小鼠神经干细胞的生物学特性观察

目的探讨小鼠神经干细胞体外原代培养的生长特性.方法用无血清与单细胞克隆技术对小鼠胚胎脑组织进行分离、培养,用光镜、免疫组织化学进行鉴定,并对其不同生长时期的生物学特性进行透射电镜观察.结果鼠胚胎分离细胞具有连续分化及克隆能力,克隆球和早期的原始细胞神经上皮干细胞蛋白(nestin)抗原呈阳性.成熟分化后胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及神经丝-200(NF-200)抗原呈阳性.不同期电镜结果:培养2周的神经干细胞较原始,核大,细胞质少,细胞器不发达.将其继续培养到4周,部分细胞内可见到发达的细胞器,并在分化细胞中观察到神经微管、微丝、胶样丝和细胞间连接样结构.结论胚胎脑组织在体外培养并克隆成神经球,具有很强的增殖能力,是多分化潜能干细胞.     

人小龄胚胎神经干细胞的分离培养、扩增及鉴定

目的 探索人胚胎神经干细胞的体外分离培养条件，从而在体外大量扩增神经干细胞；并观察神经干细胞增殖、分化的特点。方法 从人胚胎脑分离神经干细胞，部分细胞冻存，另一部分细胞进行体外培养。采用无血清培养液，加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激细胞增殖，进行体外扩增、传代培养。采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元及胶质细胞。结果 从人胚胎脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经干细胞球，这些神经干细胞球可在体外扩增及传代培养。免疫荧光法鉴定神经干细胞球中大部分为神经上皮干细胞蛋白(nestin)表达阳性细胞。贴壁后可以分化出神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳性的细胞。经冻存后的胎脑细胞也能培养出具有同样特征的神经干细胞。结论 在含有EGF和bFGF的无血清培养液中，从人胚胎脑能分离培养出神经干细胞，并能在体外大量扩增。这为人类神经干细胞的进一步研究和应用提供了材料。     

人胚神经干细胞的体外培养和超微结构观察

目的观察体外分离培养的人胚脑神经干细胞的生物学行为和超微结构特征。方法利用无血清培养和单细胞克隆技术从人胚脑组织中分离培养神经干细胞并用血清诱导其分化,应用免疫荧光细胞化学技术对培养细胞及其分化细胞进行鉴定,并分别用扫描电镜和透射电镜观察其超微结构。结果从人胚脑组织分离的细胞群呈悬浮球状生长,具有连续增殖的能力,并可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。扫描电镜发现神经干细胞球中的细胞之间连接较为松散,无紧密连接结构;透射电镜发现神经干细胞的胞核巨大,胞浆少,核浆比例较大,胞浆内细胞器简单,以核糖体和内质网居多。结论神经干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,其超微结构显示早期原始幼稚细胞的发育特征。本研究为进一步的神经干细胞基础研究和临床应用奠定了基础。     

rhEGF和rhbFGF诱导胎鼠脑组织神经干细胞向神经元样细胞分化的研究

目的 观察在重组人表皮生长因子和重组人碱性纤维母细胞生长因子诱导下胎鼠脑组织神经干细胞向神经元样细胞分化的超微结构及细胞标志物表型特征.方法 采用孕16 d大鼠胚胎脑组织进行神经下细胞体外分离、培养传代及鉴定,分别于倒置相差显微镜及电子显微镜下观察经体外诱导培养后神经干细胞的组织形态及超微结构变化;免疫细胞化学染色检测神经微丝、微管相关蛋白-2、去甲肾上腺素、乙酰胆碱、γ-氨基丁酸以及多巴胺等蛋白质标志物的表达.结果 倒置相差显微镜观察显示,经体外培养的神经下细胞随着培养时间的延长逐渐形成神经干细胞球体,经体外诱导培养至第7天时即开始出现明显分化趋向,第14天时部分细胞分化发育完全;且蛋白质标志物神经微丝、微管相关蛋白-2、去甲肾上腺索、乙酰胆碱、γ-氨基丁酸及多巴胺均表达阳性.电子显微镜观察经体外诱导培养至第14天时,细胞出现明显的成熟分化趋向,细胞质中含有大量神经微丝和神经内分泌颗粒,呈典型的神经元分化特征.结论 神经千细胞在体外诱导培养条件下短期即可向神经元方向成熟分化.     

胚胎大鼠神经干细胞分离培养的实验研究

目的探讨胚胎大鼠神经干细胞的分离培养方法,并对其进行鉴定。方法从胚胎大鼠脑组织中分离神经干细胞,采用无血清培养技术,在生长因子的作用下使其在体外不断增殖克隆,同时利用免疫荧光染色的方法对培养的细胞进行鉴定。结果体外培养的细胞增殖成细胞克隆球并能稳定传代,经鉴定,均为nestin染色阳性细胞。结论利用无血清技术和特定生长因子,可以使来源于胚胎大鼠的神经干细胞在体外扩增并稳定传代。     

胚胎大鼠神经干细胞的体外培养与鉴定

目的利用无血清培养和细胞克隆培养技术从孕鼠(14 d)胚胎中分离出神经干细胞,并进行传代培养和诱导分化。 方法 采用免疫细胞荧光化学染色方法观察不同代数细胞克隆球中nestin、neuN、GFAP阳性细胞比例,鉴定培养的原代和传代的细 胞类型结果随着传代次数增加,克隆球中nestin阳性细胞的比例无明显变化(P>0．05),不同代数的神经干细胞克隆球诱导分化 后均有一定比例的neuN与GFAP阳性细胞。结论 证实从胚胎大鼠大脑皮层分离培养的细胞是神经干细胞,提示体外培养体系中 培养的神经干细胞可以长期传代并保持于细胞的特性。     

人胚海马神经干细胞体外培养及分化研究

目的 研究人胚胎海马神经干细胞体外长期培养的条件和其在自主分化条件下的分化能力和分化特点。方法 从人胚胎海马分离神经干细胞。采用无血清培养法，进行体外培养、扩增，形成神经球。使神经球贴壁分化，分化培养基不含有任何细胞有丝分裂促进剂。使用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记分裂增生的细胞，观察细胞的分裂增殖情况。使用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞及其在不加诱导剂下的自主分化能力。结果 从人胚胎海马分离的神经干细胞具有增殖能力，细胞倍增时间为3．2d。BrdU检测有正在分裂、增殖的细胞。细胞贴壁分化后可以出现Nestin、GFAP、Tuj-1表达阳性的细胞。神经干细胞共培养6个月，传代14代。结论 分离培养的海马神经干细胞具有自我更新和增殖能力，可以长期培养。在不加任何诱导剂的自主分化条件下可以向神经元、胶质细胞分化。少突胶质细胞的培养需要不同的培养条件。分离培养的干细胞具有神经干细胞的特征。可用于基础和临床的相关研究。     

稳定增殖神经干细胞的实验研究

目的探讨稳定、可靠建立神经干细胞体外增殖的方法,并对增殖培养的细胞进行鉴定。方法获取胚胎大鼠的脑组织,通过加入神经生长因子和采用保留细胞联系技术操作,使脑组织中的神经干细胞在体外克隆增殖并稳定传代。以免疫荧光方法对增殖克隆的神经干细胞球进行鉴定。结果神经干细胞不断增殖形成神经干细胞球且神经干细胞能快速稳定传代增殖。培养的细胞为神经干细胞特异性巢蛋白(nestin)染色阳性细胞。结论在神经生长因子的作用下,利用保留细胞联系技术操作,神经干细胞可以在体外快速、稳定克隆增殖并传代。     

人胚胎神经干细胞的体外培养

目的：从人胚胎皮层分离神经干细胞，寻找其在体外培养的适合条件，方法：使用具有丝裂原作用的多种细胞生长因子。结合无血清细胞培养技术。从人胚胎皮层分离具有增殖能力的细胞群，在连续传代过程中，验证其自我更新能力和多分化潜能，免疫荧光染色检测Nestin抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达，并且流式细胞仪检测神经干细胞分化结果。结果：协同使用bFGF和EGF从人胚胎皮层分离的细胞群，具有自我更新能力和多分化潜能，表达胚胎早期细胞抗原-Nestin，加入LIF后细胞增殖速度加快，分化为神经元的比例增高，而单独采用bFGF、EGF或LIF培养的细胞迅速衰退，仅能培养3-5代。结论：协同使用丝裂原生长因子从人胚胎皮层分离的细胞时中枢神经系统的干细胞；bFGF、EGF和LIF协同使用是体外培养神经干细胞的较佳条件。     

无血清条件下体外分离培养鼠胚胎脑组织神经干细胞

背景：神经干细胞的体外培养成功为治疗中枢神经系统疾病提供了新的思路,但神经干细胞的分化和功能修复机制尚不甚清楚,移植后的细胞能否与体内细胞结合以及建立起正常的神经系统突触联系急需解决。 目的：在无血清条件下体外分离培养胚鼠神经干细胞,观察其生长及分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-03/2008-01在天津市环湖医院神经干细胞室完成。 材料：孕14~16 d的SD大鼠,由北京维通利华实验动物中心提供。 方法：取孕鼠胚胎的脑海马组织,通过机械分离和胰蛋白酶消化结合法体外分离培养神经干细胞,在含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子及B27的无血清DMEM/F12培养基中传代扩增。取原代培养7 d的神经干细胞,制备单细胞悬液,接种后加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液诱导3 d。 主要观察指标：倒置显微镜下观察神经干细胞的增殖分化过程,并行免疫荧光染色鉴定。通过细胞免疫化学染色检测诱导分化后的细胞类型。 结果：分离培养的神经干细胞在无血清培养基中不断分裂增殖,8 d左右即可形成胞体透亮、折光性好的干细胞球,悬浮生长,免疫荧光染色巢蛋白呈阳性表达。神经干细胞球诱导5 d,免疫细胞化学染色后可见胶质纤维酸性蛋白及神经元特异性烯醇酶呈阳性表达的细胞。 结论：体外无血清条件下,分离培养的神经干细胞生长状态良好,且具有自我更新和增殖能力,诱导后能够向神经元及星形胶质细胞方向分化。     

不同培养条件神经干细胞早期分化特征观察

目的 探讨不同培养条件对小鼠神经干细胞早期分化形态学的影响.方法 用无血清条件培养基、5%胎牛血清+条件培养基培养与单细胞克隆技术对小鼠胚胎脑组织进行分离、培养及诱导分化,在光学显微镜下观察培养细胞分化2 w内形态学变化,对培养细胞用免疫组织化学法鉴定.结果 无血清培养瓶内细胞分化早期呈极性排列,而5%胎牛血清+条件培养基培养组,克隆球间存在着广泛的网络结构,且单一神经干细胞核分裂旺盛,克隆球数目多且比较大.结论 小鼠神经干细胞间早期存在某种依赖关系,在适当的微环境中,神经球之间可能存在信息传递.     

新生大鼠海马区及室管膜下区神经干细胞分离、培养和分化特性

目的建立大鼠神经干细胞（NSCs）分离、培养方法，观察其生长、增殖和分化特点。方法利用无血清培养技术，从新生大鼠海马、室管膜下区分离NSCs，进行体外扩增培养、传代观察。采用荧光免疫细胞化学检测技术，观察鉴定NSCs及其分化结果。结果分离获取的细胞具有自我更新和增殖能力，原代及传代培养均可形成细胞克隆，克隆中的细胞巢蛋白（nestin）表达阳性，显微镜下观察见典型的干细胞特征，诱导后可分化神经元和星形胶质细胞。结论上法分离培养的细胞为具有自我更新和增殖能力的NSCs，可诱导分化为终末神经细胞。     

bFGF和BDNF对小鼠神经干细胞体外增殖分化的影响

目的观察碱性成纤维生长因子（bFGF）和脑源性神经生长因子（BDNF）对小鼠源性神经干细胞（NSCs）体外增殖及分化的影响。方法用无血清培养与单克隆技术对小鼠胚胎脑组织进行分离、培养,根据培养液中所加营养因子的不同将传代的NSCs分为bFGF组、BDNF组、bFGF＋BDNF组,观察不同组别对NSCs的定向分化作用。结果与bFGF和BDNF组相比,bFGF＋BDNF组细胞分化为神经元的比例较高（P〈0.05）。结论 bFGF可以提高BDNF诱导小鼠NSCs向神经元分化的比例。     

嗅鞘细胞诱导神经干细胞分化后神经元电生理特性的研究

目的探索大鼠嗅鞘细胞对神经干细胞(NSC)分化的影响,以及分化后神经元电生理特性。方法取新生鼠大脑皮质,原代培养大鼠NSC。NSC分为实验组和对照组,实验组将无血清培养的NSC中加入嗅鞘细胞条件培养液,对照组单纯无血清培养NSC。光镜下观察细胞分化情况,免疫组化法分别检测巢蛋白(nestin)、神经生长因子受体(NGFRp75)、神经丝蛋白(NF200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,膜片钳检测神经元电生理特性。结果实验组嗅鞘细胞主要诱导NSC分化为神经元,少量分化为胶质细胞。对照组NSC逐渐萎缩,最终死亡。分化后的神经元记录到快速激活、快速失活能被河豚毒素特异阻断的钠电流,以及慢激活、慢失活能被四乙铵特异阻断的延迟整流性钾电流。结论嗅鞘细胞能诱导NSC分化成神经元,分化后的神经元具有活跃的电生理特性。     

中药复方脑络欣通含药血清诱导大鼠胚胎神经干细胞增殖分化：与胎牛血清的比较

目的：比较中药复方脑络欣通药物血清与胎牛血清诱导大鼠胚胎神经干细胞增殖分化的差异。方法：分别采用脑络欣通药物血清和胎牛血清诱导大鼠胚胎神经干细胞增殖分化,应用相差显微镜和免疫荧光染色对其进行比较观察。结果：脑络欣通药物血清和胎牛血清均可诱导绝大多数神经干细胞分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。此外,脑络欣通药物血清还能一定程度上促进培养的神经干细胞增殖。前者诱导干细胞分化的进程比后者要慢,但其分化的神经元在细胞形态学上与发育成熟的神经元更为接近。结论：脑络欣通药物血清能够诱导神经干细胞分化,并使其分化更加成熟,且在一定程度上促进培养的神经干细胞增殖。     

Human fetal cortical and striatal neural stem cells generate region-specific neurons in vitro and differentiate extensively to neurons after intrastriatal transplantation in neonatal rats

Human fetal brain is a potential source of neural stem cells (NSCs) for cell replacement therapy in neurodegenerative diseases. We explored whether NSCs isolated from cortex and striatum of human fetuses, aged 6-9 weeks post-conception, maintain their regional identity and differentiate into specific neuron types in culture and after intrastriatal transplantation in neonatal rats. We observed no differences between cortex- and striatum-derived NSCs expanded as neurospheres in proliferative capacity, growth rate, secondary sphere formation, and expression of neural markers. After 4 weeks of differentiation in vitro, cortical and striatal NSCs gave rise to similar numbers of GABAergic and VMAT2- and parvalbumin-containing neurons. However, whereas cortical NSCs produced higher number of glutamatergic and tyrosine hydroxylase- and calretinin-positive neurons, several-fold more neurons expressing the striatal projection neuron marker, DARPP-32, were observed in cultures of striatal NSCs. Human cortical and striatal NSCs survived and migrated equally well after transplantation. The two NSC types also generated similar numbers of mature NeuN-positive neurons, which were several-fold higher at 4 months as compared to at 1 month after grafting. At 4 months, the grafts contained cells with morphologic characteristics of neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Many of neurons were expressing parvalbumin. Our data show that NSCs derived from human fetal cortex and striatum exhibit region-specific differentiation in vitro, and survive, migrate, and form mature neurons to the same extent after intrastriatal transplantation in newborn rats.     

无血清培养大鼠胚胎向神经干细胞的分化

背景：体外培养扩增获取大量、高纯度的神经干细胞是其移植应用的前提,无血清培养主要目的是去除血清中可能诱导神经干细胞分化的生长因子等干扰因素。 目的：在无血清条件下体外分离培养大鼠胚胎神经干细胞,并观察其生物学特性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2005-03/2006-03在河北医科大学第三医院中心实验室完成。 材料：14~16 d龄SD胎鼠2只,由河北医科大学实验动物中心提供。 方法：无菌条件下取胎鼠大脑皮质,剪碎后机械分离法制作单细胞悬液,加入含B27神经营养添加剂的无血清MEM/F12培养基进行培养,1周后传代。 主要观察指标：免疫荧光染色鉴定神经干细胞巢蛋白的表达及传代能力,加入含血清的MEM/F12培养基诱导分化1周后免疫组化检测细胞分化情况。 结果：培养48~72 h细胞聚集悬浮生长,形成典型的神经球,呈神经干细胞特异性抗原巢蛋白阳性表达。传代的神经干细胞置于BrdU培养液中5~7 d形成次代神经球,呈BrdU阳性,表明次代神经球中绝大部分细胞为传代后细胞分裂而来,具有传代能力,传代后加入含血清的培养基后可以分化为微管相关蛋白2阳性细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。 结论：利用无血清培养技术可成功从胎鼠脑皮质中分离培养出具有分裂增殖能力及多向分化潜能的神经干细胞。     

嗅鞘细胞对原代培养神经干细胞增殖、分化的影响

目的 观察嗅鞘细胞(OECs)对神经干细胞(NSCs)增殖、分化的影响.方法 新生大鼠脑OECs和NSCs原代培养,采用免疫荧光及免疫细胞化学方法鉴定相关细胞.取原代OECs分为2组,实验组去除培养孔的间隔,使OECs和NSCs共用一培养液体系;对照组不破坏培养孔的间隔,单独培养NSCs,其余同实验组.观察2组细胞增殖、分化情况.结果 原代培养的OECs表达神经生长因子受体(P75NGFR);原代培养的神经球表达巢蛋白(nestin),神经球分化的细胞表达神经丝200(NF200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP).增殖实验中,实验组NSCs数量较对照组明显增多,差异有统计学意义(P<0.05).诱导分化实验中,实验组4d、7d时NF200阳性细胞率较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),说明2种细胞共液培养时,OECs提高了NSCs向NF200阳性细胞分化率.结论 OECs可促进NSCs增殖,并提高了NSCs向神经元分化的效率.