重组猪α干扰素的酵母表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用

利用自动发酵罐高效分泌表达rPoIFN-α,经硫酸铵沉淀、Q Sepharose FF阴离子交换层析和Superdex200分子筛层析纯化重组猪α干扰素,用纯化的rPoIFN-α进行PRV体外抑制试验.结果表明:随着表达时间的延长,发酵表达液中rPoIFN-α含量增高,其中72h表达液中rPoIFN-α的含量可达0.52μg/μL,约占总蛋白量的57.50%,活性为1.00×106 U/μL.rPoIFN-α提纯液的浓度为7.02μg/μL,纯度为98.1%,活性高达1.00×109U/μL.纯化rPoIFN-α的PRV抑制作用和感染阻断作用的比活均为1.42×105 U/μg,对PRV增殖抑制作用的比活为1.42×103 U/μg.表明发酵表达的rPoIFN-α对伪狂犬病毒病具有良好的抑制活性,为进一步开展重组猪α干扰素临床试验提供依据.     

鸡重组α干扰素与鸡重组γ干扰素抗新城疫病毒活性研究

将鸡IFN-α和IFN-γ原核表达产物经Ni2＋-NTA亲和层析法纯化,进行SDS-PAGE分析,再将纯化并已测定浓度的鸡重组IFN-α和IFN-γ稀释到1/10倍;用细胞病变抑制法检测重组表达蛋白的抗新城疫病毒活性,并利用感染病毒的鸡胚来测定鸡重组表达蛋白的抗病毒活性。结果显示,SDS-PAGE可检测到相对分子质量为25kU左右的蛋白条带,纯化的鸡IFN-α和IFN-γ抗新城疫病毒复制的活性分别为4.32×103 U/mg和2.65×103 U/mg;当鸡IFN-α和IFN-γ的比例为125∶1时,其联合抗新城疫病毒复制的活性最佳。抗鸡胚感染病毒活性的测定结果表明,与病毒对照组相比,IFN-α和IFN-γ及IFN-α和γ联合组,HA滴度都有明显的降低;并且从鸡胚的平均死亡时间上,联合干扰素对新城疫病毒的抑制作用更强于单个干扰素的应用。这证明了鸡IFN-α、IFN-γ及其联合干扰素对新城疫病毒的复制有明显的抑制作用。     

重组鸡α-干扰素对鸡免疫功能的影响

选取80只10日龄的肉仔鸡,随机分成4组,每组20只.第1组为对照组,第2～4组为试验组,分别肌注0.1倍剂量(1000U)、1倍剂量(1万U)和10倍剂量(10万U)的鸡α-干扰素.试验期间并对其免疫器官指数、淋巴细胞转化率、白介素-2含量、血清补体总活性进行测定.结果表明:1倍剂量(1万U)组鸡的免疫器官指数、淋巴细胞转化率、白介素-2含量、血清补体总活性均高于其他三组.     

猪α干扰素在毕赤酵母中的分泌表达

利用PCR技术从长白猪全血基因组DNA中扩增出猪α干扰素的成熟肽(mPoIFN-α)基因,并将其亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母(Pichia pastoris)-大肠杆菌(Escherichia coli)穿梭质粒pPIC9K载体中,构建分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFN-α。将SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFN-α电转化毕赤酵母GS115株(组氨酸缺陷型),使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组。转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以G418抗性梯度法筛选多拷贝重组子。该多拷贝菌株经1%甲醇诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明,猪α干扰素在毕赤酵母中成功地获得了分泌表达,并具有免疫活性,表达产物约为19kD,这为进一步研究猪α干扰素的功能奠定了基础。     

重组猪α干扰素的亲和层析

真核系统表达的猪α干扰素(PoIFN-α)发酵液,经离心、收集上清液、透析过滤处理,通过FPLC-HisTrap HP Kit亲和层析系统分离纯化,最后以SDS-PAGE银染法检验。结果表明,在不同pH和NaCl浓度情况下,发酵液经亲和层析系统分离纯化后均可以得到较为单一的目的蛋白组分,而在pH8.2,NaCl0mmol/L的情况下得到的目的蛋白更纯,且非特异性吸附也较少。     

鸡α干扰素在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒功能初探

为了研究鸡α干扰素(ChIFNα)基因的特性和功能,将鸡α干扰素的DNA序列克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达载体pPIC9K中,并转化入巴斯德毕赤酵母GS115菌株,用PCR技术鉴定阳性转化子。重组菌株GS115/pPIC9K-IFNα用1%甲醇诱导后,分泌表达重组蛋白,斑点杂交(dot-blot)检测IFNα具有免疫原性。细胞病变抑制法表明,表达产物有明显的抗鸡H9N2亚型禽流感病毒活性。     

鸡α-干扰素成熟肽的原核表达及其多价血清的制备

以PCR方法从活化的鸡外周血淋巴细胞中扩增鸡α-干扰素的成熟肽基因序列,构建原核表达质粒pET32a-α和pGEX6p-α;SDS-PAGE及Western blotting法检测两载体特异性表达成熟肽;将纯化的pET32a-α诱导表达产物免疫小鼠,收获小鼠血清并以pGEX6p-α诱导表达产物检测其中特异性抗体滴度。结果表明:扩增的鸡α-干扰素成熟肽基因成功表达,原核表达产物免疫小鼠可产生特异性抗体,抗体效价为1∶12 000。其结果为制备安全、高效的重组干扰素奠定了基础,为定量检测机体内产生的α干扰素进而了解机体免疫状态提供较为可靠的技术手段。     

多等温加速试验预测重组鸡α干扰素的稳定性

在3种温度下对大肠杆菌表达重组鸡α干扰素进行了多等温加速稳定性试验和2℃保存的稳定性考察,预测重组鸡α干扰素的稳定性,为制品有效期的确定提供依据。采用多等温加速试验,将制品放在3种不同温度下孵放,定期取出样品,测定效价,根据制品的效价下降情况推算其在有效期内的稳定性。结果显示:用加速降解有关公式可以求出在2℃存放1年后的残余效价为226 492 682单位,下降率为9.9%,与实测值228 000 957单位基本吻合;2年后的残余效价为203 868 551单位,下降率为18.9%。即2℃保存2年后效价保持在80%以上,推算的结果与试验值较吻合,产品稳定性良好。     

表达MDV gB基因的重组鸡痘病毒的免疫效果研究

将马立克氏病病毒 (MDV)gB基因插入鸡痘病毒 (FPV)中 ,构建了含有MDVgB基因的重组鸡痘病毒 (rFPV)。用rFPV、HVT冻干苗、rFPV +HVT疫苗分别免疫 1日龄AA肉用雏鸡 ,于 8日龄攻毒后观察疫苗免疫效果。实验结果表明 ,HVT、rFPV、HVT +rFPV疫苗免疫组比攻毒对照组病毒血症持续时间短 ;上述 3种疫苗免疫后用京 1株MDV(vMDV)攻毒 ,脾脏T淋巴细胞增殖反应处于较高水平 ,而攻毒对照组脾脏T淋巴细胞增殖反应减弱 ,两者差异显著(P <0 0 5 ) ;用HVT +rFPV二价疫苗免疫雏鸡 ,其抵抗vMDV攻击的免疫保护力高于HVT和rFPV单价苗 ,HVT +rFPV、rFPV、HVT免疫保护指数分别为 81 7% ,6 3 4 %和 6 4 1%。以上结果表明 ,表达MDVgB基因的重组鸡痘病毒疫苗在一定程度上能保护鸡体抵抗vMDV的攻击 ,并且HVT和rFPV具有免疫协同作用。     

猪α干扰素在毕赤酵母中的高效表达和纯化

为了研制新型的猪用抗病毒制剂,开展了猪α干扰素（PoIFNα）在毕赤酵母中的表达和产物纯化研究。将PCR扩增的PoIFNα基因插入pPIC9k的SnaBⅠ和EcoRⅠ位点,构建了表达转移载体pPIC9k/PoIFNα;经酶切和测序鉴定,转移载体构建正确。pPIC9k/PoIFNα以限制性内切酶SalⅠ线性化后电转化毕赤酵母GS115菌株,经抗性筛选获得4拷贝PoIFNα基因的重组菌株GS115/PoIFNα;重组菌株经BMMY培养基诱导后上清中有目的蛋白,表达量达136 mg/L。表达产物经过SP-Sepharose 阳离子交换层析,可以得到纯度较高的rPoIFNα,纯化产物在MDBK细胞上抑制VSV的活性高达2.27×108 U/mg。     

重组猪α干扰素急性毒性研究

［目的］研究小白鼠体内重组猪α干扰素急性毒性反应,为临床安全用药提供依据。［方法］依据急性毒性实验原则,将小白鼠分为2大组：腹腔注射组和肌肉注射组,每组又分高、中、低3个剂量组,同时设正常对照组。给药后14 d内连续观察小鼠行为活动等指标和毒性反应程度,取血作血液学检查和生化检查,以获得重组猪α干扰素初步毒性资料,并在实验结束时处死小白鼠进行剖检。［结果］各组小鼠外部表现及行为特征均正常,体温和体重的变化也在正常范围之内,内脏病理解剖无器官病变情况,血液、生化指标与正常对照组无明显差异。［结论］该实验设定的猪α干扰素最高剂量（5.0×10^5 IU/只）及其以下剂量,均对小白鼠无明显毒性作用,在临床上应用重组猪α干扰素是安全的。     

犬α1干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒活性研究

亚克隆犬α1干扰素(CaIFN-α1)成熟蛋白编码基因并克隆到表达载体pPICZα-A,构建转移重组载体pPICZα-A-CaIFN-α。pPICZα-A-CaIFN-α经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,实现了CaIFN-α1在毕赤酵母系统中的分泌表达。SDS-PAGE检测结果表明表达产物相对分子质量约为2.7×104,比其推导结果(约1.9×104)大,推测可能是发生了糖基化。酵母分泌表达的CaIFN-α1具有较高的抗病毒活性,约为1.45×106U·mL-1,蛋白含量约为96mg·L-1,比活性为1.49×107U·mg-1。重组CaIFN-α1的生物学活性具有较强的种属特异性,在犬肾细胞(MDCK)上具有很高的抗病毒活性,在鸡胚成纤维细胞上活性较低,而在猫肾细胞(F81)和牛肾细胞(MDBK)上几乎没有抗病毒活性。进一步研究发现,重组犬α1干扰素对犬瘟热病毒和伪狂犬病毒在犬肾细胞中的增殖具有显著抑制作用。     

鸡γ-干扰素的可溶性表达及纯化产物的抗NDV活性

将鸡γ-干扰素(chIFN-γ)基因先克隆,接着通过大肠杆菌表达后进行产物纯化与活性检测.通过PCR方法以带有信号肽的重组质粒PMD-18T-preIFN-γ为模板,扩增无信号肤chIFN-γ基因片段,克隆至原核表达载体pProEXTM HTa,构建重组表达质粒pProEXTM HTa-chIFN-γ,在大肠杆菌BL2...     

鸡α-干扰素抗传染性法氏囊炎感染试验研究

选取90只28日龄SPF鸡,随机分为6组,每组15只,分别为干扰素预防组、卵黄抗体组、干扰素与卵黄抗体联合使用高剂量组、干扰素与卵黄抗体联合使用低剂量组、攻毒对照组以及健康对照组。结果表明,当鸡α-干扰素与法氏囊卵黄抗体联合应用时,无论是高剂量还是低剂量,均能产生很好的保护作用。推荐在单独使用鸡α-干扰素抗鸡传染性法氏囊炎病毒感染时可使用1万U/羽的剂量,在与法氏囊卵黄抗体联合应用时,可采用0.5万U鸡α-干扰素+适量法氏囊卵黄抗体,分点进行肌肉注射给药,每日1次,连用3次。     

重组鸭α-干扰素基因工程菌表达条件的研究

为了确定重组鸭α-干扰素(DuIFN-α)基因工程菌BL21(DE3)/pET32a+-DuIFN-α的最佳表达条件,对影响原核表达的主要因素:IPTG浓度、诱导时期、收获时间、培养诱导温度、葡萄糖浓度及培养基进行了优化;并利用抗性筛选对表达质粒的稳定性进行了研究。结果显示,诱导基因工程菌BL21(DE3)/pET32a+-DuIFN-α表达DuIFN-α的最佳条件为:以TB+5 g/L葡萄糖培养基37℃培养至菌体OD600=0.8~1.1时,加入IPTG至终浓度0.2 mmol/L,30℃诱导培养4~5 h。在最佳表达条件下,DuIFN-α的相对含量为34.1%,总含量(终菌体浓度×相对含量)达79.9;各种优化条件对表达质粒的稳定性未见明显影响。     

猪α干扰素重组腺病毒的构建与鉴定

猪的病毒性疾病种类多且危害大,因此研发具有广谱抗病毒作用的猪α干扰素制剂具有重大意义.为了研制重组猪干扰素类制剂防制猪病毒性传染病,构建了携带猪IFN-α基因的重组腺病毒.应用PCR方法从猪肝组织基因组中扩增得到猪IFN-α基因后,直接克隆入腺病毒载体穿梭质粒中,构建出腺病毒重组穿梭质粒pAd-CMV-IFN-α,经Pme Ⅰ线性化后转化BJ5183感受态细胞,获得同源重组腺病毒质粒,Pac Ⅰ酶切后回收,脂质体介导下转染AD-293细胞,PCR检测表明成功构建了携带猪IFN-α基因的复制缺陷性重组腺病毒.     

重组猪干扰素α的纯化工艺研究

[目的]研究重组猪干扰素α的纯化工艺,为进一步研究该蛋白的分子结构及rPoIFN-α标准品的制备奠定基础。[方法]将含重组菌E.coliBL21诱导表达后得到的粗制rPoIFN-α,分别用2种方案进行纯化。方案1,依次用GST亲和层析法、DEAE阴离子交换法及分子筛法层析三步法进行纯化;方案2,依次用GST亲和层析和分子筛法层析两步法进行纯化。纯化结果用SDS-PAGE及Western-blot进行纯度检测及鉴定。[结果]诱导表达后的表达产物经SDS-PAGE检测,发现在45Kd分子量处有目的条带,Western-blot检测有特异性条带。通过两步法纯化后的rPoIFN-α纯度达96%,蛋白得率为42.8%,三步纯化纯度为98.8%。[结论]两步法得到的蛋白纯度非常接近三步法,但与三步法相比工艺更为简单方便。     

重组犬α干扰素急性毒性试验研究

为观察小鼠体内重组犬α干扰素急性毒性反应,进行重组犬α干扰素临床安全用药试验。结果表明:在连续观察14 d内,各组小鼠外部表现及行为特征均正常,体温和体重的变化也在正常范围之内,内脏病理解剖无器官病变情况,血液生化指标检查;注射1.0×106IU/只雌性小鼠ALT为(85.2±5.2)U/L,较正常对照组高,其他各组生化指标与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。可见,该试验设定的最高剂量1.0×106IU/只及其以下剂量对小白鼠均无明显毒性作用,在临床上应用该重组犬α干扰素是安全的。     

重组鸡α干扰素对雏鸡试验性贝氏隐孢子虫病的治疗效果

为探讨重组鸡α干扰素(IFN-α)对雏鸡贝氏隐孢子虫病的治疗作用,选用3日龄罗曼公雏,每只经口1次接种1×105个贝氏隐孢子虫卵囊,同时对不同组别雏鸡分别肌内注射500,1 000,2 000,4 000 IU·只-1的重组鸡IFN-α进行防治.结果表明,不同剂量重组鸡IFN-α均可减轻雏鸡贝氏隐孢子虫病的临床症状,减...