后,接种于涂有鼠尾胶原的24孔板中,去除未黏附的细胞,用目镜网格器计数法和四甲基偶氮唑盐法记录贴壁细胞量。在第3代生长融合细胞的培养板上划线,造成无细胞的裸露区,在不同浓度的蛇毒制剂下孵育,用目镜网格器每6h观察记录移行至裸露区的细胞数。第3代兔结膜下成纤维细胞接种于24孔板与不同浓度的蛇毒制剂共育24、48h后,用四甲基偶氮唑盐法记录各孔细胞数量的吸光度(A)值。结果蛇毒制剂抑制结膜下成纤维细胞黏附呈剂量依赖性。抑制成纤维细胞黏附的半数有效量(ID50)为1.0×10     

改良法制作的视网膜切片内核层神经元的形态和电学特性

目的:探讨低温琼脂包埋振动切片机切片法制作的大鼠视网膜切片内核层神经元的形态和基本电生理学特性。方法:采用低温琼脂包埋振动切片机切片的方法制作大鼠视网膜切片,对内核层的神经元进行膜片钳全细胞记录,同时在胞内液中加入荧光黄观察记录细胞的形态。结果:该方法制作的视网膜切片切面平整、细胞活性好、保留了细胞之间的突起联系,能够根据细胞胞体的大小、位置初步辨别细胞的种类。在视网膜切片上荧光黄显示的细胞形态表明,双极细胞胞体呈梭形,突起主要沿纵向延伸;而水平细胞和无长突细胞胞体圆形或椭圆形、胞体较大,分别位于内核层的最外层和最内层。水平细胞和无长突细胞的静息膜电位(RMP)和膜电容(Cm)明显高于双极细胞。给予时程40ms,步阶10mV从-60mV至+40mV的电压刺激,41.7%的视锥双极细胞和64.7%的无长突细胞表现出内向钠电流和外向钾电流,其他细胞则只表现出外向钾电流。结论:采用低温琼脂包埋振动切片机切片的方法操作简单,制作的切片质量稳定可靠,使得在视网膜切片上对包括水平细胞在内的不同内核层神经元进行膜片钳记录成为可能。进一步研究视网膜内核层神经元的电生理学特性,有助于揭示视觉信号的发生、传导和调控机制。     

早产儿视网膜病变激光光凝治疗后视网膜功能发育状况观察

目的 观察早产儿视网膜病变(ROP)患儿视网膜激光光凝治疗后的视网膜功能发育状况.方法 对30例患阈值期ROP并成功接受视网膜激光光凝治疗的早产儿(病例组)和30例无ROP早产儿(对照组)进行闪光视网膜电图(F-ERG)检查,记录视杆细胞反应、视锥细胞反应、最大混合反应及振荡电位.结果 与对照组比较,病例组视杆细胞反应...     

神经节细胞对暗视阈值反应的研究

目的：探讨神经节细胞在暗视阈值反应(scotopic threshold response，STR)形成中的作用。 方法：记录6只正常猫眼和4只视网膜光凝猫眼的STR。倍频YAG固体激光环绕视乳头周围行视网膜光凝，光凝后分别于4、8和16周记录闪光视觉诱发电位(FVEP)和系列光暗适应视网膜电图(ERG)，并于光凝后8、16周取视网膜作光镜和透射电镜观察。记录18名正常人和6例视神经萎缩患者的FVEP、系列光暗适应ERG和STR。结果：光镜和透射电镜观察证实，视网膜光凝后神经节细胞逆行性萎缩。光凝后猫眼FVEP消失、STR在正常范围。视神经萎缩患者FVEP消失，STR和正常对照组无显著性差异。 结论：神经节细胞在STR形成过程中不起作用，STR的细胞起源和神经节细胞无关。 （中华眼底病杂志，1997，13：215-218）     

大鼠视觉发育可塑性关键期终止前后视皮层AMPA受体电流的发育变化

目的为了探索视觉发育可塑性关键期终止机制,对可塑性关键期终止前后,正常大鼠视皮层α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionicacid,AMPA)受体介导的兴奋性突触后电流进行了研究。方法采用脑片膜片钳全细胞记录技术,记录生后3~8周正常大鼠视皮层AMPA受体介导的兴奋性突触后电流。结果在大鼠视皮层II-IV层,95例神经元形成全细胞记录,其中记录到AMPA受体电流43例;生后3~8周,视皮层神经元的输入阻抗、静息膜电位差异无统计学意义;生后3~8周,AMPA受体电流的潜伏期、上升时间、下降时间及半波宽差异无统计学意义;生后3~6周AMPA受体电流的幅值随发育逐渐增加,6~8周幅值变化不显著。结论视觉发育可塑性关键期高峰到成年阶段,大鼠视皮层神经元被动膜学特性无明显变化;AM-PA受体电流幅值随发育逐渐增加,关键期终止时达顶峰;突触后AMPA受体的功能变化可能参与了视觉发育可塑性关键期的终止过程。     

大鼠发育过程中视皮层神经元电生理与形态 学特性的相关性——细胞内染色研究

目的研究大鼠不同发育阶段视皮层神经元电生理学与形态学特性的关系, 观察电生理特性和形态变化的同步化程度,认识正常视觉发育的细胞内机制。 方法应用脑片膜片钳全细胞记录技术和细胞内标记相结合的方法, 获得4～28 d Sprague-Dawleg(SD) 大鼠视皮层神经元的细胞内微电极记录,再进行细胞内标记和组织学染色。 结果成功标记23例细胞,其中锥体细胞与非锥体细胞在电生理特性上差异有显著性。不同发育阶段视皮层神经元形态学上的成熟度不同。 结论①视觉发育过程中,视皮层锥体细胞和非锥体细胞的电生理学特性反映其参与不同的视皮层神经元回路的整合功能。②视觉发育可塑性关键期内,视皮层神经元形态和电生理特性变化的同步化程度大于视皮层下结构。(中华眼底病杂志,2001,17:289-292)     

视网膜单细胞转录组测序研究进展

视网膜由多类细胞组成, 每类细胞都有着独特的生物学功能。即使是同类细胞, 也会因遗传异质性导致细胞功能出现差异。以往传统的研究手段无法分辨这些差异, 有些细胞由于缺乏特异性分子标记或数量稀缺也难以定义, 阻碍了人们对这些细胞的认识及研究。随着生物技术的发展, 单细胞转录组测序技术可以获得单个细胞转录组表达谱、识别细胞间异质性、鉴别细胞亚类及稀有细胞群, 揭示每个细胞的转录组表达谱特征和功能差异, 剖析细胞的起源、功能及变异特征。可获得与疾病相关的特征性细胞亚类及特异性差异表达基因, 加深我们对疾病起因、发展的理解, 也为临床诊断及靶向治疗提供帮助。     

石斛散对体外培养人视网膜细胞的作用

目的 观察中药方剂石斛散及单味药对人视网膜细胞的增生以及谷氨酸损伤的保护作用,探讨其在视网膜细胞损伤或变性类疾病方面的作用及机理,为临床治疗同类疾病提供依据.方法 体外培养人视网膜细胞,通过四甲基偶氮唑盐实验观察石斛散复方以及各单味药对视网膜细胞增生的影响.另用Rhodamine123标记培养的视网膜细胞,通过激光共聚焦扫描显微镜动态观察和记录不同药物作用下细胞的线粒体膜电位(mito-chondrial membrane potential,MMP)变化.结果 体外培养人视网膜细胞贴壁、伸展以及生长良好.四甲基偶氮唑盐实验:石斛散组1.58 g·L-1和0.50 g·L-1以及石斛组5.00 g·L-1对人视网膜细胞活性分别增加21.8%、14.2%和13.4%.MMP实验:石斛散轻度升高MMP,增加约13.5%,同时它可以抵抗谷氨酸损伤细胞后引起的MMP下降,由降低46.4%减少为16.2%.结论 石斛散能够影响人视网膜细胞线粒体功能、促进细胞活性、抵抗谷氨酸对人视网膜细胞损伤作用.可作为临床治疗视网膜变性类疾病的一种选择.     

牛眼小梁网细胞体外培养及吞噬功能的研究

目的研究小梁细胞吞噬功能异常在青光眼发病中的作用。方法利用牛眼分离小梁网组织，进行小梁细胞体外培养；应用乳胶微球为标记物，定性及定量观察体外培养的牛小梁细胞吞噬功能及其影响因素。结果免疫组织化学染色证实牛小梁细胞能分泌纤维连接蛋白和层连蛋白。在体外，牛小梁细胞对乳胶微球有较强的吞噬能力。细胞吞噬乳胶微球的数目随培养时间的延长而增多，培养至２４小时，平均每个细胞含４０．５±６．７个微球，细胞在吞噬过程中出现明显的形态学改变，同时也伴有自身损伤，甚至死亡。肾上腺素及可的松抑制小梁细胞的吞噬功能（Ｐ＜０．０５），ＥＧＦ对细胞吞噬作用无影响。结论小梁细胞的吞噬功能对保持房水流出道通畅起重要作用，小梁细胞的吞噬功能异常可能参与原发性开角型青光眼的发病过程。     

糖尿病对视网膜Müller细胞功能的影响

视网膜M櫣ller细胞在结构上与视网膜神经元、血管关系密切,其主要功能是调节细胞外间质中的离子浓度、参与谷氨酸代谢、调节视网膜内酸碱平衡、支持视网膜内各种细胞代谢等。在糖尿病视网膜病变中,视网膜M櫣ller细胞功能的损害可引起K 离子通道功能的损害,影响视网膜的血管功能;谷氨酸载体活性的损害和谷氨酰胺合成酶的功能降低,可影响神经元细胞的活性和功能;改变GFAP和occludin的表达与分布,使血-视网膜屏障受到损害;向成纤维细胞转化产生收缩力,参与增生性糖尿病视网膜病变的发生与发展;碳酸酐酶功能受到影响,引起视网膜内酸碱平衡失调。