甘蔗葡聚糖酶ScBG1基因的电子克隆及序列分析

为了揭示甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的结构特点和功能特性,从而为该基因的研究和应用提供基础。本研究以水稻β-1,3-葡聚糖酶基因(U72255.1)为搜寻探针,运用电子克隆技术,获得一条甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA,命名为ScBG1,并对其进行生物信息学分析。结果表明：该基因的cDNA序列全长为1842 bp,包含一个1488 bp完整的开放读码框,编码495个氨基酸残基,属于糖基水解酶第十七家族,为疏水性蛋白,含有信号肽。将ScBG1与其他植物种的β-1,3-葡聚糖酶基因进行序列比对,发现该基因具有保守和典型的葡聚糖酶结构域,碱基序列的保守性为45%~73%。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础,也为甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的分子功能研究提供参考。     

水稻葡聚糖内切酶新基因OsGLU16的克隆及特性研究

β-1,4-葡聚糖内切酶(endo-β-1,4-glucanase,EGase)在植物的组织生长、开花、果实成熟、器官脱落等方面都具有非常重要的作用。本研究克隆了一个新的水稻β-1,4-葡聚糖内切酶家族基因Os GLU16。序列分析表明该基因位于水稻第8号染色体,c DNA全长1 827 bp,包含一个1 572 bp的开放阅读框,编码523个氨基酸残基。蛋白质同源性分析表明,Os GLU16基因编码的蛋白在第54~第516个氨基酸残基区域具有高度保守的GH9催化结构域。本研究成功构建了Os GLU16基因过表达载体p Ca MV35S-Os GLU16-EGFP,并获得了转基因水稻植株。植株表型分析表明,与野生型相比,过表达株系表现为株高和穗长显著下降。本研究初步探明了Os GLU16基因过表达转基因水稻植株的表型特征,这为进一步丰富β-1,4-葡聚糖内切酶基因家族在水稻生长发育过程中的作用提供理论基础。     

毛竹β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆及序列分析(英文)

β-1,3-葡聚糖酶是一种植物病程相关蛋白,在植物抵御病害中有重要作用。本研究以毛竹为实验材料,利用RACE技术,克隆毛竹β-1,3-葡聚糖酶基因的外显子序列,并在β-1,3-葡聚糖酶基因的编码区两端设计引物,以毛竹基因组DNA为模版扩增该基因的内含子序列。序列结果表明,该基因全长1693bp,包含两个外显子和一个内含子,命名为PheGLU(GenBank登录号GU238236)。该基因包含1个996bp的开放阅读框,编码332个氨基酸,相对分子质量为3.541×104Da,其等电点pI为6.389,是一个酸性蛋白且分泌到胞外;其中,该蛋白的二级结构中包含35.15%的α-螺旋,21.82%的β-转角,43.03%的延伸链和无规则卷曲等;三级结构同源建模预测显示,它与大麦β-1,3-葡聚糖酶(PDB number:1ghsA)具有80.4%的同源性;聚类分析显示,该基因序列与已报道的其它植物具有较的高氨基酸序列同源性。本研究为进一步鉴定毛竹β-1,3-葡聚糖酶基因的抗真菌病害能力奠定了基础。     

TcLr24小麦STK类抗病基因同源片段的分离和特征分析

利用根据STK类植物抗病基因类似序列保守结构设计的引物,对TcLr24小麦叶片cDNA进行扩增,通过RT-PCR扩增得到STK类抗病基因同源片段长度811bp,开放阅读框长804bp,编码268个通读的氨基酸序列,大小29.6kDa,理论等电点6.14,该氨基酸序列与多个小麦和燕麦蛋白激酶序列高度同源,含有激酶特征结构疏水信号序列及胞外结构域。     

白粉菌(Erysiphe graminis)侵染诱导表达的小麦糖苷水解酶基因TaGlc2的克隆与鉴定

真菌病害是世界小麦生产中的最重要的病害之一。目前,在小麦中已经鉴定出一批小麦病菌侵染诱导基因,包括病程相关基因和抗真菌水解酶基因（葡聚糖酶基因和几丁质酶基因）。最近的研究表明,植物1,3-β-葡聚糖酶参与对真菌侵染的防卫。本研究从小麦cDNA文库中克隆出一个编码小麦1,3-β-葡聚糖酶的新基因,命名为 TaGlc2。该基因编码的氨基酸序列与糖苷水解酶基因家族17高度同源。采用实时定量PCR分析方法对TaGlc2基因在白粉菌侵染(Erysiphe graminis)后小麦叶片中的表达模式进行研究,发现TaGlc2基因在白粉菌侵染6 h后表达明显增强,至24 h达到峰值,说明该基因受白粉菌侵染诱导表达。还获得了TaGlc2基因5'上游调控区序列,发现存在与病菌侵染响应有关的顺式元件。小麦TaGlc2基因在小麦白粉病抗性上可能具有重要作用。     

一个棉花β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA的克隆与特征分析

利用本实验室分离的防卫基因类似物片段,通过5’和3’RACE,从海岛棉海7124中克隆了一个β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA,命名为GbGLU。其全长1 266 bp,含一个编码361个氨基酸残基的开放阅读框。该基因编码产物理论分子量和等电点为MW = 39.66 kD,pI = 9.15,含有糖基水解酶家族17的保守结构域,N端有26个氨基酸残基组成的信号肽。Southern结果显示,GbGLU在棉花基因组中以单拷贝形式存在,研究发现,GbGLU的表达受黄萎病菌的诱导。聚类分析表明,棉花葡聚糖酶基因可分为3类,分别含有糖基水解酶家族3、9、17的保守结构域。无论棉花中的还是本研究中参考的其他作物中,受病菌诱导的葡聚糖酶基因都含有糖基水解酶家族17的保守结构域,故推断其为此类基因参与抗病反应的功能域。     

金花茶CnBCH基因cDNA全长克隆及生物信息学分析

利用CODEHOP和RACE方法,从珍稀观赏植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中克隆得到了β-胡萝卜素环羟化酶(β-carotene hydroxylase,BCH)基因的cDNA全长,命名为CnBCH。碱基序列分析结果表明,该CnBCH基因全长1 089 bp,包含58 bp的5'非翻译区(untranslated regions,UTR)、105 bp的3'UTR和927 bp编码308个氨基酸的开放阅读框。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质为不稳定亲水性蛋白,分子量为34.42 k D,无信号肽,含有4个跨膜结构域,一个脂肪酸羟化酶超家族(FA_hydroxylase super family)功能结构域以及BCH功能结构域(PLN02601);CnBCH二级结构以α-螺旋为主,其次为无规则卷曲,β-折叠所占比例最少。氨基酸序列比对分析结果显示,CnBCH与茄科、蔷薇科等植物BCH蛋白同源性都在70%以上,与柿树(Diospyros kaki T.)BCH同源性最高。本研究为进一步了解CnBCH基因的功能及其在金花茶花瓣类胡萝卜素合成中的作用提供了帮助。     

小麦STK类抗病基因同源序列的克隆与分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类催化结构域Ⅰ和Ⅷ氨基酸保守序列设计简并引物,以TcLr19、TcLr35和感病对照Thatcher的cDNA为模板进行抗病基因同源序列的PCR扩增,得到了6条通读的抗病基因同源序列(RGAs)Lr19-RGA1、Lr19-RGA2、Lr19-RGA3、Lr35-RGA1、Lr35-RGA2和TC-RGA.在NCBI中用BLASTp比对发现,Lr19-RGA1、Lr19-RGA2、Lr19-RGA3、Lr35-RGA1和Lr35-RGA2编码的氨基酸序列具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Serine-threonine kinase,STK)的催化结构域Ⅱ-Ⅷ.对序列分析还发现,它们与已克隆的STK类抗病基因有不同程度的相似性,为进一步克隆小麦抗叶锈病相关基因提供了依据.     

紫花苜蓿几丁质酶基因MsChiⅣ克隆及序列分析

本研究根据截形苜蓿(Medicago truncatula)根部的几丁质酶基因保守序列(GenBank登录号:AF167328)设计引物,通过RT-PCR直接扩增的方法得到了紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)根部几丁质酶基因保守序列.根据得到的保守序列设计3'端和5'端特异引物,分别从3'端和5'端扩增延长该片段,最后通过序列拼接获得紫花苜蓿根部一种几丁质酶基因的全长cDNA序列,命名为MsChiⅣ(GenBank登录号:FJ487629).MsChiⅣ基因全长为1 025 bp,开放性阅读框全长为849 bp,编码282个氨基酸,分子量为30.5 kD,预测等电点为4.66,其结构包括信号肽、几丁质结合区、糖苷水解酶区,为Ⅳ类几丁质酶,属于几丁质酶第19家族,在氨基酸水平上与截形苜蓿几丁质酶蛋白同源性最高,达到98%.蛋白结构分析表明该基因编码蛋白为非跨膜蛋白,存在于细胞质中.     

金花茶CnLCYE基因cDNA克隆及表达载体构建

利用RT-PCR和RACE技术,从珍稀观赏植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中克隆得到了一个番茄红素ε-环化酶(lycopeneε-cyclase,LCYE)基因c DNA全长,命名为CnLCYE。碱基序列分析显示,CnLCYE基因全长2 149 bp,包含291 bp的5'非翻译区(untranslated regions,UTR)、265 bp的3'UTR和1 593 bp编码530个氨基酸的开放阅读框。该基因编码的蛋白质含有2个跨膜结构域,一个NADB_Rossmann superfamily结构域以及番茄红素ε-环化酶结构域(PLN02697)。CnLCYE蛋白二级结构以无规则卷曲为主,其次为α-螺旋,β-折叠所占比例最少。氨基酸序列比对分析结果显示,CnLCYE与茄科、蔷薇科等植物LCYE蛋白同源性都在70%以上,与普洱茶(Camellia sinensis var.assamica)LCYE同源性最高。根据该CnLCYE全长序列设计带有KpnⅠ和Bam HⅠ位点的全长扩增引物扩增基因全长,用KpnⅠ和Bam HⅠ双酶切后与表达载体p CAMBIA1300连接,成功构建了CnLCYE基因的正义表达载体,为深入研究CnLCYE基因的功能及其对花色的调控作用提供了帮助。     

小麦抗叶锈病Lr35基因同源序列RGA1侧翼序列的扩增与分析

利用小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr35,根据已扩增出的Lr35相关基因组DNA片段RGA1设计3对特异性引物,通过热不对称交错PCR技术获得2个有效扩增片段,将目的片段回收纯化,连接到pGEM-TEasy载体,转化EcoliDH5α感受态细胞中,经EcoRⅠ酶切,验证插入片段,选择合适菌液测序。获得了2条侧翼序列,长度分别为511bp和614bp,与RGA1重叠区分别为293bp和509bp,分别向3'端和5'端延长了208bp和100bp,拼接后序列为915bp。经BLASTn同源性比较与小麦抗叶锈病基因Lr21同源性为93%(score值为674,E值为0.0),与含有Lr10基因的450Kb大片段重叠群同源性为90%(score值为260,E值为7e-66),该研究为克隆Lr35目的基因奠定了基础。     

北柴胡环阿屯醇合酶基因的全长克隆与表达分析

环阿屯醇合酶(CAS)是柴胡中植物甾醇类物质合成途径的关键酶,与柴胡皂苷合成途径的关键酶基因β-香树酯醇合酶(β-AS)竞争共同的前体物质,影响柴胡皂苷的积累。为探究柴胡中环阿屯醇合酶的作用,本研究以北柴胡cDNA为模板,克隆获得北柴胡环阿屯醇合酶基因BcCAS的全长序列,对BcCAS全长cDNA序列及其编码氨基酸序列进行了生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR (RT-PCR)方法检测该基因在北柴胡不同组织中的表达差异。结果表明:该基因全长2 314 bp (GenBank登录号:MT349674),包含2 271 bp的开放阅读框,编码756个氨基酸。预测该基因的编码蛋白含有氧化鲨烯环化酶(OSC)超基因家族的DCTAE和QW结构域,与高氏柴胡、人参、光果甘草、白桦等植物的CAS蛋白具有较高同源性。BcCAS基因在北柴胡根、茎、叶、花等组织中均有表达,在茎中表达量最高。本研究为柴胡皂苷生物合成途径的调控研究提供帮助。     

向日葵盐诱导HD-Zip类转录因子HB-12的克隆及表达分析

HB转录因子家族基因在植物生长、发育、生物和非生物胁迫中发挥着重要作用。根据已知序列Unigene551_All设计引物,利用SMARTer RACE技术从向日葵中克隆了一个HD-Zip类转录因子HB-12,该基因全长cDNA序列821 bp,包括长度为573 bp的开放阅读框,编码190个氨基酸。预测该蛋白的分子量和等电点分别为22.55 kD和5.58,具有一个同源异型框结构域(homeobox domain,HD)和一个同源异型框结合类亮氨酸拉链结构域(homeobox associated leucine zipper domain,HALZ),属于向日葵HD-ZipⅠ类蛋白,基因登录号为KU315052。HB-12蛋白不存在跨膜域,亚细胞定位预测其可能位于细胞核。聚类分析发现向日葵HB-12与茄科作物马铃薯和番茄HB-12基因亲缘关系较近。利用PCR技术扩增了HB-12全长cDNA对应的g DNA序列,该序列自起始密码子ATG至终止密码子TAA长度为652 bp,由2个外显子和1个内含子组成,基因登录号为KU315053。Real-time PCR结果表明,HB-12在向日葵根、下胚轴和叶中的表达存在器官特异性,且受盐、ABA及PEG的诱导表达。HB-12基因的克隆及表达分析为向日葵抗逆分子育种和功能研究奠定了基础。     

西红花β-胡萝卜素羟化酶CsBCH1-z基因的分离与生物信息学分析

为更好地理解西红花类胡萝卜素合成代谢途径,从西红花中分离和克隆了1 个新的β-胡萝卜素羟化酶基因CsBCH1-z,并从柱头cDNA中克隆了该基因的全长编码序列为906 bp,编码301 个氨基酸残基,对应的基因组序列为1261 bp,5 个外显子由4 个内含子子间隔开。与已知的CsBCH1 基因的氨基酸序列比较,发现在N端由于6 个碱基的缺失,造成了2 个氨基酸的缺失和1 个氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸,另外还有一处单碱基的变异造成苏氨酸突变为丙氨酸。通过预测其蛋白含有3 个明显的跨膜结构域,C端包含了2 组“HXXXXH”和“HXXHH”结构域,是典型的脂肪酸羟化酶。β-胡萝卜素羟化酶是西红花苷合成的重要前体物质,CsBCH1-z 柱头中的表达量>叶片>花瓣;雄蕊中表达很低;球茎中表达不可见。     

琯溪蜜柚果肉过氧化物酶cDNA的克隆及序列分析

以琯溪蜜柚果肉为材料,运用cDNA克隆的方法,克隆得到了琯溪蜜柚果肉过氧化物酶的cDNA的全长,并对得到的序列进行了一些分析,从分子生物学角度对粒化的研究做了初步的探索。结果表明:琯溪蜜柚果肉PODcDNA全长1263bp,有完整的阅读框,编码351个氨基酸。另外5'非翻译区42bp,3'非翻译区168bp(不包含终止密码子TAA),其中包括一个多聚腺苷酸化信号AATAAA,以及一个含24个腺苷酸的poly(A)尾。由琯溪蜜柚果肉PODcDNA推导的氨基酸序列与无花果(Fi-cuscarica)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、杨属植物(Populus)等同源性较高,分别为:58.6%,67.61%,65.24%,67.14%等。     

柽柳MnSOD基因的克隆及功能验证

根据已克隆得到的柽柳MnSOD基因片段,采用RACE技术从柽柳中获得MnSOD的cDNA全长序列.该基因全长为1 087 bp.其中,5'非编码区40 bp,3'非编码区333 bp,开放读码框(ORF)长699 bp,编码232个氨基酸.分子量为26 KD,等电点为7.10.该MnSOD氨基酸序列与拟南芥MnSOD序列同源性最高为83%,从12个物种的序列比对可以看出MnSOD氨基酸序列保守性较高.该序列的Genbank注册号为AY573576(基因)和AAS77885(蛋白).将MnSOD基因与酵母表达载体pYES2连接,并进一步转化到酵母基因组中.对重组酵母INVSc1(pYES2-SOD)和对照INVSc1 (pYES2)进行干旱、高温胁迫实验.结果表明:重组酵母的抗干旱、高温能力明显高于对照,证实了来源于柽柳的MnSOD基因具有抗干旱和耐高温能力.     

陆地棉GhCYP1基因的分离及其表达分析

应用SSH-PCR技术,在筛选到抗旱相关基因的EST序列基础上,采用RACE技术,分离克隆到全长为801bp,含编码序列(CDS)为522 bp的棉花抗旱相关基因GhCYP1.氨基酸序列比对发现,该基因与拟南芥、水稻、人等的亲环蛋白基因高度同源,都具有由11个连续氨基酸所组成的单结构域亲环蛋白典型结构,且在保守区都具有...     

棉花GhMGL11基因的克隆和表达分析

为研究陆地棉甲硫氨酸裂解酶(Methionineγ-lyase)基因的结构与功能,本研究以陆地棉中9807叶片为试验材料克隆得到棉花甲硫氨酸裂解酶(Methionineγ-lyase)基因c DNA全长,命名为GhMGL11(Cottongen:Gh_A12G2168)。蛋白序列分析该基因的编码区序列全长1 359 bp,编码452氨基酸;GhMGL11蛋白属于亲水性蛋白,预测含有41个磷酸化位点;亚细胞定位显示位于细胞质,无信号肽。序列比对分析,该基因含有Cys_Met_Meta_PP家族特有的保守结构域Cys_Met_Meta_PP,属于PLP(Pyridoxal phosphate)依赖性氨基转移酶中的一种。系统进化分析,陆地棉GhMGL11蛋白与可可(Theobroma cacao)亲缘关系较近。在陆地棉中发现23个与GhMGL11基因同源的含有Cys_Met_Meta_PP结构域的基因。组织特异性分析,GhMGL11基因在棉花根、茎、叶中均有表达,其中在根中的表达量最高;碱胁迫处理后不同时间内,该基因的表达量先升高后降低,说明该基因表达受碱胁迫影响。     

棉花S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因的克隆及低温下的表达分析

根据棉花S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase, SAMDC)基因已知EST序列设计引物,采用RACE和RT-PCR技术克隆获得该基因的全长cDNA序列,命名为GhSAMDC (GenBank登录号为JN020148)。生物信息学分析表明,GhSAMDCcDNA序列全长1 874 bp,涵盖tiny ORF (tORF)、upstream ORF (uORF)和main ORF (mORF) 3个植物SAMDC基因特征ORF。其中mORF长1 064 bp,编码含355个氨基酸残基的SAMDC酶原,预测分子量为38.25 kD,该酶原含有高度保守的酶原剪切位点结构域(LSESSLF)和与SAMDC蛋白快速降解有关的PEST (TIHVTPEDGFSYAS)结构域。GhSAMDC基因组DNA序列全长2 743 bp,包含3个内含子,均位于5'' UTR,其中一个位于uORF内。聚类分析表明,GhSAMDC与葡萄中该蛋白的同源关系最近,并且与其他双子叶植物聚为一类。荧光定量PCR分析结果表明,GhSAMDC表达受低温诱导,在冷敏感品种新陆早1号中基因表达水平明显高于在耐冷品种新陆早33号中。     

割手密过氧化氢酶基因（Ss CA T-1）的克隆与比较分析

割手密是栽培种甘蔗最重要的近缘物种之一,具有较强的抗逆性。本研究以高粱过氧化氢酶基因(NCBI登录号为XM002437586.1) cDNA序列为探针,对甘蔗EST数据库进行同源检索、筛选和拼接,后经基因组PCR、分子克隆、序列分析验证成功分离了2个割手密过氧化氢酶基因cDNA序列(Ss CA T-1c和Ss CA T-1d, GeneBank登录号为KF864229和KF864230)。2条序列全长均为1532 bp,包含10 bp的5'非翻译区(UTR)和43 bp的3'UTR,以及一个1479 bp的开放读码框,编码492个氨基酸,此蛋白序列具有过氧化氢酶保守结构域,属于CAT家族。2条序列之间相似性为99.2%,存在12个单核苷酸多态性(SNP)位点,蛋白相似性99.0%,存在5个氨基酸变异位点。将推测的SsCAT-1c和SsCAT-1d蛋白序列与高粱、水稻、玉米等物种进行同源进化分析,均表现出极高的保守性。研究结果能对今后深入了解甘蔗及其近缘材料CAT基因家族的信息提供帮助,从而为进一步通过生物技术改良甘蔗品种抗逆性提供理论依据。