里氏木霉木聚糖酶的分离纯化及其性质

使用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-25凝胶色谱脱盐、DEAE-Sephadex A-50和SP-SephadexC-50离子交换色谱等分离纯化技术，从里氏木霉（Trichoderma reesei）RutC-30培养液中分离出木聚糖酶组分，再经SephadexG-100凝胶过滤色谱进一步分离纯化，得到2个纯木聚糖酶组分A组和组分B。经SDS-PAGE鉴定两组分为单带，相对分子质量分别为20300和13500。组分A的最适反应条件为45℃、pH3.0-5.5很稳定，酶解产物主要是低聚木糖，只含少量木糖；组分B的最适反应条件为55℃、pH5.5，酶解产物全部是低聚木糖。     

表面活性剂和促进剂对重组里氏木霉生物合成t-PA的影响

重组里氏木霉(Trichoderma reesei)是染色体上整合有组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)cDNA的基因工程菌株.对高产t-PA的重组里氏木霉菌株进行了筛选,并研究了乙酸钠和抗坏血酸(Vc)等促进剂及曲拉通(Triton100)、吐温80(Tween80)、十二烷基磺酸钠(SDS)和蔗糖酯等表面活性剂对菌株生物合成t-PA的影响.结果表明:乙酸钠能促进t-PA的生物合成,在发酵培养基中,其浓度为0.1%时,酶活可提高36.42%;吐温80对t-PA的合成有促进作用,其浓度为0.1%时,酶活可提高82.04%;抗坏血酸也可促进t-PA的合成,其浓度为0.05%时,酶活可提高124.82%;曲拉通和十二烷基磺酸钠加入时完全抑制t-PA的合成;蔗糖酯对t-PA的合成有部分抑制作用.     

里氏木霉DWC1纤维素酶的研究

实验对纤维素酶高产菌株里氏木霉ＤＷＣ１的最佳产酶条件进行了研究。且分析了菌株在不同的营养及培养条件下的产酶情况。ＤＷＣ１菌株的最佳液体培养条件如下：温度（２５～２９）℃，初始ｐＨ５．０，发酵时间（５～７）ｄ。在此培养条件下菌株的ＣＭＣ酶活及滤纸酶活可分别达到４８３．３ｍｇ／（ｍｌ·３０ｍｉｎ）和１３６．７ｍｇ／（ｍｌ·ｈ）。     

固定化里氏木霉制备纤维素酶的研究

采用多孔塑料吸附固定里氏木霉（Trichoderma reesei RutC30)菌丝细胞，以硫酸盐纸浆为底物，重复分批发酵生产纤维素酶，滤纸酶活力可达2.4IU.mL^-1，纤维二糖酶活力为0.2IU.mL^-1，分别是游离细胞发酵的1.6倍和2.2倍，固定化菌丝细胞性状稳定，连续使用40d以上，未见酶活力下降，酶解试验表明，固定化细胞生产的酶液对木质纤维原料具有很高的降解效率，当每克底物的酶用量在滤纸酶活力20IU以上时，酶解得率可达90%以上。     

里氏木霉诱导合成木聚糖酶的调控

提出了两种不同用途的木聚糖酶的诱导合成方法。以里氏木霉为产酶菌,经适当处理后的玉米芯可诱导产生含纤维素酶（３．４ＩＵ／ｍＬ）的高活力木聚糖酶（５４．４ＩＵ／ｍＬ）。以混有少量纤维素的粗木聚糖作碳源,通过分批补料及对培养条件的限制性控制里氏木霉可选择性合成木聚糖酶;选择性合成程度与碳源浓度有关,当碳源浓度为１０ｇ／Ｌ时木聚糖酶和纤维素酶活力分别为３５．５ＩＵ／ｍＬ、０．２Ｕ／ｍＬ,两种酶活的比值达１７７．５。     

影响固定化里氏木霉合成纤维素酶的动力学因素

对影响固定化里氏木霉细胞合成纤维素酶的主要动力学进行了研究。以纸浆为主要碳源，采用固定化细胞，在２５０ｍＬ摇瓶中重复分批发酵，结果表明，在一批加料条件下，适宜于固定化细胞产酶的条件是：纸浆浓度１．５％～２．０％，Ｃ／Ｎ为８，培养液的初始ｐＨ值４．０摇瓶转速２００ｒ／ｍｉｎ及２６℃。分批添加纸浆可以减少固体底物对氧气输送和物质扩散等方面造成的不良影响，有利于增加底物的总用量，从而促进纤维素酶的合成，     

里氏木霉制备木聚糖酶的产酶历程

以玉米芯木聚糖为原料,里氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｓｅｉ）ＲｕｔＣ３０为菌种,采用改进的Ｍａｎｄｅｌｓ配方制备木聚糖酶,产酶历程与制备纤维素酶时有较大差异。具体表现在产酶周期短,ｐＨ值基本无下降的趋势,酶液中可溶性蛋白质浓度较低。底物浓度为７ｇ／Ｌ时,木聚糖酶活力达１２５６ＩＵ／ｍＬ,比活力、酶得率及酶产率分别为８１９０ＩＵ／ｍｇ蛋白质、１７９４３ＩＵ／ｇ木聚糖和４１８６．７ＩＵ／Ｌ·ｄ。产酶最终ｐＨ应控制在６～７较为适宜,酶活力最高。ｐＨ超过７．０,酶可能失活。酶解结果表明,木聚糖酶对木聚糖干粉具有很高的降解效率,当每克底物的酶用量为０．１克木聚糖干粉产的酶液量时,酶解得率一般可达９０％左右。     

里氏木霉产酶菌株的选育研究

采用紫外线和亚硝酸联合诱变技术,得到产纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶的高产的菌株里氏木霉Y07.试验表明,诱变后菌株的木聚糖酶活由325 U/g,提高到28 500 U/g,相对于出发菌株提高了88倍;纤维素酶活由560 U/g,提高到2600 U/g,相对于出发菌株提高了4.6倍;β-葡聚糖酶活由480 U/g,提高到5500 U/g,相对于出发菌株提高了11.5倍.     

里氏木霉液体发酵选择性合成果胶酶

在摇瓶液体发酵的条件下研究了碳源、氮源、酵母汁和营养盐等因素对里氏木霉选择性合成果胶酶的影响规律,并测定了酶学性质。结果表明:从经济角度考虑宜选用脱汁橘皮粉制备果胶酶;在Mandels营养盐中添加1.0 g/L蛋白胨适合于里氏木霉产果胶酶;以25 g/L脱汁橘皮粉液体发酵48 h,果胶酶活力最高值达到32.6μmol/(min.mL),其中纤维素酶和木聚糖酶的活力被分别控制在0.18、0.63μmol/(min.mL)。该果胶酶的最适pH为6.0,最适温度为50℃,以16μmol/(min.g)的果胶酶振荡水解10 g/L商品果胶粉50 h,酶解得率达80.3%。高效液相离子色谱的分析结果显示果胶酶的主要水解产物为单体半乳糖醛酸,含量达总水解产物的82.5%以上。     

里氏木霉和酵母菌混合发酵玉米秸杆的研究

对里氏木霉和酵母菌混合发酵秸杆提高其粗蛋白含量的发酵工艺进行了研究。结果表明其发酵最优工艺条件 :以尿素作为氮源 ,里氏木霉接种 2 4 h后接种假丝酵母 ,接种量比例为 1∶ 4 (酵母∶里氏木霉 ) ,于 p H3.0 ,30℃下培养 4 d。粗蛋白含量可达 30 .5 5 % ,粗纤维转化率可达 33.5 %。     

碳源及氮源Trichoderma reesei306对组织型纤溶酶原激活剂生物合成的影响

本文对不同种类的碳．氮源对Trichoderma reesei306组组织型纤溶酶原激活剂(t—PA)生物合成的影响进行了研究。结果表明：在所试的各种碳氮源中，碳源以玉米粉和纤维素，氮源以尿素和胰蛋白胨效果最好，通过正交试验确定了液体发酵培养基中碳氮源的最佳组成为：玉米粉20g／l、纤维素30g／l、尿素10g／l、胰蛋白胨2g／l，优化碳氮源后t—PA酶活提高了26％。     

初始pH对合成木聚糖酶和纤维素酶的影响

以里氏木霉（Trichoderma reesei)Rut C-30为产酶菌，研究了不同初始pH值对木聚糖酶和纤维素酶合成的影响。结果表明，初始pH较低有利于纤维素酶的合成，初始pH值高则延长了产木聚糖酶的时间，且强烈抑制纤维素酶的合成，致使木聚糖酶活与纤维素酶活的比值提高，从而有利于选择性合成木聚糖酶。初始pH值分别为４．０、４．４、４．８、５．４、６．０时，培养72h，木聚糖酶活与纤维素酶活的比值分别为259、327、425、865、1016。随着初始pH值的增加，里氏木霉对培养液中还原糖的消耗能力在降低，初始pH值在4．0－4．8范围内，培养48h时还原糖浓度到最低，并且维持在低浓度的水平上。当初始pH值在5．4－6．5范围内，培养72h时还原糖浓度才达到最低，并且培养液中还原糖浓度较高，初始pH值提高到6．5时，培养液中还原糖浓度维持在较高水平上，抑制了木聚糖酶和纤维素酶的合成。     

里氏木霉HC-415菌液体发酵产纤维素酶时形态学变化研究

在30L发酵罐中研究里氏木霉HC-415菌液体发酵产纤维素酶菌体形态学变化时,发现该菌的形态变化可分为4个时期;第Ⅰ期为接种后的0～24h,菌体形态主要呈丝状伸长,较少分枝,产酶基本处于停滞期;第Ⅱ期为24～60h,菌丝体不断伸长,分枝增多,菌体变粗,酶活性增长明显;第Ⅲ期在60～132h,此期菌丝体变粗变短,并出现横隔,分枝顶部生出许多膨大的圆形结节,该期为纤维素酶活力的快速增长期和高峰稳定期;第Ⅳ期为132h后,期间菌丝体呈粗短圆状,仍有许多膨大的结节,但菌体数量逐渐变少,酶活性开始逐步下降.结果表明:里氏木霉液体发酵产纤维素酶时菌体形态与发酵液中的酶活性变化密切相关,形态学特征可作为实际生产中快速调控发酵液成熟度的重要指标。     

液态混合菌发酵优化纤维素酶组分

在里氏木霉和黑曲霉液态混合条件下培养纤维素酶,分析两个菌种的接种比和延迟黑曲霉的接种时间对产酶的影响,探讨两个菌种发挥协同作用的最佳条件。结果表明:黑曲霉延迟接种48 h及里氏木霉与黑曲霉接种质量比1∶1时,所产纤维素酶的滤纸酶活为1.163μmol/(min.mL);β-葡萄糖苷酶活为0.606μmol/(min.mL),β-葡萄糖苷酶活与滤纸酶活比值为0.521,比单一里氏木霉产纤维素酶的酶活高,并在后续的酶解效果对比中表现最佳。48 h时的酶解得率为65.61%,高于里氏木霉单一培养时所产纤维素酶的得率53.91%和商品纤维素酶的得率49.64%。说明通过混合发酵,纤维素酶的组分得到了优化。     

瑞氏木霉木聚糖酶Ⅱ启动子功能区缺失分析的初探

木聚糖酶Ⅱ(Xylanase Ⅱ)是瑞氏木霉中两种主要的内切木聚糖酶之一．序列分析显示其1．1kh的启动子区含有多种丝状真菌转录因子结合位点，可受多种激活因子、抑制因子、增强子的转录调控．以编码β-葡糖苷酸酶(GUS)的E．coli uidA基因为报告基因，分别与木聚糖酶Ⅱ启动子及功能区(-312～-1080)缺失启动子融合，构建报告质粒pXIIPU与pXIIP△EXU，引入瑞氏木霉蛋白酶缺陷株Trichoderma reesei RutC30U4．先后对转化子进行发酵实验，测定GUS活性。结果显示功能区-312～-1080缺失后的启动子活性是原启动子活性的19％．结果表明在缺失的木聚糖酶Ⅱ启动子-312～-1080区仍存在调节转录活性的顺式作用元件，值得进一步研究．     

连续棒状疏水色谱柱对蜗牛酶的分离

通过原位聚合制备了一种以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂的连续棒状疏水色谱柱,并对蜗牛酶进行了分离.考察了致孔剂及单体对柱体疏水性及蜗牛酶分离效果的影响.     

利用里氏木霉生物转化制备黄姜薯蓣皂甙元的清洁新工艺

基于清洁生产和资源综合利用的理念, 提出一种从盾叶薯蓣根茎中提取薯蓣皂甙元的新工艺。该工艺由两部分组成, 第一部分利用淀粉酶和糖化酶分离黄姜根茎中的淀粉, 第二部分利用里氏木霉转化糖渣 中的皂苷制备薯蓣皂甙元。研究表明, 与直接酸水解相比, 新工艺可以提取约 98.7%薯蓣皂甙元, 并以还原糖 的形式回收98. 0% 淀粉, 降低生产废水中 99. 4%COD, 100% SO^2-₄ 和100% 酸。在酸水解废水中检测到24 种有机物, 其中邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸-2-乙基己酯属于美国环保局优先控制污染物。而新工艺废水中仅检测到两种有机物(17β-羟基雄甾-5-烯-3-酮和邻苯二甲酸二异丁酯) 。本研究为皂素清洁生产提供了一种新方法。