反式二羟环氧苯并(a)芘所致人支气管上皮细胞POLK基因高表达

目的观察不同剂量反式二羟环氧苯并(a)芘(anti-BPDE)处理对人支气管上皮细胞(16HBE)POLK基因表达的影响。方法分别以0.25、0.50、1.00、2.00μmol/L的反式-BPDE1次或3次处理16HBE细胞,采用TaqmanMGB探针实时定量聚合酶链反应方法相对定量POLK和POLZ基因表达,同时对反式-BPDE转化的16HBE及肺癌H1299细胞POLK基因表达进行了分析。结果反式-BPDE1次处理及3次处理可诱导正常16HBEPOLK基因高表达。反式-BPDE转化16HBE和肺癌H1299细胞POLK基因表达明显增高,分别是正常16HBE的2.25和5.49倍。结论反式-BPDE处理可致16HBEPOLK基因高表达。     

反式二羟环氧苯并芘对人支气管上皮细胞中HER2/neu基因表达的影响

目的探讨环境致癌物苯并(a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞HER2/neu基因表达的影响。方法利用半定量RT-PCR、SYBR GreenI实时定量RT-PCR(QRT-PCR)、Western blot及免疫细胞化学方法分别检测经2.0μmol/L反式BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化细胞(16HBE-T)与对照DMSO溶剂组未恶性转化细胞(16HBE-N)之间HER2/neu基因mRNA和蛋白表达水平的差异,及两组细胞内HER2/neu蛋白表达定位分析。结果经几种不同方法检测反式BPDE恶性转化人支气管上皮细胞中HER2/neu基因mRNA和蛋白水平都比对照溶剂组细胞(16HBE-N)表达显著升高(P<0.05)。HER2/neu蛋白定位在胞膜。结论反式BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化存在HER2/neu表达增高,其可能与原癌基因HER2/neu被激活作用有关。     

叶绿酸对恶性转化细胞周期及体外生长的影响

目的研究叶绿酸对反式7，8二羟9，10环氧苯并(a)芘(反式BPDE)恶性转化人支气管上皮细胞系(16HBE)体外生长及细胞周期影响。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞术(FCM)，同时观察正常人支气管上皮细胞(16HBE)、反式-BPDE恶性转化细胞系、叶绿酸抗反式-BPDE恶性转化细胞系生长曲线和生长周期的变化以及经叶绿酸处理后的影响。结果BPDE恶性转化细胞系增殖活性明显大于正常细胞系(16HBE)，经100μmol／L叶绿酸抗BPDE恶性转化细胞组增殖活性较转化组有一定降低。经同样浓度叶绿酸处理的正常细胞组，未见降低细胞增殖活性作用。反式-BPDE恶性转化细胞组G0／G1期细胞周期比例明显少于正常组细胞。但经叶绿酸抗转化组G0／G1期比例有所提高，而经同样浓度叶绿酸处理的正常细胞组G0／G1期细胞周期比例无明显改变。结论对正常细胞无影响的一定浓度叶绿酸有抑制反式-BPDE恶性转化人支气管上皮细胞增殖活性的作用，并通过提高恶性转化细胞G0／G1期细胞周期比例而影响细胞周期的进程，从而改变恶性细胞的增殖和分化。     

E-cadherin、Cyclin D1和Cyclin E在叶绿酸抗细胞恶变中表达研究

目的研究叶绿酸干预反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(反式-BPDE)恶性转化人支气管上皮细胞系16HBE中的细胞周期相关基因及蛋白的影响。方法应用半定量RT-PCR技术检测叶绿酸干预反式-BPDE恶性转化细胞中各组细胞E-cadherin基因mRNA表达差异;荧光细胞免疫化学技术检测E-cadherin、Cyclin D1及Cyclin E蛋白水平。结果反式-BPDE诱导恶变细胞组出现E-cadherin基因在mRNA和蛋白水平表达缺失,而经叶绿酸抗转化组该基因表达正常。Cyclin D1、Cyclin E蛋白在正常对照组中表达阴性,而在反式-BPDE恶性转化组中上述两种蛋白呈现高表达,通过叶绿酸干预抗转化组中其表达明显下调。结论叶绿酸抗反式-BPDE致细胞恶变作用与其避免抑癌基因E-cadherin的表达缺失有关。叶绿酸在拮抗反式-BPDE致癌中具有影响细胞周期素CyclinD1和CyclinE表达作用。     

苯并(a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘诱发人支气管上皮细胞恶性转化

以不同浓度的苯并 (a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘 (BPDE)多次处理人支气管上皮细胞 16HBE ,并观察转化细胞的恶性特征。发现BPDE可诱导 16HBE细胞恶性转化 ,形成转化灶。转化灶细胞失去接触抑制 ,排列紊乱 ,无方向性 ,交叉重叠生长。转化的细胞可在软琼脂上生长 ,各浓度处理组细胞集落形成率均显著高于对照组 ,有良好的剂量—反应关系。经BPDE处理的细胞在裸鼠体内成瘤 ,病理学诊断为鳞状细胞癌。本实验以反式BPDE成功地诱发了人支气管上皮细胞恶性转化 ,为后期进一步研究其致癌的分子机制、寻找致癌相关基因提供了理想的生物学材料。     

致癌物诱导恶变细胞中线粒体高变区序列分析

目的检测苯并（a）芘代谢产物反式二羟环氧苯并芘（反式-BPDE）及结晶型硫化镍（NiS）诱发永生化人支气管上皮细胞系（16HBE）恶性转化过程中线粒体DNA控制区序列变化。探讨线粒体DNA控制区在环境致癌物苯并（a）芘及硫化镍致癌作用中是否存在靶分子序列。方法 应用银染PCR-单链构向多态性（SSCP）方法及测序方法分析恶变细胞中线粒体DNA高变区的序列变化。结果 经反式-BPDE和NiS诱导恶变的人支气管上皮细胞系线粒体高变区均未发现异常改变。结论 线粒体基因控制区可能并非是化学致癌物诱发肺癌的靶序列。     

恶性转化人支气管上皮细胞基因组甲基化观察

目的对反式二氢二醇环氧苯并芘（anti-BPDE）和结晶型硫化镍（NiS）恶性转化人支气管上皮细胞（Hu-man bronchial epithelia,16HBE）基因组DNA甲基化状况进行研究,寻找DNA甲基化异常的基因片段,探讨反式-BPDE和NiS的表遗传致癌机制.方法采用限制性指纹识别技术（MSRF）,对反式-BPDE和NiS分别诱导转化及裸鼠成瘤的4种人支气管上皮细胞株基因组进行分析;对异常甲基化基因阳性片断采用TA克隆技术构建测序载体,对测序结果进行同源性分析比较.结果发现结晶型NiS恶性转化人支气管上皮细胞基因组存在高甲基化的DNA片段,其中一基因片段与编码鼻咽癌易感性蛋白ANKRD11基因序列99%同源.另一基因片段与HOXA3基因序列99%同源;未发现反式BPDE恶性转化人支气管上皮细胞基因组DNA异常甲基化基因片段.结论结晶型NiS恶性转化人支气管上皮细胞DNA的高度甲基化可能导致基因表达抑制.可能是结晶型NiS致癌的一种表遗传机制;反式BPDE致癌过程可能与基因组磷酸胞苷酰（CpG）岛甲基化异常关系不明确.     

Ras基因家族在二羟环氧苯并(a)芘恶性转化细胞中的表达研究

目的检测环境致癌物苯并(a)芘代谢物二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞Ras基因家族表达的影响。方法以正常人支气管上皮细胞为对照组,经BPDE恶性转化人支气管上皮细胞为实验组,分别利用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学方法,检测Ras基因家族在mRNA和蛋白水平表达变化。结果RT-PCR实验表明,BPDE恶性转化细胞H-Ras、K-Ras和N-Ras mRNA表达水平分别是正常细胞的2.237、1.254和3.616;Western blot实验显示,H-Ras、K-Ras和N-Ras蛋白表达量分别是正常细胞的1.273倍、1.547和1.600倍;免疫细胞化学实验表明,恶性转化细胞H、K和N-Ras蛋白表达明显强于正常细胞。结论BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化存在H-Ras、K-Ras和N-Ras基因过表达。     

二羟环氧苯并芘对人支气管上皮细胞N-Ras基因表达的影响

目的 探讨环境致癌物苯并(a)芘代谢物二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞N-Ras基因表达的影响.方法利用RT-PCR和Western blot方法,分别检测N-Ras基因在经BPDE恶性转化细胞中mRNA和蛋白表达水平的变化.利用免疫细胞化学方法检测N-Ras基因在经BPDE恶性转化细胞中定位和蛋白表达量的变化.结果 RT-PCR和Western blot实验表明,BPDE恶性转化细胞N-Ras基因的mRNA和蛋白水平分别是正常细胞的3.616和1.600倍.免疫细胞化学实验显示,在BPDE恶性转化细胞和正常细胞中,N-Ras基因在细胞膜和细胞浆中均有表达,且两者相比,前者中的N-Ras蛋白表达明显强于后者.结论 N-Ras基因可能在BPDE的致癌机制中起着重要作用.     

反式二氢二醇环氧苯并芘诱发的细胞DNA断裂损伤

目的　研究反式二氢二醇环氧苯并芘 [Anti 7,8 dihydrodiol 9,10 epoxidebenzo(a)pyrene ,BPDE]诱导的恶性转化的人支气管上皮细胞 (Humanbronchialepithelialcells ,HBE)及其裸鼠成瘤细胞中DNA断裂损伤情况。方法　单细胞凝胶电泳法 (Singlecellgelelectropheresis ,SCGE)。结果　反式BPDE诱导的恶性转化的HBE及其裸鼠成瘤细胞与对照组细胞相比各指标差异均有显著性 (P <0 0 1) ,各指标的高剂量与低剂量组之间差异也有显著性 (P <0 0 5 )。结论　反式BPDE可导致DNA断裂损伤 ,其损伤程度与剂量有一定关系。     

结晶型硫化镍诱发细胞恶性转化相关蛋白硫氧还原蛋白过氧化物酶2的鉴定

目的利用蛋白质组学技术识别结晶型硫化镍（NiS）诱发人支气管上皮细胞恶性转化相关蛋白的差异表达，探讨镍致癌的分子机制。方法应用二维凝胶电泳与相应软件分析结晶型NiS诱发细胞恶性转化后蛋白质组变化，基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱（MALDI-TOF-MS）结合数据库检索鉴定恶性转化相关蛋白。结果获得分辨率和重复性较好的二维凝胶电泳图谱，在相对分子质量14400～94000、等电点3～10范围内分离出约700个不同蛋白质点，对差异表达明显的等电点约6，相对分子质量约25000的蛋白质点进行质谱分析，鉴定出等电点为5．66，相对分子质量为21890的蛋白／硫氧还原蛋白过氧化物酶2（Peroxiredoxin 2，PDX2），并发现该蛋白在恶性转化细胞中高表达。结论蛋白PDX2可能是参与结晶型NiS诱发人支气管上皮细胞恶性转化过程的重要蛋白分子，与细胞恶性转化有关。     

三种丙型肝炎病毒核蛋白在人肝癌细胞的表达

目的用基因芯片分析丙型肝炎病毒（HCV）三种基因型HCV—1b、HCV-2a和HCV-4d核蛋白在人肝癌细胞系（Huh-7）的基因表达,重新认识HCV核蛋白功能及其致病机制。方法建立表达HCV三种基因型核蛋白的Huh-7细胞系,提取总RNA制备探针。与Affymetrix人基因芯片HG-U133杂交。对基因表达改变≥3或1．5倍的基因,通过Affymetrix网站用NetAffx进一步分析,并按生物学功能分类。结果HCV—1b核蛋白引起16个基因表达改变,其中免疫反应基因PF4V1和SPP1分别上调3．4和4．4倍;HCV-2a核蛋白对免疫反应基因CXCL5和凋亡基因BTF分别下调3．4和3．1倍,但对凋亡基因HRK、LZTS1则能上调3．2和3．4倍;与HCV-1b和HCV-2a核蛋白相比,HCV-4d核蛋白可引起111个基因表达改变,对基因表达谱有更明显的影响。若设定基因表达改变≥1．5倍有意义,HCV—1b和HCV-2a核蛋白可引起若干相同基因的改变。结论HCV三种基因型核蛋白引起的基因表达谱各有特点,主要涉及免疫反应、凋亡、信号传导等基因,这对重新认识HCV核蛋白功能及致病机制均有重要意义。     

双向电泳-质谱技术筛选克山病血清差异蛋白

目的比较克山病患者与健康者血清蛋白表达谱,探讨克山病发病机制,寻找与克山病发生相关差异蛋白。方法从克山病病区选择8例慢型克山病,病区对照以及非病区对照各8例,应用双向凝胶电泳技术分离克山病患者同健康者的差异蛋白点,基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱鉴定差异蛋白。结果凝胶图像分析显示9个差异蛋白质点,经质谱鉴定确定8种蛋白。3种蛋白在克山病组较非病区健康组上调,其功能主要与脂类代谢,免疫调节,凋亡抑制有关。3种蛋白下调,主要与细胞内铁离子平衡密切相关。克山病组较病区健康组2种蛋白表达上调,主要与蛋白酶抑制等功能有关。结论该研究发现触珠蛋白、血清白蛋白和α1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、α2-HS糖蛋白可作为克山病的诊断与预后的候选生物学指标,具有重要意义。     

SELDI技术检测反义寡核苷酸作用前后肝癌细胞培养液的差异蛋白

目的利用针对人端粒酶RNA(hTR)的反义寡核苷酸(ASODN)和正义寡核苷酸(NODN)作用于人肝癌细胞SMMC-7721,比较ASODN和NODN作用后细胞培养液蛋白的变化。方法利用SELDI技术检测差异蛋白的表达变化。对照组为未加任何处理因素的SMMC-7721细胞。结果SELDI技术检测发现,ASODN作用组有40个差异蛋白分子低表达,3个差异蛋白分子高表达。NODN作用组有37个差异蛋白分子低表达,6个差异蛋白分子高表达。所有差异蛋白分子量均小于10 000 Da。ASODN作用组中有3个低表达蛋白在NODN作用组高表达,分子量分别为3 011.99 Da、3 048.28 Da和3 248.75 Da。结论ASODN和NODN作用SMMC-7721细胞后细胞培养液中所表达的差异蛋白十分相似。     

二十碳五烯酸对人树突状细胞成熟过程中基因表达谱影响的研究

目的研究二十碳五烯酸(EPA)对人树突状细胞成熟过程中基因表达谱的影响。方法采用GM-CSF及IL-4诱导人外周单核细胞获得非成熟树突状细胞,然后将细胞分为三组处理,A组,维持树突状细胞的未成熟状态;B组,LPS(100ng/ml)作用48h诱导树突状细胞的成熟;C组,经EPA(50μmol/L)预处理24h后再予以LPS(100ng/ml)诱导树突状细胞的成熟。用低通量的cDNA表达谱芯片检测三组细胞基因表达谱的情况。RT-PCR法验证相关差异表达基因的结果。结果在LPS诱导树突状细胞成熟的过程中共有29条基因表达增加,9条基因表达下降。但是经EPA孵育24h后再予以LPS诱导"成熟"的人树突状细胞其基因表达水平发生明显变化,与未经EPA处理的成熟树突状细胞比较,共有15条基因出现差异表达,其中在29条本该上调的基因中有11条基因表达出现下降,1条基因出现上调。在9条本该表达下调的基因中有1条基因出现上调,2条明显下调。RT-PCR验证了其中6条基因的芯片结果。结论 EPA对树突状细胞的成熟过程中多种基因的表达具有明显的抑制作用,其范围涉及细胞因子及抗原提呈分子等不同基因。