Ddx3基因在不同日龄小鼠睾丸组织中的表达

目的:观察小鼠睾丸初次生精过程中的发育特点;检测Ddx3基因与蛋白在小鼠睾丸生精过程中的表达模式;探讨Ddx3基因对小鼠睾丸生精的影响。方法:采用HE染色与PAS染色的方法观察不同日龄小鼠睾丸组织的石蜡切片;用荧光实时定量PCR的方法检测Ddx3 mRNA在小鼠睾丸精子发生过程中的表达;采用免疫组织化学和Western blot方法检测DDX3蛋白在小鼠睾丸初次生精过程中的表达特点和细胞内定位。结果:HE染色结果显示4、13、21、35、42和60日龄是小鼠睾丸发生初次生精过程的特定阶段;荧光实时定量PCR结果显示Ddx3 mRNA在4日龄以后小鼠睾丸组织中均有表达,于35日龄开始明显增高,随后表达水平保持稳定;Western blot显示DDX3蛋白在35、42和60日龄小鼠睾丸生精小管中出现特异性表达并逐渐增高;免疫组织化学法显示DDX3蛋白主要在初级精母细胞和精子细胞的细胞质和细胞核中表达。结论:DDX3蛋白在小鼠初次精子发生过程中呈现特异性表达,提示Ddx3基因可能在精母细胞与精子细胞的发育中发挥作用。     

DNAJB8在小鼠睾丸生殖细胞中的表达定位

目的：探究DNAJB8［DnaJ heat shock protein family（HSP40） member B8］在小鼠精子发生过程中的表达模式。方法：分别采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测小鼠各脏器、不同发育时期睾丸组织以及不同生精细胞DNAJB8的mRNA转录和蛋白表达量;免疫荧光检测DNAJB8在生精细胞中的表达定位。结果：DNAJB8基因在睾丸组织中特异表达,从小鼠出生后21 d（P21）即圆形精子阶段开始DNAJB8 mRNA保持较高的表达,而DNAJB8蛋白在精子变形晚期出生后35 d（P35）才开始表达。DNAJB8蛋白主要定位在晚期精子细胞及精子鞭毛中段。结论：DNAJB8可能参与小鼠精子变形晚期的发育过程。     

减数分裂特异基因sycp_1在小鼠精母细胞中的表达

目的 检测减数分裂基因sycp1在小鼠精子发生过程中的特异表达及其蛋白产物在小鼠精母细胞中的定位.方法 利用半定量RT-PCR技术分析了sycp1基因在1,2,3,5,8周龄小鼠睾丸发育过程中的阶段特异性表达,以及脑、心脏、肺、肝脏、肾脏、脾、胸腺和睾丸中的组织特异性表达;采用免疫组织化学染色方法检测了SYCP1在小鼠曲细精管中的细胞定位;通过间接免疫荧光染色初步显示了SYCP1在粗线期精母细胞中的分布.结果 RT-PCR分析证实sycp1 mRNA具有明显的组织特异性和阶段特异性表达特征;免疫组织化学染色结果显示,SYCP1只存在于减数分裂期的精母细胞核内;间接免疫荧光分析表明SYCP1在粗线期精母细胞核内的分布与核染色体的分布相一致.结论 SyCp1为减数分裂特异基因,其编码蛋白在雄性小鼠精母细胞核内的表达与SC的形成和成熟同步,参与了同源染色体之间的联会和重组.     

Boule基因在小鼠精子发生过程中的动态表达

目的:研究雄性不育相关基因Boule在小鼠出生后首个精子发生波中的动态表达,探讨Boule在精子发生过程中的调控作用。方法:运用免疫印迹法分析BOULE蛋白在多组织中的表达情况。运用实时荧光定量、免疫组织化学和免疫荧光技术检测Boule m RNA和BOULE蛋白在雄性小鼠出生后首个精子发生波各个时间点中的表达。结果:1免疫印迹法显示BOULE蛋白在睾丸中特异性高表达,在出生后16 d睾丸可被检测到,并在随后的发育中睾丸和成年睾丸持续表达;2实时荧光定量方法证实Boule m RNA在雄鼠出生后14 d睾丸中可被检测到,20 d呈现表达高峰;3免疫组织化学显示在精母细胞及圆形精子细胞胞质中存在BOULE蛋白阳性信号。结论:Boule在精子发生过程中的表达是在发育水平精密调控的,在粗线期精母细胞和圆形精子细胞阶段的特异表达提示Boule可能在精母细胞进程和圆形精子细胞中发挥作用。     

跨膜蛋白CMTM2在人睾丸和精子中的表达及定位

目的：通过研究跨膜蛋白CMTM2在睾丸和精子中的表达来探讨CMTM2蛋白在男性生殖系统中潜在的功能。方法：Western blot方法检测CMTM2在人睾丸及精子中的表达,免疫组织化学及组织免疫荧光方法检测CMTM2在人睾丸组织中的定位,TRITC-CMTM2及FITC-Hoechst免疫荧光双染法检测CMTM2在人精子顶体反应前后的定位。结果：CMTM2在人睾丸及精子中均有表达,在睾丸组织中CMTM2定位于各级生精细胞的细胞膜,睾丸组织冰冻切片免疫荧光检测的结果与免疫组织化学一致,进一步证实CMTM2存在于睾丸各级生精细胞的细胞膜,在精子中则定位于核后区附近。以TRITC-CMTM2及FITC-Hoechst免疫荧光双染法检测CMTM2在人精子顶体反应前后的定位,在顶体反应前后,CMTM2在人精子的定位及表达量未发生改变。结论：CMTM2在人睾丸和精子中均有表达,其表达定位具有细胞特异性和区域特异性,提示其可能在人睾丸精子发生和精卵融合过程中发挥作用,是男性不育研究的靶基因。CMTM2在男性生殖系统中的表达呈现细胞与生精区域的特异性,提示其高度参与生精功能,但目前针对CMTM2在男性生殖系统与精子生成过程中的作用仍未明确,今后可以采用体外受精 胚胎移植等技术进一步研究CMTM2的作用。     

慢性铝暴露对小鼠精子质量及睾丸细胞焦亡的影响

目的 研究铝暴露对小鼠精子质量及睾丸细胞焦亡的影响。方法 将12只成熟雄性c57bl/6j小鼠分为两组：对照组(n=6)、铝模型组(n=6),对照组用蒸馏水灌胃，铝模型组采用10 mg/(kg·d) AlCl₃灌胃，8周后，获取小鼠睾丸组织、附睾组织及附睾精子。对附睾精子进行精子质量分析，对睾丸及附睾HE染色进行病理检测；运用PCR、免疫组化检测睾丸组织细胞焦亡关键基因的mRNA和蛋白表达。结果 与对照组相比，铝暴露的小鼠睾丸重量、附睾重量、精子活力、精子数量均显著下降(P<0.01),精子畸形率显著增加(P<0.01)。睾丸形态学观察结果显示，铝暴露小鼠睾丸生精小管中细胞排列紊乱，生精小管的面积和直径减小，管内精子减少。PCR及免疫组化结果显示，铝暴露小鼠睾丸组织中焦亡关键基因Nlrp3、Caspase-1、Gsdmd和IL-1b的mRNA及蛋白表达均上调(P<0.01)。结论 铝暴露可降低小鼠的精子质量，促进睾丸细胞焦亡，从而损伤雄性生殖系统。     

亚慢性苯吸入暴露抑制小鼠单倍体精子核蛋白基因的表达

目的：探讨苯对小鼠精子生成损伤的主要阶段。方法：6～8周龄C57BL/6J雄性小鼠,按体质量随机分为3组,对照组、1 ppm和100 ppm苯暴露组,模拟职业暴露情况,实施每天8 h,每周5 d,共13周的亚慢性动式吸入染毒。HE染色观察睾丸组织病理学改变。选取精子发生中阶段特异性表达基因作为不同阶段精子的marker,选定的marker基因有代表未分化型精原细胞的Plzf,分化型精原细胞的Stra8,初级精母细胞的Sycp3,圆形精子的过渡蛋白Tnp1、Tnp2,长形精子的Akap4,以及鱼精蛋白Prm1、Prm2,采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测marker基因mRNA表达。结果：苯暴露组小鼠睾丸组织呈现嗜酸性染色增强,1 ppm组出现少量核溶解、细胞脱落等改变;100 ppm组小鼠睾丸生殖细胞变性、坏死明显增多,管腔中心无（或少）细胞的曲细精管数量明显增多,表明亚慢性苯暴露可引起小鼠睾丸的病理改变。苯暴露组Plzf、Stra8、Sycp3、Akap4 的mRNA表达均未显示统计学差别,而1 ppm组鱼精蛋白Prm2的mRNA表达显著降低（P＜0.01）;100 ppm组过渡蛋白Tnp1、Tnp2,鱼精蛋白Prm1、Prm2的mRNA表达均显著降低（P＜0.05）。结论：亚慢性苯吸入暴露可导致小鼠睾丸组织的病理改变,下调Tnps和Prms mRNA表达,主要影响单倍体精子细胞核内组蛋白被鱼精蛋白取代的过程。     

p38 MAPK在小鼠睾丸出生后不同发育阶段的表达

目的：探讨p38 MAPK在小鼠睾丸出生后不同发育阶段的表达．方法：应用免疫组织化学SABC法检测1～7周龄小鼠睾丸p38MAPK的表达和定位．结果：在2周龄小鼠睾丸生精小管上皮中即可观察到p38MAPK免疫阳性反应，免疫反应阳性细胞为精原细胞；3，4和5周龄小鼠睾丸仅有个别生精小管上皮可见p38 MAPK免疫阳性反应；6，7周龄小鼠睾丸中p38 MAPK表达较丰富，免疫反应阳性细胞为精原细胞和初级精母细胞，免疫阳性反应物均主要位于细胞核内．在7周龄小鼠睾丸中还可见到部分间质细胞呈p38 MAPK阳性，免疫阳性反应物主要位于细胞质内．结论：p38 MAPK可能对生精细胞的增殖分化以及雄激素的分泌具有调控作用。     

Plac8l1在小鼠精子发生过程中的表达特征研究

目的：探讨Plac8l1（placenta-specific 8 like 1）基因在小鼠睾丸组织的表达特征,及其与精子发生的相关性。方法：经生物信息学方法初步筛选到一个睾丸特异性表达候选基因Plac8l1,并推测其可能与小鼠精子发生相关;采用半定量RT-PCR和实时定量RT-PCR对Plac8l1表达的时空特异进行了研究;应用原位杂交技术对Plac8l1 mRNA在成年小鼠睾丸中的细胞类群表达特征进行初步研究;通过构建过表达PLAC8L1-EGFP重组蛋白质粒及生物信息学分析进行亚细胞定位研究与功能预测。结果：①Plac8l1是1个睾丸特异性转录基因。②在成年小鼠,Plac8l1只在睾丸和附睾组织发生特异性转录,而且睾丸中的表达水平明显高于附睾[睾丸vs. 附睾=[（1.000±0.000） vs. （0.036±0.018）,P=0.000]。③随着小鼠精子发生的起始,睾丸中Plac8l1转录水平逐渐升高（P=0.000）。④mRNA原位杂交结果显示Plac8l1 mRNA主要定位在成年小鼠睾丸中的间质细胞和精母细胞。⑤经生物信息学分析,PLAC8L1也有着一个类似于PLAC8的功能域,过表达重组蛋白显示PLAC8L1在细胞膜上聚集。结论：Plac8l1是1个睾丸特异性基因,可能与精子发生过程中的精母细胞分化相关;PLAC8L1具有1个富含半胱氨酸的PLAC8结构域,这一结构域可能介导了PLAC8L1在细胞膜上聚集并与其他蛋白相互作用,并可能在精母细胞分化中发挥重要作用。     

生精相关基因Znf230在小鼠睾丸及精子中的表达和定位研究

目的：应用小鼠Znf230多克隆抗血清,对Znf230在小鼠睾丸及精子中的表达及定位进行研究。方法：用RT-PCR分析、Western blot检测、免疫组织化学和免疫荧光染色方法研究Znf230在小鼠不同发育阶段睾丸组织及精子中的表达及亚细胞定位情况。结果：小鼠从出生到成年的发育过程中,Znf230的表达水平基本上是稳定的。小鼠出生6 d和12 d时,该蛋白在精原细胞核中表达,从出生18 d到精子发育成熟这个阶段,该蛋白转移到圆形精子细胞、延长精子细胞和精子中表达,具体定位于顶体区域和精子的尾部。结论：Znf230可能在小鼠生精过程中起着重要的作用。     

版纳微型猪近交系TDRP1基因克隆、鉴定及mRNA的组织表达特性

目的 克隆版纳微型猪近交系(BMI)不育和可育公猪TDRP1基因,分析其序列及mRNA表达水平上的差异,预测其蛋白质功能,并检测该基因在可育公猪中的组织表达分布情况.方法 以猪NM_001198925序列为模板,设计特异引物,采用RT-PCR方法结合测序获得TDRP1的cDNA序列并进行生物信息学分析;采用半定量PCR方法检测TDRP1在不育和可育公猪睾丸中的表达规律,分析该基因在可育公猪17种组织中的表达特征.结果 获得了BMI TDRP1基因的编码区序列(GenBank登录号:KJ186786),生物信息学分析表明其编码186个氨基酸,蛋白质相对分子质量(Mw)为20.49 ×10³,等电点(pI)为5.86,无信号肽,有94.1%的概率位于细胞核,含有1个亮氨酸富集的核输出信号.不同物种的氨基酸序列比对表明猪TDRP1与人、恒河猴、小鼠和大鼠等哺乳动物的TDRP1相似性在73%～83.2%之间,其中与人、恒河猴的相似性较高.mRNA表达分析表明,TDRP1在BMI不育和可育公猪睾丸间表达水平差异无显著,在精囊腺和前列腺中高表达,在睾丸和小脑中中度表达,在大脑和肾脏中低表达,在其余组织中不表达.结论 成功克隆了BMI TDRP1基因的全长编码区序列并发现了BMI特有的2个SNP位点;TDRP1基因在BMI不育和可育公猪间序列完全一致,睾丸mRNA表达水平差异无显著性,多组织转录谱分析表明该基因存在明显的组织差异表达现象,在精囊腺和前列腺中有较高表达量,为深入研究TDRP1基因在精子发生方面的作用奠定了基础.     

小鼠睾丸组织特异表达基因Rnf148的鉴定及其编码E3泛素连接酶的功能分析

目的 研究小鼠Rnf148基因表达的时空特异性及其环指结构域的E3泛素连接酶功能。 方法 提取不同成年小鼠组织、不同胚胎期组织和出生后小鼠睾丸组织的总RNA,通过实时荧光RT-PCR和Northern杂交分析小鼠Rnf148基因的表达谱。构建包含整个Rnf148蛋白的环指结构域与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的融合蛋白原核表达载体,在BL21细菌中诱导表达后,经GST琼脂糖凝胶纯化GST-Rnf148重组蛋白。体外泛素化反应试验检测GST-Rnf148重组蛋白的E3泛素连接酶功能。 结果 在小鼠13种不同器官组织中,Rnf148 mRNA仅存在于睾丸组织中。进一步Northern杂交验证了只在小鼠睾丸组织表达一个1.2 kb左右的Rnf148基因mRNA片段。小鼠Rnf148基因在胚胎期及出生后3周内不表达,出生后21 d开始表达,25 d后达到表达高峰并一直持续表达。实验成功诱导表达并纯化了GST-Rnf148重组蛋白,体外蛋白泛素化反应显示该重组蛋白具有E3泛素连接酶的功能。 结论 小鼠Rnf148基因特异地表达在出生3周后的睾丸组织中,Rnf148蛋白的环指结构域具有泛素连接酶活性。     

维生素D受体在C57BL/6小鼠十二指肠中的定位表达分析

目的 为探讨维生素D受体（vitamin D receptor,VDR）在C57BL/6小鼠十二指肠中的定位与表达,研究维生素D系统与肠道发育过程的相关性。方法 利用实时定量PCR （quantitative PCR,qPCR）、苏木精伊红染色、免疫荧光染色、免疫印迹（Western blotting,WB）的检测技术,对C57BL/6小鼠十二指肠中VDR定位表达做定性与定量的分析。结果 VDR的mRNA在C57BL/6小鼠十二指肠组织中的表达在其出生的第21天达到峰值。此外,VDR主要分布在C57BL/6小鼠十二指肠上皮细胞和平滑肌细胞的胞质中。对组织样品的WB检测显示,C57BL/6小鼠十二指肠发育过程中,VDR没有发生明显的核转位。结论 从分子生物学角度分析了VDR在C57BL/6小鼠十二指肠不同生长发育阶段的表达规律,为了解和完善VDR在肠道中的作用奠定理论基础。     

Expression profile of a novel germ cell-specific gene,TSCPA, in mice and human

In order to identify novel genes involved in spermatogenesis, testis cDNA samples from Balb/C mice of different postnatal days were hybridized with the whole mouse genome Affymetrix chip to screen the testis-specific genes. The characteristics of the selected genes were analyzed by RT-PCR as well as other bioinformatic tools. A novel differentially expressed testis-specific gene （GenBank Accession No： NM_029042） in the developmental stages of testes was identified, and named TSCPA. Cellular mapping prediction of TSCPA indicated that its protein was probably expressed in nuclei, and one putative domain （aa 332 377） was anchoring domain of cAMP-dependent type Ⅱ PK. The result of subcellular localization of GFP-TSCPA fusion protein in Cos-7 cells showed that TSCPA protein was expressed in nuclei. RT-PCR analysis revealed that TSCPA was expressed specifically in mouse and human testis. TSCPA gene was expressed weakly in 21-day-old mouse testis and the expression was increased gradually from 38th day to 6th month of mouse testes. No expression of hTSCPA was found in cryptorchidism and Sertoli-cell-only syndrome patients. It was concluded that the expression profile of TSCPA in human and mice indicated that TSCPA might play an important role in spermatogenesis.     

MAPK信号转导通路在人参多糖诱导白血病K562细胞凋亡中的作用

目的 探讨人参多糖诱导白血病K562细胞凋亡的机制。方法 将对数生长期K562细胞分成对照组和人参多糖组,对照组细胞常规培养,人参多糖组细胞培养体系中加入人参多糖0.4 g/L。各组细胞培养48 h后,流式细胞术和Hoechst 33258染色法检测K562细胞凋亡情况;RT-PCR检测细胞p38、JNK基因表达;采用免疫荧光实验检测细胞中p-p38、p-JNK蛋白表达,测定Caspase-3的活性;Western blotting检测细胞中p38、JNK、p-p38、p-JNK、cleaved Caspase-3蛋白的变化。结果 与对照组比较,人参多糖组K562细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）,出现明显的细胞核固缩现象,K562细胞p38 mRNA与JNK mRNA明显增多。免疫荧光检测显示,p-p38、p-JNK、cleaved Caspase-3表达明显增强且向胞核转移;Western blotting检测显示,人参多糖组K562细胞p38、JNK总蛋白无明显变化（P＞0.05）;p-p38、p-JNK、cleaved Caspase-3有增加的趋势（P＜0.05）。结论 人参多糖能促进K562细胞凋亡,其作用可能是通过影响MAPK信号传导通路实现的。     

骨桥蛋白在雄性小鼠生殖系统中的表达及意义

目的:检测骨桥蛋白(OPN)在小鼠睾丸、附睾、精子中的表达,探讨其意义。方法:用免疫组织化学方法检测OPN在正常小鼠睾丸及附睾中的表达情况,免疫细胞荧光法检测OPN在小鼠精子中的表达情况,分析OPN与雄性小鼠生殖能力的关系。结果:OPN在小鼠睾丸、附睾组织及精子上均具有特征性表达。在睾丸中,OPN表达于Sertoli细胞、Leydig细胞以及各级生精细胞,尤其是精原细胞、精子细胞和精子的胞质中;附睾内,OPN的表达主要见于各段上皮主细胞胞质中,部分基细胞、亮细胞中也可见到免疫阳性反应。并且附睾头部的免疫阳性染色相对较弱;免疫荧光染色则将OPN定位于附睾尾精子的顶体帽区及鞭毛。结论:小鼠睾丸、附睾及精子中均存在OPN的特异性表达,OPN可能参与精子的发生及成熟过程,并与精子的活力和受精能力密切相关。