醛缩酶B基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的 构建含ALDOB基因的重组PCMV5质粒并进行鉴定.方法 以人HEPG2细胞RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出ALDOB基因.将PCR产物克隆进真核载体PCMV5内,构建含ALDOB基因的重组真核表达质粒.重组质粒转染293T细胞,用免疫荧光和Western blot等方法检测ALDOB在293T细胞中的表达.结果 核酸序列分析的结果表明,克隆的ALDOB基因与GenBank中已登记ALDOB基因序列 100%同源.免疫荧光结果显示,ALDOB蛋白在细胞质表达;Western blot结果显示,在约40KD位置有目的 条带,与预期的重组ALDOB 蛋白大小一致.结论 成功构建了含ALDOB基因的真核表达质粒.     

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建弓形虫微线体蛋白MIC3的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白功能奠定基础。方法PCR扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3．0,并转入DH5ct宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切和PCR扩增方法对重组质粒进行鉴定。结果重组质粒PCDNA—MIC3经单双酶切及PCR扩增都得到以原插入片段MIC3基因1120bp大小相同的片段。结论成功构建弓形虫MIC3基因真核表达质粒PCDNA—MIC3．     

ADAM9基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人源性去整合素金属蛋白酶9(ADAM9)基因真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞).方法:利用包含ADAM9全长编码核酸序列的质粒PCR4-TOPO作为模板,用PCR扩增其核心编码区,将其克隆至PMD18-T Vector中构建PMD18-T-ADAM9质粒,同时双酶切PMD18-T-ADAM9及P...     

IL-27亚基基因真核表达质粒的构建与表达

目的 克隆人白细胞介素27(interleukin 27,IL-27)蛋白亚基EB病毒诱导的基因3(Epstein-Barr vi-rus-induced gene 3,EBI3)与p28基因的cDNA,分别构建其真核表达质粒并在COS-7细胞表达.方法 人外周血单核细胞诱导为成熟树突状细胞后提取细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增EBl3与p28基因cDNA,酶切后插入pcDNA-3.1构建真核表达载体pcDNA-EBI3与pcDNA-p28.重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR检测目的 基因表达.结果 成功构建克隆人IL-27蛋白亚基真核表达质粒,重组质粒分别转染COS-7细胞后检测到相应基因表达.结论 人IL-27蛋白亚基基因克隆及真核表达质粒的成功构建,为构建表达有生物学活性的重组人单链IL-27蛋白奠定基础.     

重组真核表达质粒pHsp70-hsv-tk的构建及在细胞内的热诱导表达

目的:构建用于靶向基因治疗的重组真核表达质粒pHsp70-hsv-tk(pHT),体外转染SMMC-7721肝癌细胞,观察热诱导基因表达情况. 方法:设计1对引物,以pHSV-106质粒为模板进行PCR扩增,将扩增产物纯化所得目的基因片段与pD3SX载体连接,转化大肠杆菌E.coli DH5α,克隆PCR法筛选菌落,测序鉴定后大量抽提质粒.磁性转染法将pHT导入SMMC-7721,加热处理后,用RT-PCR法检测tk基因的整合. 结果:获得重组的hsv-tk基因条带. 结论:成功构建了pHT质粒,可用于进行靶向性基因治疗研究.     

人Fn14基因真核重组质粒的构建及其表达

目的构建人成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14（fibroblast growth factor—inducible 14，Fn14）基因真核重组质粒及其表达。方法从人肝细胞癌组织抽取总RNA，RT—PCR扩增出Fn14基因全长cDNA，经测序正确后，核酸内切酶EcoR I、Xba I酶切PCR产物，亚克隆人pcDNA3．1-Myc载体，重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经酶切及测序鉴定正确后转染COS-7细胞，通过免疫组织化学DAB法检测Myc—Fn14融合蛋白的表达。结果重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经EcoR I、Xba I酶切及测序鉴定正确，重组质粒包含人Fn14基因完整编码区。免疫组织化学检测结果显示，重组质粒转染COS-7细胞后成功表达Myc—Fn14融合蛋白，转染空载体pcD—NA3．1-Myc的COS-7细胞未见Myc—Fn14融合蛋白表达。结论构建了人Fn14基因真核表达载体，该重组质粒可表达含Myc-Fn14的融合蛋白，为研究Fn14功能奠定了基础。     

Rap2c基因真核表达质粒的构建与表达

目的：为了探讨Rap2c基因与肺癌发生的关系,克隆人Ras家族小G蛋白Rap2c的cDNA,构建其真核表达质粒并在人肺癌细胞株A549和H1299中表达。方法人骨肉瘤细胞株U2OS提取细胞总RNA,经逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）逆转录成cDNA,PCR扩增Rap2c,酶切后插入pcDNA3．1（＋）构建真核表达质粒 pcD-NA3．1（＋）-Rap2c,采用酶切及测序鉴定。重组质粒转染A 549和H 1299细胞,Western blot 检测其目的基因表达。结果双酶切及测序结果显示重组质粒pcDNA3．1（＋）-Rap2c成功构建,Werstern blot 检测到 A549和H 1299细胞有相应蛋白表达。结论成功构建人Rap2c基因真核表达质粒,为后续研究奠定了基础。     

大鼠Ngn2基因真核表达质粒的构建

目的：构建大鼠Neurogenin2（Ngn2）基因的真核表达质粒。方法：从大鼠海马组织提取海马总mRNA ,RT-PCR获得Ngn2基因cDNA,构建重组质粒pSecTag2／HygroB-Ngn2, XhoⅠ和HindⅢ双酶切、测序鉴定重组质粒。结果：RT-PCR获得片断与预期结果相符,酶切鉴定、测序鉴定证实pSecTag2／HygroB-Ngn2重组质粒构建成功。结论：成功构建了大鼠Ngn2基因的真核表达质粒,并对该基因的真核表达产物进行鉴定,为下一步Ngn2基因对神经损伤修复作用的研究奠定基础。     

组织型纤溶酶原激活因子基因真核表达质粒的构建及其体外表达研究

目的构建人组织型纤溶酶原激活因子(t-PA)基因的新型真核表达载体pcDNA3.1-Myc-His B(-)/t-PA,并观察其在人脐静脉内皮细胞株(hUVEC)中的表达情况。方法将t-PA基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1-Myc-His B(-)中,经脂质体介导将pcDNA3.1-Myc-His B(-)/t-PA导入hUVEC,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测t-PA基因在转染细胞内的转录水平,免疫印迹法(Western blot)检测转染细胞t-PA蛋白表达,底物发色法检测转染细胞t-PA活性。结果经双酶切鉴定和测序证实已将t-PA基因DNA片段正确插入到真核表达载体中,转基因组、空载体组、转绿色荧光蛋白组和空白对照组hUVEC t-PA mRNA相对含量分别(0.92±0.22)(、0.32±0.17)(、0.35±0.17)和(0.27±0.17),转t-PA基因组明显高于对照各组,其细胞培养上清t-PA活性分别为(48.90±8.06)、(5.44±1.09)(、5.17±0.95)和(5.01±1.03)U/106细胞.24h,转t-PA基因组t-PA活性明显高于各对照组(均P<0.01)。用抗Myc标签抗体可检测到转t-PA基因组外源性蛋白质表达,对照组则为阴性。结论成功构建pcDNA3.1-Myc-His B(-)/t-PA基因新型真核表达载体,并能在hUVEC中表达,从而为血栓性疾病的基因治疗研究奠定了基础。     

Spag6L基因真核表达质粒的构建及细胞内的蛋白表达与定位

目的:构建小鼠Spag6L基因真核表达质粒,并研究其在细胞内的表达与定位。方法:以小鼠睾丸cDNA基因文库为模版,PCR扩增Spag6L基因全长序列,测序正确后亚克隆至pEGFP-N2和pcDNA3真核表达载体中并酶切鉴定,将构建成功的重组表达质粒转染至COS-7与CHO细胞中,Western blot法检测COS-7细胞中SPAG6L蛋白表达,激光共聚焦扫描显微镜观察SPAG6L蛋白在CHO细胞内的定位。结果:重组质粒pEGFPSpag6L和pcDNA3-Spag6L经双酶切后产生的1.5kb的目的插入片段,经测序证实与Spag6L基因一致。GFPSPAG6L融合蛋白分子质量为82kU,SPAG6L蛋白分子质量为56kU。SPAG6L蛋白在CHO细胞中主要定位于细胞质,以微管和囊泡表达为主。结论:构建的pEGFP-Spag6L和pcDNA3-Spag6L真核表达质粒成功,为进一步探究Spag6L基因与Spag6基因的关系以及Spag6L基因在精子发生中的功能与作用奠定了基础。     

小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体，为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法：以小鼠脾脏总RNA为模板，以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2a Fc段cDNA；另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白（GFP）基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，测序鉴定正确后，用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞（HEK293细胞），荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。结果：成功构建了小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，并在HEK293细胞中实现表达。结论：小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功，为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。     

人CCR5基因真核表达质粒的构建及其鉴定

目的:构建人CCR5基因的真核表达质粒并对其进行功能鉴定.方法:PCR扩增人CCR5基因,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1内,构建含人CCR5基因的真核表达质粒pcDNA3.1-CCR5.使用RT-PCR、流式细胞术和HIV假病毒感染实验的方法,鉴定CCR5在真核细胞中的表达和功能.结果:克隆的人CCR5基因与GenBank中已登记的基因序列100%同源.瞬时转染真核细胞后,RT-PCR在预期的位置检测出目的条带,流式细胞术检测到约25.6%的细胞表达CCR5蛋白,且该蛋白能介导HIV假病毒的感染.结论:成功构建了含人CCR5基因的真核表达质粒.     

人低氧诱导因子1α真核表达质粒的构建和鉴定

目的:构建人低氧诱导因子1α(HIF-1α)真核表达质粒及其在人肝癌细胞(HepG2)中的表达。方法:从HepG2细胞中提取总RNA,通过RT-PCR逆转录,获得HIF-1α的cDNA,双酶切后构建真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证碱基序列。用脂质体法将质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α转染至HepG2,以免疫荧光和Western Blot法分别对转染细胞进行HIF-1α表达分析。结果:扩增出HIF-1α全长cDNA,构建真核表达质粒,测序结果正确。经检测的质粒转染至HepG2细胞后,HIF-1α蛋白水平高于转染空载细胞。结论:成功构建人HIF-1α基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α,并证明其能在HepG2细胞内表达。     

大肠癌组织中组织蛋白酶L的表达

目的:检测人大肠癌组织中组织蛋白酶L(CL)的表达.方法:应用原位杂交和免疫组化SP法检测45例大肠癌组织及癌旁正常组织中CL mRNA及蛋白的表达.结果:正常大肠黏膜CL mRNA及蛋白阳性表达率分别为15.6%和24.4%,均低于相应癌组织(77.8%,82.2%,P均＜0.01).大肠癌组织中CL mRNA及蛋白的表达与大肠癌的分化和分期有关.结论:人大肠癌组织中CL mRNA及其蛋白均呈高表达,CL与大肠癌的发生、发展有关.     

癌胚抗原真核表达质粒的构建

目的 癌胚抗原（CEA）是1种国际上公认的肿瘤标志物，是某些肿瘤诊断和治疗的靶分子，为了增强表达CEA的重组质粒对肿瘤的免疫防治效果，我们构建了1套表达CEA的真核表达质粒。方法 运用基因工程技术将编码人CEA全长2.4kb cDNA片段插入到表达载体pCI-neo中，用限制性内切酶法对其进行鉴定。结果 构建的重组质粒含有2.4kb CEA cDNA片段，且正向插入。结论 这为更好地研究CEA的重组质粒对CEA阳性肿瘤的免疫效应打下基础。     

RNA干扰CA916798基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建CA916798基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体.方法 以CA916798为靶基因,以pGenSil-l质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的CA916798基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计2条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-l中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析.用脂质体2 000将重组质粒转染A549/CDDP细胞并用G418筛选,MTT法测定药物敏感性并绘制细胞增殖曲线.结果 构建针对CA916798的pRNAi-CA916798shRNA,经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到A549/CDDP细胞表达绿色荧光蛋白(GFP)证实重组质粒已转染入细胞并用G418剔除了未转染质粒的细胞,1.0μg/ml顺铂作用后pRNAi-CA916798shRNA转染组细胞增殖受到明显抑制(P＜0.01).结论 成功构建CA916798基因的shRNA表达载体,并筛选出转染了CA916798shRNA的A549/CDDP细胞.     

人IGF-I基因真核表达质粒pIRES2-EGFP-IGF-I的构建

目的利用基因工程原理构建人胰岛素样生长因子I(IGF—I)全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-IGF-I。方法应用PCR方法从人肝细胞eDNA文库中提取人IGF-I全长cDNA序列，克隆人T载体pMDl8中，经测序证实序列正确后，进行双酶切并定向插入真核表达载体pIRES2-EGFP中，利用双酶切、电泳和PCR证实插入片段的正确性。结果经测序证实，目的基因人IGF-I的全长基因序列被正确扩增；构建的真核表达载体经双酶切和PCR鉴定证实，hIGF-I被定向插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中：结论利用基因工程原理可以正确地构建人IGF-I全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-IGF-I。     

人IL-18基因真核表达载体的构建

目的:通过克隆人的Interleukin-18基因,构建Interleukin-18基因的哺乳动物细胞真核表达载体。方法:把人基因组DNA通过PCR获得Interleukin-18,克隆载体pMD18-T/Interleukin-18,并将其转化到大肠杆菌里,最后进行重组真核表达载体pCDNA3.1/Interleukin-18的构建和鉴定。结果:以人总DNA为模板扩增出580 bp左右的特异性条带,测序结果与GeneBank测序结果相比,除两个碱基外,其余的完全一致,翻译成的氨基酸序列相同。对重组质粒pCDNA3.1/Interleukin-18进行双酶切鉴定并测序,结果也完全一致。结论:重组质粒pCDNA3.1/Interleukin-18由真核载体pCDNA3.1和Interleukin-18片段组成。且插入的Interleukin-18片段与已知序列完全相同。     

uPA基因真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建人尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因真核表达载体,并转染人肝癌细胞,为进一步体外研究uPA在肝癌发生发展中的作用奠定基础.方法:从肝癌组织中提取RNA,通过RT-PCR的方式,获得基因uPA的全长cDNA,并克隆于含有HA2-标签(tag)的真核表达载体pCMV上,酶切鉴定,质粒测序鉴定,用pCMV-uPA-HA2进行细胞瞬时转染及WesternBlotting鉴定.结果:经过测序证实得到获得包含uPA基因的pCMV-HA2真核表达载体,瞬时转染细胞有蛋白表达.结论:克隆了人肝癌的uPA基因,成功构建真核表达载体.     

人碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达质粒的构建

目的：构建人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因真核表达质粒,为深入研究ｈｂＦＧＦ在组织修复中的分子调节机制及临床应用提供物质基础。方法：含ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ的ｐＵＣ１８－ｈｂＦＧＦ质粒于大肠杆菌ＪＭ１０９内扩增;提取及纯化ｐＵＣ１８－ｈｂＦＧＦ质粒;经ＤＮＡ序列分析所含ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ;限制性酶切ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ片段,连接酶连接到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｎｅｏ内,克隆出真核表达质