人RHD基因Rhesus盒的检测及其意义

为了解人RHD基因的组合情况，进一步研究RHD基因遗传结构和预测新生儿溶血病．采用PCR—SSP方法，设计4条引物，用同一PCR反应条件同时检测人RHD基因的上游、下游和杂交的Rhesus盒。结果显示：RHD^-／RHD^-纯合子个体只检出杂交Rhesus盒，无上、下游Rhesus盒，RHD^ ／RHD^-杂合子个体能同时检出上、下游和杂交Rhesus盒，RHD^ ／RHD^ 纯合子个体只检出上、下游Rhesus盒，无杂交Rhesus盒。50例RhD阳性样本中5例(10％)为RHD^ ／RHD^-型，其余(90％)均为RHD^ ／RHD^ 型。98例无血缘关系RhD阴性汉族人样本中，54例(55．1％)为RHD^-／RHD^-纯合子，36例(36．7％)为RHD^ ／RHD^-杂合子即RHD基因单体型(可用于对RHD基因单体型进一步分析)，8例(8．2％)为RHD^ ／RHD^ 纯合子。2例弱D型样本同时检出上、下游和杂交Rhesus盒．为RHD^ ／RHD^-型。16例Dd型中10例(62．5％)同时检出上、下游和杂交Rhesus盒，为RHD^ ／RHD^-型．6例(37．5％)只检出上、下游Rhesus盒，无杂交Rhesus盒，为RHD^ ／RHD^ 型。这些样本RHD基因10个外显子的检测结果验证了本方法的正确性。结论：本方法所需引物少，操作简便，结果判断直观，适合临床应用。在RhD阴性中国汉族人中存在为数不少的RHD无效基因(非缺失型和部分缺失型占44.9％)。     

青岛地区汉族HPA、MN、NA血型系统的基因多态性调查

笔者采用PCR-SSP(序列特异性引物)方法,选择H PA(人类血小板抗原)、MN、NA(中性粒细胞抗原)3个血型系统进行基因多态性调查,现报告如下。 1 材料与方法 1.1 调查对象随机选择青岛市无血缘关系、不分年龄、性别、职业的无偿献血者(汉族人群)348人。     

用PCR-SSP技术检测弱D型RHD基因1例

RhD抗原(ISBT004.001;RH1)是一种由RhD蛋白携带的非常重要的血型抗原,是引起新生儿溶血病的最主要原因［1］。极少数人红细胞的D抗原表达数目减少,被称之为弱D(以前叫作DＵ),在白种人中的比例为0.2%～1%,在黄种人中的比例则更低。一部分弱D被解释为RhD蛋白的质的变化,称之为部分D,通常是由RHD／RHCE杂化基因引起,另一部分弱D是由Cde单倍体反式位置的抑制作用引起,这些弱D可能有正常的RHD基因,其RhD抗原表达只是微量减少,被宽松地称之为高级DＵ,现在常被定为正常的RhD。最近笔者发现1名供血者红细胞为弱D型,且实验结果显示弱D型具有独特的基因结构,现报告如下。 1 对象与方法 1.1 研究对象献血者,男,21岁,汉族,在校学生,来本中心献血时被确定为弱D;阴阳性对照血样亦均取自本中心献血者,民族为汉族。 1.2 序列特异性引物针对RHD和RHCE基因之间最具差异的区段设计多对不同引物,特异性地扩增RHD基因的第2～7,9,10外显子和RHCE基因的第1,2,4,5外显子,以及RHD和RHCE基因的第4内含子(表1)。另以人类生长激素(HGH)基因序列特异性引物作为内对照引物,扩增片段为429bp(以上引物均由美国G&T公司合成、纯化及鉴定)。 1.3 基因组DNA的制备使用美国G&T公司基因组DNA抽提试剂盒,采用盐析法从供血者外周血分离获得。0.3ml EDTA抗凝外周血加入1 ml红细胞裂解液,离心弃上清,沉淀加入170μl核裂解液及4μl SDS,剧烈振荡,再加入72μl NaCl溶液,10000r/min离心5min,取上清加入210μl异丙醇沉淀DNA,将DNA溶于100μl TE溶液中,保存待用。 1.4 特异性PCR扩增反应体系11μl,含1μl DNA,8μl引物混合物,1U Taq酶。扩增条件为95℃预变性5min,95℃变性30s,60℃退火30℃s,72℃延伸90s,30循环。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测,电泳时间为25min。     

多重聚合酶链反应分析中国汉族人群RHD基因

目的 分析中国汉族人群RHD基因的构成。方法 采用2套多重PCR－SSCP扩增体系，对450例献血（328例RhD阳性、112例RhD阴性、10例D变异型）的基因组DNA进行RHD特异性外显子3、4、5、6、7、9和内含子4，RHDΨ及C、c等位基因扩增，并与血清学Rh定型结果进行对比。结果 328例RhD阳性献血中，326例具有全部的RHD基因特异性外显子，另有2例分别为D^Va和D^IVb；112例血清学RhD阴性献血中，35例存在全部的RHD基因特异性外显子（31．25％），但该35例样本中未检出RHDΨ基因37bp的插入片段。10例D变异型中3例为D^ⅥⅢ，1例D^Va,1例R0^Har,1例D^DFR;另外4例中，2例缺乏RHD所有特异性外显子，2例扩增出RHD所有特异性外显子。结论 中国汉族人群RHD基因的表达存在多种模式。多重PCR体系分析RHD基因既可诊断个体的RhD表型，又具有确认不完全D以及发现新的D变异型的优势。     

19名RhD(-)经产妇的RHD基因多态性分析

在人类血型系统中,目前最复杂的当属Rh血型系统,因其能导致新生儿溶血病,溶血性输血反应,其临床意义仅次于ABO血型系统[1].研究证明RH基因是由RHD和RHCE 2个结合基因组成[2],这两个结构基因均含有10个外显子,但在RhD(-)人中只有单独的1个RHCE基因[3].特别应引起注意的是RHD基因的结构存在种族差异[4,5],在汉族人的RhD(-)个体中,RHD基因外显子具有多态性[6].笔者用聚合酶链-序列特异性引物(PCR-SSP)方法对19名中国汉族常规血清学RhD(-)经产妇的RHD基因进行检测,以探讨中国汉族RHD基因多态性及同抗-D产生的关系.     

洛阳地区汉族人群RHD基因杂合性检测及其临床意义

目的调查洛阳地区汉族人群RHD基因的杂合情况。方法收集RhD阳性、弱D、RhDel及RhD阴性表型样本共387例,检测RHD基因的Up Box、Down Box及Hybrid Box,并判定个体的合子型。结果在所有387例样本中,94例（24.29%）为RHD＋/RHD-杂合子,246例（63.57%）为RHD＋/RHD＋纯合子,47例（12.14%）为RHD-/RHD-纯合子。300例表型为RhD阳性样本中,RHD＋/RHD＋纯合子有236例（78.67%）,其余64例（21.33%）为RHD＋/RHD-杂合子;12例弱D样本中,RHD＋/RHD＋纯合子有5例（41.67%）,其余7例（58.33%）为RHD＋/RHD-杂合子;19例表型为RhDel样本中,RHD＋/RHD＋纯合子有6例（31.58%）,其余13例（68.42%）为RHD＋/RHD-杂合子;56例表型为RhD阴性样本中,47例（83.93%）为RHD-/RHD-纯合子,其余9例（16.07%）为RHD＋/RHD-杂合子。结论 RHD基因合子型在不同RhD表型（RhD阳性、弱D、RhDel及RhD阴性）个体中的分布频率差异有统计学意义;研究本地区人群RHD基因杂合性,对产前预防RhD-HDN及临床输血具有重要的指导意义。     

中国部分地区RhD(-)汉族人RHD基因结构分析

目的 :了解RhD(- )中国汉族人RHD基因的构成情况 ,并探讨其潜在的应用价值。方法 :采用PCR SSP方法分析 5 0名RhD(+)和 76名常规血清学RhD(- )汉族供血者的RHD基因存在情况 ,对其中 8例RhD(- )血样进行了吸收放散试验。结果 :5 0名RhD(+)供者RHD基因完整存在。 76名RhD(- )供者中 ,2 2名供者(2 8 95 % )存在完整RHD基因 ,9名供者 (11 84% )缺失大部分RHD基因 ,并全为中间缺失型 ;45名供者(5 9 2 1% )完整缺失RHD基因。携带完整RHD基因片段的RhD(- )个体表型均为CC或Cc,而无cc。吸收放散试验证实携带完整RHD基因的常规血清学RhD(- )个体中存在吸收放散弱D型 (Delution ,Del)。结论 :常规血清学RhD(- )中国人RHD基因存在多态性 ,提示中国汉族人RhD(- )特征有多种遗传机制 ,因此在临床医学中要正确对待不同遗传背景的常规血清学RhD(- )个体。     

大连地区100名随机汉族人群血小板抗原基因多态性分析

笔者应用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术对大连地区随机汉族人群血小板抗原(HPA)基因多态性进行分析,现报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料①检测对象随机选取大连地区经体检合格的无血缘关系的汉族献血者100名;②仪器、试剂美国PE公司9600型DNA扩增仪,美国G&T公司提供的HPA 基因分型试剂盒。     

中国人RHD基因合子型检测分析

目的判定中国人群中RHD基因是否是纯合子。方法从上海地区正常献血者中选取RhD阳性、RhD阴性、Del和其它D变异型样本共50份,采用PCR-RFLP方法扩增Rhesus盒子判断RHD合子型,同时相对实时定量real-time quantitative(RQ)PCR扩增检测RHD基因第5、7外显子的特征区域。结果9份样本在2种方法的检测结果中出现矛盾。进一步对RHD基因的特异性序列进行PCR-SSP及克隆测序分析,证实这9份样本中,4份是DⅥⅢ变异型,2份是Del与RHD711del C等位基因杂合子,另外3份是携带有中国RhD阴性人群中较常见的RHD-CE(2—9)-D RH阴性等位基因。结论中国人Rh血型系统遗传背景较白种人复杂,RHD基因存在较多的变异情况。仅使用单一方法判断RHD合子型及RhD血清学表型容易产生误判,而从Rhesus盒子和RHD基因不同外显子2个角度进行综合判断,可以减少误判。     

浙江汉族人群RHD基因合子型检测

目的了解浙江汉族人群RHD基因合子型多态性情况。方法采用PCR-SSP方法检测438例RhD阳性、弱D表现型、RhD阴性表型个体的RHD基因上、下游盒和杂交盒,根据个体盒子的检测结果推测其合子型。结果198例RhD阳性样本中12例(6.06%)为RHD /RHD-型,其余186例(93.94%)为RHD /RHD 型;32例弱D表现型样本中29例(90.63%)为RHD /RHD-型,3例(9.37%)为RHD /RHD 型;208例RhD阴性样本中53例(25.48%)为RHD /RHD-型,145例(69.71%)为RHD-/RHD-型,10例(4.81%)为RHD /RHD 型。结论浙江汉族人群中RhD阳性、弱D表现型、RhD阴性表型个体RHD基因合子型分布频率不同,RhD阴性人群中存在缺失RHD基因或有完整RHD基因的情况。     

中国人特异性的RHD基因定型方法的建立

目的　建立特异性针对中国人的RHD基因定型方法。方法　设计6对特异性针对中国人RHD等位基 因的引物,并引入1对内对照引物,建立PCR 序列特异性引物(PCR- SSP)方法,分6个反应管检测RHD基因。采 用这一方法检测经血清学鉴定和RHD全基因序列分析的88份中国汉族人Rh阴性样本,13份Rh阳性、弱D型和 部分D表型样本,以及28份D放散型(Del)样本,同时对318名随机无偿献血者作RHD基因定型,然后与血清学检 测结果比较。结果　所有样本的PCR SSP检测结果均与血清学结果一致(符合率100%),并可指示目前在中国人 中观察到的全部RHD基因阳性、D抗原阴性等位基因(或称无效等位基因),同时还可检出Del表型及存在于Rh阳 性个体中的Del等位基因(RHD1227A)即RHD/Del杂合型(或RHD/RHD1227A);对318名随机个体的RHD 基因检测显示后者在中国人群中的比例为8/318,Del基因在中国人群中频率即为0.012579。结论　上述PCR-SSP 方法简便、快速,且具有较高的准确率,可用于临床或科研进行中国人RHD基因定型或遗传分析。     

山东地区汉族RhD阴性献血者RHD基因的纯合性分析

目的：Rhesus血型（简称Rh血型）因其抗原众多、变种各异和临床疾病相关性而备受重视。该血型系统中与临床疾病关联最密切的抗原即RhD抗原具有较高的免疫原性。编码RhD抗原的RHD基因两侧各有一个序列高度相似的Rh盒子基因,RhD阴性即是由上、下游Rh盒子基因之间的基因重组引起。分析RhD阴性孕妇丈夫RHD基因的纯合性可预测胎儿患新生儿溶血病的几率。本研究的目的是分析山东地区汉族人RhD阴性表型形成的分子机制,并对Rh盒子基因的扩增产物进行分析以确定RHD基因的纯合性。方法：74例RhD阴性献血者的DNA样品首先进行多重聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）分析。然后对Rh盒子基因进行PCR基因扩增,其扩增产物采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法进行RHD基因的纯合性测定。结果：46例（62%）样品在多重PCR-SSP分析中显示缺失RHD基因,在PCR-RFLP分析中显示为纯合的RHD基因阴性。22例（30%）样品显示存在RHD基因,其中19例显示为杂合的RHD基因,3例显示为纯合的RHD基因。5例（7%）样品缺失RHD基因,但PCR-RFLP分析显示存在一个RHD基因,进一步的分析表明它们至少存在RHD基因第1和10外显子。1例（1%）样品显示存在RHD基因,但缺失第6外显子。结论：HD 基因缺失是引起中国汉族人RhD阴性表型形成的主要分子机制。RhD阴性个体主要表现为纯合的RHD基因阴性,少部分RhD阴性个体存在杂合的RHD基因和纯合的RHD基因。     

藏族和汉族健康人群血浆miRNA表达谱的差异

目的检测并比较藏族和汉族健康人群血浆miRNA表达谱。方法分别采集246例藏族健康人和128例汉族健康人血浆样本,用Taq Man低密度芯片技术对50例藏族和50例汉族组成的2组人混合血浆中的754种miRNA进行检测,随机选取存在miR-130a-3p和miR-629-5p表达差异的样本,用qRT-PCR法进行验证。结果低密度芯片结果显示,藏族和汉族健康人群血浆中miRNA表达谱的相关系数(r)为0.592。与汉族组相比,藏族组血浆中139种miRNA的表达水平发生明显改变,其中62种miRNA表达上调,77种miRNA表达下调。qRT-PCR进一步证实miR-130a-3p和miR-629-5p在藏族组血浆中的含量明显高于汉族组[(467±27.30)×10-5vs(236±9.69)×10-5和(14.67±0.94)×10-5vs(7.58±0.52)×10-5,P均0.01]。结论藏族人群血浆miRNA的表达谱与汉族人群存在明显差异,临床检测miRNA时应考虑民族因素的影响。     

vWF基因A1381T和-1793G/C多态性对中国裕固、藏及汉族人血浆vWF水平的影响

本研究旨在探讨vWF基因A1381T(rs216311)和-1793G/C(rs7966230)单核苷酸多态性(SNP)在中国裕固族、藏族、汉族之间的异同及其对血浆vWF浓度的影响,了解3个民族对vWF相关疾病的易感性。抽取322位裕固族、399位藏族及120位汉族正常人的外周静脉血,提取DNA,采用PCR-限制性酶切片段长度分析vWF基因A1381T、-1793G/C SNP,测序验证。用ELISA试剂盒测定血浆vWF水平。结果表明,vWF基因A1381T位点和-1793G/C位点的基因型分布在裕固族、藏族和汉族中均有差异(P<0.05),其中A1381T位点中的G G基因型在裕固族中占69.9%,远高于藏族和汉族中的56.6%及53.3%(P<0.01),A1381T AA型表达vWF水平较低。-1793G/C中CG型在裕固族中所占的比例远高于汉族,CC型基因型表达较高vWF水平。血浆vWF水平随民族和vWF基因多态性的不同而明显不同。结论:vWF基因A1381T和-1793G/C位点基因多态性分布在中国裕固族、藏族和汉族中有明显差异;基因多态性影响血浆vWF表达水平;裕固族和藏族血浆vWF水平比汉族高,这与环境和生活习惯因素也有关系。     

ICAM-1基因K469E、K56M多态性对中国裕固族、藏族和汉族人血浆ICAM-1水平的影响

本研究检测中国裕固族、藏族和汉族3个民族人群血液中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)基因K469E(A/G,rs5498)和K56M(A/T,rs5491)的基因多态性及血浆中可溶性ICAM-1(sICAM-1)水平,分析其基因型和等位基因频率在不同民族人群中的分布,探讨ICAM-1基因2个多态性位点对血浆中sICAM-1水平的影响。采集327例裕固族、400例藏族及126例汉族人群EDTA抗凝静脉血,采用大量全血基因组DNA提取试剂盒提取DNA,以PCR-RFLP进行DNA多态性分析,琼脂糖凝胶电泳后在凝胶扫描成像系统下判断基因型,DNA测序确定基因序列,比较ICAM-1基因型和等位基因频率在不同群体中的分布,通过Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验群体代表性。采用人ICAM-1 ELISA试剂盒检测各民族人群血浆中sICAM-1水平。结果表明,DNA测序与PCR-RFLP分析结果一致。本研究检测到裕固族、藏族及汉族3个民族ICAM-1基因K469E位点KK、KE、EE 3种基因型,但它们的分布差异没有统计学意义,而K、E等位基因频率分布的差异有统计学意义(P<0.05)。裕固族和藏族分别与汉族群体之间的基因型和等位基因频率分布差异都有统计学意义(P<0.05)。K56M位点在3个民族中只检测出KK、KM 2种基因型,尚未检测到MM基因型;2种基因型和K、M等位基因频率分布在裕固族与汉族群体之间差异有统计学意义(P<0.05)。3个民族人群ICAM-1基因型和等位基因频率无明显性别比例和年龄分布差异,分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)。ICAM-1 K469E位点含K等位基因个体的sICAM-1血浆水平〔(253±122),(185±97)μg/L)〕高于不含K等位基因的个体〔(145±110)μg/L,P<0.01〕。ICAM-1 K56M位点含KK基因型的个体的sICAM-1血浆水平〔(253±122)μg/L〕高于KM基因型的个体〔(168±103)μg/L,P<0.01〕。裕固族和藏族群体中sICAM-1血浆水平〔(224±800),(214±111)μg/L〕高于汉族群体〔(175±125)μg/L,P<0.05〕,两两比较显示,裕固族与汉族群体及藏族与汉族群体中sICAM-1血浆水平差异有统计学意义(P<0.05)。结论:裕固族、藏族和汉族人群的ICAM-1 K469E和K56M 2个氨基酸位点基因型和等位基因频率均以KK/KE型、KK型和K等位基因为主,且裕固族和藏族的高于汉族,性别年龄间无明显差异,本研究对象中的ICAM-1基因型和等位基因频率分布具有群体代表性。ICAM-1基因K469E和K56M多态性影响血液中sICAM-1的血浆水平。K469E基因的K等位基因可能是某些疾病遗传危险因素,而K56M基因的M等位基因可能是其遗传保护因素。