惊厥持续状态幼年大鼠海马CHOP水平的动态变化及依达拉奉对其表达的影响

目的 观察惊厥持续状态(SC)幼年大鼠海马前凋亡因子CHOP 动态表达及神经细胞凋亡的变化,探讨依达拉奉(ED)对二者的影响.方法 将195只SD幼年雄性大鼠随机分为9 g·L-1盐水对照组(NS组)、SC组和ED组,每组65只,各组均按SC后处死时间点分为2 h、12 h、24 h、48 h、72 h 5个亚组,每组13只.应用氯化锂-毛果芸香碱建立大鼠SC模型,用半定量反转录-PCR(RT-PCR)动态观察SC后大鼠海马CHOP mRNA的表达,采用免疫组织化学SABC法检测海马CA1区CHOP蛋白表达;并用HE染色观察海马CA1区病理改变,原位细胞凋亡检测法(TUNEL)观察海马CA1区神经元凋亡细胞数.结果 1.RT-PCR法:SC组幼年大鼠海马CHOP mRNA表达于2 h开始增加,于12 h达高峰,之后开始下降;与NS组各时间点比较差异均有统计学意义(Pa<0.01);与SC组比较,ED组(2 h,12 h,48 h)CHOP mRNA表达均明显下降(Pa<0.05,0.01).2.免疫组织化学结果:SC组幼年大鼠海马CHOP蛋白表达于2 h开始增加,12 h明显增加,24 h达高峰;与NS组各时间点比较差异均有统计学意义(Pa<0.01);ED组各时间点均较SC组明显降低(Pa<0.01,0.05).3.TUNEL结果:SC组海马CA1区TUNEL阳性细胞数于惊厥后24 h迅速增加,48 h达高峰(Pa<0.05,0.01);与NS组比较,12～72 h时间点组均明显高于NS组(Pa<0.01);与SC组比较,ED组12～72 h CA1区TUNEL阳性细胞数明显减少(P<0.05,0.01).4.HE染色:SC后出现神经元变性及丢失,48 h组病理改变最显著,与TUNEL表达一致;而ED组病理改变减轻.结论 SC后早期幼年大鼠可能触发了内质网应激中CHOP介导的凋亡信号途径,从而引起了脑损伤;而ED可能通过下调其表达,从而缓解惊厥后脑损伤.     

依达拉奉预处理对惊厥持续状态幼年大鼠海马神经元保护及IL-lβ表达的影响

目的：观察依达拉奉预处理对幼年大鼠惊厥持续状态（SC）后脑组织海马神经元的保护作用及白介素-lβ（IL-lβ）表达的影响。方法：将195只Sprague-Dawley幼年雄性大鼠随机分为生理盐水对照组（NS组）、惊厥持续状态组（SC组）和依达拉奉干预组（ED组）；各组又均按时间点分为4、12、24、48、72 h 5个亚组。采用氯化锂-匹鲁卡品化学点燃法制备幼年大鼠SC模型。ED组于惊厥前3 d予以ED腹腔注射，每天1次，连续3 d。观察大鼠海马病理学改变及细胞凋亡以及IL-lβ蛋白表达情况。结果：电镜显示SC组惊厥后24 h海马少量神经元出现核固缩，大量内质网扩张；48 h以后内质网扩张较前有所减轻，但线粒体肿胀加重。ED组各时间点神经元改变均较SC组减轻。SC组在惊厥后12 h海马TUNEL阳性细胞数已显著高于NS 组，48 h达高峰，而ED组TUNEL阳性细胞数均较SC组显著下降，但仍高于NS组。免疫组化法示12 h、24 h、48 h、72 h SC组大鼠海马中IL-1β表达增强，与NS组比较差异有统计学意义；与SC组比较，ED组IL-1β表达明显降低，差异有统计学意义。结论：ED可下调匹鲁卡品致痫大鼠海马IL-1β的表达，减轻细胞凋亡，提示ED对SC引起的脑损伤有保护作用。［中国当代儿科杂志，2010，12（3）：205-210］     

依达拉奉对惊厥持续状态幼年大鼠海马GFAP和IL-lβ表达及细胞凋亡的影响

目的观察幼年大鼠惊厥持续状态(SC)后海马胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、白介素-lβ(IL-lβ)的表达及神经细胞凋亡的变化,并探讨依达拉奉(ED)对三者的影响。方法将195只Sprague-Dawley幼年雄性大鼠随机分为生理盐水对照组(NS组)、惊厥持续状态组(SC组)和依达拉奉干预组(ED组),每组65只,各组均按SC后处死时间分为4 h、12 h、24 h、48 h、72 h 5个亚组,每组13只。采用氯化锂-匹鲁卡品制备幼年大鼠SC模型。应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法检测海马GFAP mRNA表达,免疫组化法检测海马中GFAP、IL-lβ蛋白表达,TUNEL法检测神经细胞凋亡。结果 (1)免疫组化结果显示SC组海马中GFAP和IL-1β表达增强,与NS组比较差异有统计学意义;与SC组比较,ED组GFAP和IL-1β表达明显降低,差异有统计学意义;(2)RT-PCR法检测结果显示GFAP表达趋势与蛋白基本相似;(3)SC组在惊厥12 h时间点海马CA1区TUNEL阳性细胞数已显著高于NS组,48 h达高峰,而ED组TUNEL阳性细胞数在12～48 h时间点均较SC组显著下降,但仍高于NS组。结论 SC后大鼠海马GFAP和IL-1β的表达增强,ED可下调SC大鼠海马GFAP和IL-1β的表达,并使神经细胞凋亡减少;提示ED对SC引起的脑损伤可能有保护作用。     

内质网应激反应介导反复高热惊厥大鼠海马神经元的凋亡

目的 观察反复高热惊厥(FS)大鼠海马神经元凋亡,及内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白(GRP)78和内质网促凋亡因子半胱氨酸蛋白酶-12(Caspase-12)表达的改变,探讨内质网应激反应在热性惊厥后脑损伤中的作用.方法 SD大鼠80只,雌雄各半,随机分为对照组和反复FS组,每组40只.采用反复热水浴诱导大鼠FS,隔日诱导1次,共10次.应用原位细胞凋亡检测法(TUNEL)检测凋亡细胞,免疫组织化学、免疫蛋白印记(Western blot)和荧光实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测反复FS后3、6、12、24,48 h和对照组大鼠海马内GRP78及Caspase-12 mRNA和蛋白的表达.结果 反复FS后随着时间的延长,反复FS组大鼠TUNEL阳性神经元数目明显增加,于惊厥后24 h达高峰.Hoechst染色可见其凋亡细胞的核浓缩和核碎裂.Western blot显示反复FS组大鼠3、6、12 h海马内GRP78蛋白的表达较对照组明显增高,表达高峰在FS后6 h.GRP78 mRNA的表达时相改变和高峰出现时间与蛋白表达类似.免疫组织化学显示其GRF78蛋白广泛分布于海马内各个区,与对照组分布相同.FS后12、24和48 hCaspase-12活性片段的表达较对照组明显增多,24 h达峰值.12,24、48 h Caspase-12 mRNA的表达与对照组的比较有显著性差异,24 h达高峰.免疫荧光双标记显示Caspase-12活性片段阳性细胞大多为神经元,并与TUNEL染色共定位,表现为核浓缩和核碎裂.结论 Caspase-12介导的内质网应激凋亡途径参与了反复FS导致的神经元凋亡过程.     

参附注射液对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠海马神经元凋亡影响

目的研究参附注射液对缺氧缺血性脑损伤（HIBD）新生大鼠海马神经元凋亡的影响。方法实验分成两部分：1.流式细胞术检测缺氧缺血（HI）前2 h、HI后2、12、24 h,3、7、14和28 d各时间点新生大鼠海马CA1区神经元凋亡率;2.免疫组织化学测HI前2 h、HI后2、12、24 h,3、7、14和28 d各时间点新生大鼠海马CA1区神经元Bcl-2、Bax蛋白表达。建立新生大鼠HIBD模型。每组实验随机分为4组：假手术组（S）,9 g/L盐水对照组（C）,参附预处理组（P）,参附治疗组（SF）。结果SF和P组海马神经元凋亡情况明显低于C组（P〈0.01,〈0.05）,且Bcl-2表达显著增多（P〈0.05,〈0.01）,而Bax表达明显下调（P〈0.05,〈0.01）。结论参附注射液可明显上调新生大鼠HIBD后海马神经元Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,减少HIBD新生大鼠海马神经元凋亡发生。     

依达拉奉对惊厥持续状态大鼠海马IRE1 mRNA表达及神经元凋亡的影响

目的：探讨依达拉奉（EDA）对惊厥持续状态（SC）后大鼠海马内质网应激关键标志分子IRE1表达及神经元凋亡的影响。方法：将19~21 d日龄的Sprague-Dawley大鼠随机分为SC组、EDA组、对照组。其中SC组、EDA组再按SC后处死时间点不同分别分为4,12,24,48,72 h 5个亚组;每组均8只。用RT-PCR检测SC后海马IRE1 mRNA的表达。用原位细胞凋亡检测法（TUNEL）观察神经元凋亡细胞数。电镜观察海马CA1区神经元超微结构变化。结果：①RT-PCR 结果：SC组4 h和12 h时间点IRE1 mRNA含量较对照组明显升高,差异有非常显著性（P<0.01）;EDA组4,12,24 h时间点IRE1 mRNA含量显著高于SC组对应时间点及对照组的含量,差异有非常显著性（P<0.01）。②TUNEL结果：SC组12~72 h时间点TUNEL阳性细胞数多于对照组,差异有显著性（P<0.01）,且SC组TUNEL阳性细胞数随惊厥持续时间延长而增加。EDA组12~72 h时间点TUNEL阳性细胞数较SC组明显减少,差异有显著性（P<0.05或P<0.01）,但仍高于对照组,差异有显著性（P<0.05或P<0.01）。③ 电镜观察结果：SC组及EDA组4 h后即开始出现核周细胞器的改变,12 h后出现明显细胞核的改变。其中SC组细胞凋亡严重,EDA组凋亡较轻。结论：EDA可能通过上调IRE1的表达及维持其活性而缓解内质网压力而发挥对神经元的保护作用,有望成为在体抑制内质网应激的有效药物。 ［中国当代儿科杂志,2009,11（6）：471-475］     

持续惊厥后不同年龄大鼠海马凋亡调控基因表达的变化

目的：比较惊厥持续状态（SC）后不同年龄大鼠海马凋亡调控基因 bcl-2 和 c-Jun 表达的变化,探索未成熟脑耐受惊厥性脑损伤的分子基础。方法：制作幼年和成年 Wistar大鼠 SC 模型,同时设置正常对照组和实验对照组,每组 8 只。于 SC 后3 h,6 h,12 h,1 d,3 d和7 d分别处死动物,免疫组化、原位杂交和 RT-PCR 测定海马 bcl-2 和 c-Jun 蛋白及mRNA的表达。结果：SC 后幼年组和成年组海马 c-Jun 蛋白表达均升高,SC 后 6 h 达高峰,显著高于正常对照组（P<0.01）,12 h 后开始回落。幼年 SC 组 c-Jun 蛋白表达于 SC 后 1 d 已降至幼年正常对照组水平,而成年 SC 组直至 SC 后 7 d 仍显著高于成年正常对照组（P<0.05）。SC 后 6 h,12 h,1 d,3 d和 7 d 成年 SC 组 c-Jun 蛋白表达均显著高于幼年 SC 组（P<0.05）。SC 后幼年组和成年组海马 c-Jun mRNA 的表达与其蛋白表达规律类似。SC 后幼年组和成年组海马 bcl-2 蛋白及mRNA表达升高不明显。结论：SC诱导海马凋亡促进基因 c-Jun 表达增高,幼年鼠较成年鼠表达明显为弱,且持续时间短,这可能是未成熟脑抵抗惊厥性脑损伤的机制之一。SC 未能明显诱发凋亡抑制基因 bcl-2 的强表达,其表达受年龄影响小。     

CCAAT/增强子结合蛋白介导的内质网应激参与癫(痫)脑损伤的机制

目的 在建立戊四氮癫痫持续状态(SE)模型的基础上观察大鼠海马神经元的凋亡,内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和内质网应激(ERS)特异性促凋亡因子即CCAAT/增强子结合蛋白(CHOP)在癫(痫)脑损伤(EBD)大鼠中的表达,探讨GRP78及CHOP在EBD中的作用,以及2-脱氧葡萄糖(2-DG)通过激活一定程度的ERS发挥脑保护作用的可能机制.方法 SD大鼠120只,雌雄各半,随机分为正常对照组、SE组和SE+ DG组,每组40只.采用腹腔注射戊四氮诱导大鼠SE.应用原位细胞凋亡检测法检测凋亡细胞,Western blot和Real-time PCR方法检测SE发作后3、6、12、24、48 h大鼠海马内GRP78及CHOP mRNA和蛋白的表达.结果 SE发作后12、24、48 h神经细胞凋亡增多,SE+ DG组凋亡细胞数在同一时间点较SE组明显减少;Western blot和Real-time PCR发现GRP78蛋白和mRNA的表达在SE发作后3、6、12 h均高于正常对照组,6h达峰值;SE+ DG组GRP78 mRNA和蛋白的表达在早期(3 h)较SE组明显增高,6h和12h明显减少;在SE发作后6h开始增多,12、24、48 h CHOP蛋白和mRNA的表达高于正常对照组,24 h达高峰;SE+ DG组在同一时间点均较SE明显减少.正常对照组各个时间点GRP78和CHOP蛋白和基因的表达均无差异.结论 SE发作后早期可能通过GRP78表达升高启动ERS以保护细胞功能;后期CHOP被激活,参与EBD发生过程;2-DG通过激活一定程度的ERS,保护脑细胞.内质网CHOP凋亡通路可能是EBD的又一机制.     

促红细胞生成素对窒息新生大鼠心肌细胞凋亡及内质网应激相关蛋白的影响

目的：研究促红细胞生成素（EPO）对窒息新生大鼠心肌细胞凋亡及内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和C/EBP同源蛋白（CHOP）的影响。方法：120只新生7日龄Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为假手术组、窒息组和EPO组,每组40只。制备新生鼠常压窒息模型;EPO组于造模后立即给予rhEPO 500 U/mL（10 mL/kg）腹腔注射,其余两组接受同剂量的生理盐水。各组在造模完成后2 h、6 h、12 h、24 h和48 h分别取8只大鼠采集心脏血及心肌组织,测定血清心肌酶肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）水平,检测心肌细胞凋亡情况及心肌组织GRP78、CHOP蛋白的表达。结果：与假手术组和EPO组相比,窒息组各时间点血清心肌酶CK和LDH升高,凋亡细胞增多,GRP78、CHOP表达上调（P<0.01）;上述各指标在EPO组的表达水平亦高于假手术组（P<0.01）;窒息后24 h心肌组织CHOP蛋白与心肌细胞凋亡指数AI呈正相关（r=0.942,P<0.01）。结论：EPO可能通过调节内质网应激相关细胞因子GRP78、CHOP,减少心肌细胞凋亡从而发挥对新生鼠缺氧缺血性心肌损伤的保护作用。     

严重惊厥发作过程中核因子-κB活化与神经元凋亡的关系

目的：探讨戊四氮(PTZ)所致大鼠严重惊厥发作模型中核因子κB(NFκB)活化与神经细胞凋亡的关系。方法：42只大鼠随机分为7组,即对照组、致惊后3h、6h、12h、24h、48h和吡咯啉烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)+PTZ组。免疫组织化学法检测海马CA1区NFκB亚基p65核移位;TUNEL和流式细胞仪检测海马细胞凋亡。结果：流式细胞仪和TUNEL法显示惊厥发作后有细胞凋亡的发生,24h达高峰,与对照组相比分别为(12.54±4.99)%vs(2.24±0.57)%和(61.62±4.99)个/gcsvs(3.35±0.89)个/gcs,P均<0.001;对照组大鼠海马未见p65核移位细胞,而致惊后p65核移位细胞显著上调,24h达高峰(32.30±4.71)个/gcs。PDTC预处理组与致惊24h组相比p65核移位及细胞凋亡明显减少。结论：NFκB活化在严重惊厥发作所致的细胞凋亡发生中发挥重要作用;PDTC可通过抑制NFκB的表达而减少惊厥后的细胞凋亡。     

新生大鼠脑白质损伤时GRP78和caspase-12基因表达变化研究

目的：GRP78被认为是内质网应激的一个敏感标志,caspase-12是内质网应激诱导调亡的关键分子。该研究探讨新生大鼠脑白质损伤时GRP78 mRNA和caspase-12 mRNA表达的变化及caspase-12介导的内质网应激在脑白质损伤中的作用。方法：进入实验的大鼠共96只,实验组和对照组各49只,实验组制备脑白质损伤动物模型,分别于缺氧缺血后0,2,4,6,12,24 h及72 h处死,苏木精-伊红染色观察脑组织病理学变化,实时PCR技术检测GRP78 mRNA及caspase-12 mRNA表达变化。结果：与对照组相比,实验组GRP78 mRNA在缺氧缺血后2 h表达开始上升,6 h达峰值,缺氧缺血后2,4,6,12,24,72 h表达均增加（P<0.05）。实验组caspase-12 mRNA在缺氧缺血后6 h开始表达上调,缺氧缺血后6,12,24 h均增加（P<0.05）。结论：新生大鼠脑白质损伤时,实验组GRP78 mRNA及caspase-12 mRNA表达较对照组显著升高,且表达升高有时序性。表明缺氧缺血导致内质网应激反应被激活,内质网应激可能是新生大鼠脑白质损伤的发病机制之一。［中国当代儿科杂志,2009,11（8）：691-694］     

内毒素血症幼年大鼠胃黏膜pS2 TGF-α和PCNA表达变化及意义

目的：胃黏膜上皮的生长、更新和修复的过程是受到严格调控的,其修复能力可能与肽类物质的表达水平有关。该文探讨急性胃黏膜损伤修复中乳癌相关肽（pS2）、转化生长因子-α(TGF-α)及增殖细胞核抗原(PCNA) 的作用。方法：18日龄Wistar大鼠,随机分为实验组（LPS组）和对照组,分别腹腔注射内毒素（5 mg/kg）及生理盐水,每一时相点8只,注射后1.5, 3, 6, 24, 48, 72 h 观察胃黏膜损伤情况,苏木精-伊红染色观察形态学改变,免疫组化SP法检测胃黏膜pS2、TGF-α及PCNA蛋白表达变化。结果：LPS组6 h胃黏膜损伤最重,黏膜表面可见大片糜烂、出血、条索状坏死,与胃纵轴平行;光镜下黏膜表面上皮广泛脱落,黏膜内有出血,炎性细胞浸润,核碎裂、固缩,凋亡小体出现,腺体受损。LPS组的PCNA在3,6,24,48 h 胃黏膜组织细胞核表达较对照组明显减低（P<0.01）;pS2在1.5 h胃黏膜组织细胞浆表达低于对照组,3 h 恢复正常,6,24,48,72 h 明显高于对照组（P<0.01）;TGF-α在6,24,48 h 胃黏膜组织细胞浆表达较对照组明显增强（P<0.01）。结论：PCNA表达变化反映了胃黏膜损伤和修复过程中胃黏膜细胞的增殖活性;pS2表达上调,可能通过介导细胞增殖参与急性胃黏膜细胞保护作用;TGF-α表达增强,可能促进了胃黏膜上皮的代谢和生长,参与胃黏膜的修复。     

头部亚低温对新生儿缺氧缺血性脑病半胱氨酸蛋白酶-3和白介素-18的影响

目的：探讨选择性头部亚低温治疗新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和白介素-18(IL-18)的变化,以了解头部亚低温治疗HIE的神经保护机制。方法：33例中、重度HIE患儿随机分为亚低温治疗组（n=16）和常规治疗组（n=17）。应用ELISA法检测0 h、24 h、48 h、72 h和5 d的外周血清中caspase-3和IL-18 的浓度。结果：亚低温组在治疗后24 h及48 h血浆caspase-3浓度分别为3.8±1.9和2.6±1.2 ng/mL,明显低于常规组的6.1±2.3和7.2±3.1 ng/mL,P<0.01。亚低温组血浆IL-8浓度在治疗后24 h、48 h及72 h亦出现明显下降,分别为119±30、76±33和71±40 ng/mL,与常规组的138±28、156±60和182±54 ng/mL相比,差异有统计学意义（P<0.01）。结论：应用头部亚低温治疗可抑制患儿血清中caspase-3和IL-18浓度的过度升高,揭示了头部亚低温治疗HIE的部分神经保护机制。［中国当代儿科杂志,2010,12（9）：690-692］     

新生大鼠窒息后肾组织Omi／HtrA2表达及Ucf-101干预效果

目的：探讨Omi／HtrA2在新生鼠窒息后肾组织的变化及Ucf-101的干预作用。方法：将72只7~10 d Wistar大鼠随机分为对照组、窒息组和Ucf-101组。窒息组和Ucf-101组大鼠制成常压窒息模型。在窒息30 min后复氧2、24、48 h时采用免疫组化法检测各组肾组织中Omi／HtrA2的表达。采用TUNEL法检测肾凋亡细胞的形态及数量变化。结果：窒息复氧后2 h Omi／HtrA2表达开始增强,于24 h达最高峰,随后有所下降。与窒息组相比,Ucf-101组各个时相点Omi／HtrA2的表达阳性率明显降低(P<0.01)。窒息复氧后2 h,肾组织开始出现肾小管上皮细胞凋亡,24 h凋亡细胞数达到高峰,而Ucf-101组各个时相点凋亡指数较窒息组均有明显减少。结论：新生大鼠窒息后肾组织Omi/HtrA2表达增强,参与肾损伤;Ucf-101可使Omi／HtrA2的表达下降,从而抑制肾小管上皮细胞凋亡。［中国当代儿科杂志,2010,12（8）：658-661］     

血液灌流在儿童急性毒鼠强中毒救治中的应用

目的：观察血液灌流(HP)治疗儿童急性毒鼠强(TET)中毒的疗效。方法：32例急性TET中毒儿童，年龄1~8岁，平均年龄4.6±2.4岁，均予以HP治疗。HP前、HP治疗1 h、2 h及HP后12 h、24 h测血清TET浓度，观察HP治疗开始到意识恢复时间、抽搐停止时间。结果：17例行HP治疗1次，12例2次，2例4次，1例 3次。27例(84%)治愈，2例(7%)好转，3例(9%)死亡。HP治疗1 h、2 h的TET浓度逐渐降低，且明显低于治疗前(P<0.01)。HP后12 h、24 h的TET浓度仍显著低于治疗前(P<0.01)。意识恢复时间为5.4±4.2 h、抽搐停止时间为10.1±7.3 h。结论：儿童急性TET中毒行HP治疗是有效的。［中国当代儿科杂志，2010，12（7）：536-538］