碱性鞘磷脂酶在结肠癌中作用研究进展

碱性鞘磷脂酶(alkaline sphingomyelinase, alk-SMase)是消化肠道中鞘磷脂的关键酶。当碱性鞘磷脂酶基因突变或去糖基化蛋白结构变化时其活性下降，鞘磷脂消化水解作用减弱，代谢活性产物减少，导致细胞增生、凋亡、炎症等失去调控，最终诱导癌症发生。有望通过对碱性鞘磷脂酶深入研究，能鉴定和确认突变型碱性鞘磷脂酶作为一种特异性更强、灵敏度更高的肿瘤标记，为结肠癌的早期诊断、早期治疗、疗效评价及预后判断提供更有效方法。     

Smad3基因剔除小鼠的繁殖与基因型鉴定

目的为进一步深入研究Smad3基因在脊椎动物发育中的重要作用,对Smad3基因剔除小鼠进行保种和繁育研究.方法采用基因剔除杂合子小鼠进行保种,通过PCR和Southern杂交对杂合子小鼠交配所产生的后代进行基因型鉴定,纯合子小鼠和野生型小鼠用于表型分析,杂合子小鼠用于留种和繁殖生产.结果采用PCR方法对278只子代小鼠进行了基因型鉴定,83只为野生型,133只为杂合子,62只为纯合子.结论Smad3基因剔除突变能稳定遗传.采用杂合子小鼠保种,子代小鼠三种基因型比例符合孟德尔遗传定律.     

热休克因子1基因剔除小鼠的遗传特征及基因型分析

为观察热休克因子 1基金剔除小鼠的遗传特征和基因型 ,摸索获得较多纯合子的繁殖技术 ,建立 3组繁殖组合方式 :1野生型♂×野生型♀组 ;2杂合子♂×杂合子♀组 ;3纯合子♂×杂合子♀组 ,并比较各组子代的基因型。结果表明 ,杂合子♂×杂合子♀组和纯合子♂×杂合子♀组 ,获得纯合子子代分别为 1 0 .8%和 2 2 .0 %。纯合子♂×杂合子♀组每胎产仔数 ( 4 .3只 /胎 )较野生型♂×野生型♀组 ( 6.5只 /胎 )及杂合子♂×杂合子♀组 ( 6.4只 /胎 )少。通过 HSF1剔除鼠的不同繁殖方法的比较及遗传特性观察 ,揭示了获得较多纯合子 HSF1剔除小鼠的繁殖技术。     

Claudin家族基因剔除小鼠表型的研究进展

密封蛋白(Claudin)是细胞间紧密连接的骨架蛋白,参与维持紧密连接的各种功能,其异常表达可破坏上皮细胞及内皮细胞的结构,导致其功能严重受损。近年来,关于Claudin基因不同生理作用的研究越来越受到人们的关注,基因剔除技术将在整体动物水平研究基因功能成为可能。该文就Claudin家族基因剔除后的小鼠表型进行综述,旨在了解Claudin基因的生理功能。     

Sumf2条件性基因剔除小鼠模型的建立及初步表型分析

目的建立Sumf2条件性基因剔除小鼠模型,为整体水平研究Sumf2基因的生物学功能创造条件。方法运用生物信息学,采用ET克隆、同源重组、显微注射等技术成功建立Sumf2条件性基因剔除小鼠模型,并通过该模型与Ella-cre转基因小鼠交配,获得Sumf2基因剔除小鼠模型,通过PCR、RT-PCR、WesternBlot等方法在不同水平验证Sumf2基因的表达;对该小鼠模型进行初步的表型分析。结果经胚胎干细胞打靶,获得19个正确同源重组的克隆,重组效率为20％：阳性克隆经囊胚注射,获得2只嵌合体雄鼠;嵌合雄鼠与C57BL／6J小鼠交配,获得28只灰鼠,经PCR鉴定16只为杂合子小鼠,阳性率为57％;与Ella—ere转基因小鼠交配,获得了Sumf2基因剔除小鼠模型,DNA、RNA及蛋白水平证明该基因已成功剔除;初步的表型观察未发现Sumf2基因剔除小鼠生长发育、血常规及血生化指标等出现异常改变。结论成功建立Sumf2条件性基因剔除小鼠模型,该基因纯合缺失未发现明显的生长发育异常,为进一步的基因功能研究奠定了基础。     

RIG-I基因剔除小鼠表型的初步分析

目的通过对视黄酸诱导基因Ⅰ(RIG-I基因)剔除小鼠表型的分析,在整体动物水平揭示RIG-Ⅰ的生物学功能。方法Northern blotting和半定量RT-PCR检测小鼠组织中RIG-I基因的表达;对小鼠的表型分析包括体质量的测量、外周血细胞分类计数、代谢指标测定及病理组织学检查。结果RIG-Ⅰ在小鼠多种组织中广泛表达,但表达水平存在一定差异。RIG-Ⅰ基因剔除后,小鼠未见明显发育异常;无明显预期的粒系分化受阻表现;但RIG-Ⅰ基因剔除小鼠外周血相中的粒/淋比明显倒置,且对条件性致病菌易感。结论RIG-Ⅰ在小鼠抗细菌免疫过程中具有重要作用。     

RIG-Ⅰ基因剔除小鼠表型的初步分析

目的 的通过对视黄酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ基因)剔除小鼠表型的分析,在整体动物水平揭示RIG-Ⅰ的生物学功能.方法 Northern blotting和半定量RT-PCR检测小鼠组织中RIG-Ⅰ基因的表达;对小鼠的表型分析包括体质量的测量、外周血细胞分类计数、代谢指标测定及病理组织学检查.结果 RIG-Ⅰ在小鼠多种组织中广泛表达,但表达水平存在一定差异.RIG-Ⅰ基因剔除后,小鼠未见明显发育异常;无明显预期的粒系分化受阻表现;但RIG-Ⅰ基因剔除小鼠外周血相中的粒/淋比明显倒置,且对条件性致病菌易感.结论 RIG-Ⅰ在小鼠抗细菌免疫过程中具有重要作用.     

RIG-Ⅰ基因剔除小鼠表型的初步分析

目的 的通过对视黄酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ基因)剔除小鼠表型的分析,在整体动物水平揭示RIG-Ⅰ的生物学功能.方法 Northern blotting和半定量RT-PCR检测小鼠组织中RIG-Ⅰ基因的表达;对小鼠的表型分析包括体质量的测量、外周血细胞分类计数、代谢指标测定及病理组织学检查.结果 RIG-Ⅰ在小鼠多种组织中广泛表达,但表达水平存在一定差异.RIG-Ⅰ基因剔除后,小鼠未见明显发育异常;无明显预期的粒系分化受阻表现;但RIG-Ⅰ基因剔除小鼠外周血相中的粒/淋比明显倒置,且对条件性致病菌易感.结论 RIG-Ⅰ在小鼠抗细菌免疫过程中具有重要作用.     

神经鞘磷脂合成酶2基因敲除小鼠的饲养繁殖和鉴定

目的:繁殖和鉴定神经鞘磷脂合成酶2(SMS2)基因敲除(-/-)小鼠。方法:将引进的SMS2杂合子(+/-)小鼠采用杂交、回交、互交的方法进行繁殖,一旦获得雄性和雌性SMS2纯合子(-/-)小鼠,便按照同样方法进行繁殖;用酚氯仿提取法提取小鼠基因组DNA,PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳对小鼠基因型做出鉴定;将SMS2野生型(+/+)小鼠的产仔数作为正常对照组,与SMS2(+/-)和SMS2(-/-)小鼠的产仔数进行比较,用单因素方差分析、Dunnett检验处理数据。结果:SMS2(-/-)小鼠的饲养繁殖鉴定获得成功,单因素方差分析SMS2(+/+)小鼠、SMS2(+/-)小鼠以及SMS2(-/-)小鼠三组产仔数比较无显著性差异(P>0.05),Dunnett检验SMS2(+/-)小鼠与正常组比较产仔数无显著性差异(P>0.05),SMS2(-/-)小鼠与正常组比较产仔数无显著性差异(P>0.05)。结论:用正确的繁殖方法和鉴定方法可以成功获得SMS2(-/-)小鼠。     

仪征地区鲍曼不动杆菌碳青霉烯类抗菌药耐药相关酶表型和基因型分析

摘要： 目的 研究仪征地区 鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药相关酶表型和基因型的分布情况,探讨该 地区广泛耐药鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药的主要机制。方法 根据常规药敏试验结果将鲍曼不动杆菌临床分离株分为广泛耐药组和普通组,分别选取25株和23株用改良EDTA纸片增效法检测金属β-内酰胺酶;用碳青霉烯失活法检测碳青霉烯酶;用双纸片协同试验法和三维试验法分别检测染色体和质粒介导的AmpC酶;用PCR方法检测耐药基因blaOXA-23、blaOXA-24、blaTEM 、blaAmpC、blaVIM、blaNDM-1,对部分阳性产物进行测序比对。结果 鲍曼不动杆菌广泛耐药组和普通组分别占62.5%和37.5%。广泛耐药组中金属β-内酰胺酶阳性1株、碳青霉烯酶阳性4株、染色体和质粒介导的AmpC酶阳性分别为1株和23株;普通组中均未检出上述酶表型。广泛耐药组全部检出耐药基因blaOXA-23、blaTEM 、blaAmpC,均未检出blaOXA-24、blaVIM、blaNDM-1;普通组中blaOXA-23、blaOXA-24、blaTEM 、blaAmpC分别检出4株、5株、22株、12株,未检出blaVIM、blaNDM-1。两组比较,质粒介导的AmpC酶和blaOXA-23、blaAmpC基因携带率的差别具有统计学意义（χ2分别为40.627、34.183、15.511;P=0.000）。基因测序结果发现部分菌株的序列存在碱基插入或置换的改变。结论 鲍曼不动杆菌耐药性严重,产质粒介导的AmpC酶和blaOXA-23、blaAmpC基因介导的耐药机制是仪征地区 鲍曼不动杆菌广泛耐药的主要机制 。     

Alk-SMase基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定

目的 :为了繁育和鉴定碱性鞘磷脂酶(Alkaline sphingomyelinase,alk-SMase)基因敲除小鼠,将引进的基因敲除小鼠进行饲养繁殖,杂合子、纯合子用于继续保种。方法:对其幼鼠剪尾提取基因组DNA,采用PCR方法进行基因型鉴定;取alkSMase表达组织做HE染色进行形态学比较。结果 :对引进小鼠已成功饲养和繁殖,并得到纯合alk-SMase基因缺失型小鼠。结论:正确的饲养、繁殖及基因鉴定方法对于基因敲除小鼠的获得和保种具有重要的意义。     

鞘氨醇激酶2(SphK2)基因敲除小鼠繁殖及基因型鉴定

目的 繁殖和快速鉴定鞘氨醇激酶2(SphK2)基因敲除小鼠.方法 将SphK2敲除杂合子小鼠进行配种繁殖,提取子代小鼠尾部DNA,用PCR方法检测子代小鼠基因型.结果 SphK2杂合子小鼠的饲养及繁殖均获得成功,获得子代小鼠,基因型分别为杂合子(SphK2+/-)、纯合子(SphK2-/-)和野生型(SphK2+/+).结论 SphK2基因敲除小鼠的繁育和鉴定均获得成功,为进一步研究SphK2生物学功能提供了理想的动物模型.     

Brevican基因敲除小鼠的制备

目的制备brevican基因敲除小鼠。方法采用ET克隆方法,构建brevican打靶载体。线性化打靶载体,电转化胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),将正确同源重组的ES细胞注射入囊胚腔,生育嵌合体,再交配繁育杂合子及纯合子。PCR法鉴定小鼠的基因型。结果将PGK启动子指导的NEO表达框敲进Bcan第3外显子,敲除第3～8外显子序列,得到打靶载体,上游臂为2.4 kb,下游臂为4.8 kb。基因打靶后,得到双臂均发生正确同源重组的克隆数14个。利用阳性ES细胞克隆注射入囊胚,得到3只嵌合率大于50%的雄鼠,繁育得到6只Brevican-/-纯合子小鼠。结论利用同源重组方法,成功敲除干细胞靶基因,建立Brevican-/-建系小鼠。     

Mafb基因敲除小鼠的构建及其尿道下裂表型初步分析

目的 利用成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/重组CRISPR相关核酸酶9(CRISPR-associated protein 9, Cas9)构建Mafb基因敲除小鼠,初步研究该基因缺失对尿道发育的影响。方法 根据CRISPR/Cas9技术原理构建Mafb基因杂合子（Mafb+/-）F1代小鼠,裂解鼠尾提取DNA,PCR法扩增目的基因片段,琼脂糖凝胶电泳判定基因型结果。使Mafb+/- F1代小鼠与野生型（wild type, WT）C57BL/6J小鼠交配繁殖。将获得的Mafb+/-小鼠间进行交配,获得Mafb基因敲除纯合子（Mafb-/-）雄性胎鼠。免疫荧光验证Mafb-/-胎鼠阴茎组织中Mafb基因表达情况;扫描电镜及石蜡切片HE染色观察Mafb-/-胎鼠阴茎组织形态,免疫荧光检测胎鼠阴茎组织尿道缝处细胞E-Cadhrin和α-SMA的表达情况。结果 成功构建、繁育Mafb+/-小鼠,保持种群数量并得到Mafb-/-雄性胎鼠,PCR法成功鉴定基因型。免疫荧光结果显示Mafb-/-胎鼠阴茎组织中几乎不存在Mafb蛋白表达,且相较于WT型,尿道缝处细胞E-Cadhrin蛋白表达明显降低,α-SMA蛋白表达明显增高;扫描电镜及HE染色显示Mafb-/-雄性胎鼠为尿道下裂表型。结论 成功构建 Mafb基因敲除小鼠模型,确定其敲除可导致小鼠出现尿道下裂表型,发现尿道缝处细胞中E-Cadhrin和α-SMA的表达差异,为进一步研究该基因在尿道下裂发生机制中的作用提供基础。     

促肾上腺皮质激素释放激素基因敲除小鼠的繁殖与基因型鉴定

目的探讨促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)基因敲除(KO)小鼠饲养、繁殖及基因型鉴定的方法。方法从美国Jackson实验室引进CRH KO小鼠,按照遗传学规则,对杂合子型(CRH+/-)小鼠进行配对繁殖,提取幼鼠尾部组织全基因组DNA,通过聚合酶链反应(PCR)对幼鼠基因型进行鉴定。结果 CRH KO纯合子型(CRH-/-)小鼠的繁殖和饲养均获得成功,采用PCR成功地对所获得的小鼠进行基因分析,在子代小鼠中存在野生纯合子型(CRH+/+)、杂合子型(CRH+/-)及CRHKO纯合子型(CRH-/-)小鼠。CRH-/-小鼠较另外2种基因型小鼠存活率明显下降,但3种基因型小鼠在出生后10 d及30d体质量无明显差异。结论正确的饲养繁殖以及鉴定方法可从杂合子型(CRH+/-)小鼠中获得CRH KO纯合子型(CRH-/-)小鼠。     

利用TALEN技术高效制备TXNIP基因敲除小鼠模型

目的 利用显微注射技术注射敲除Txnip基因的TALEN mRNA获得TXNIP敲除小鼠。方法 在线设计Txnip敲除位点, 构建TALEN载体并在细胞水平验证剪切活性, 体外转录TALENs成mRNA并通过显微注射技术注射到C57BL/6J小鼠受精卵, 对F0代小鼠进行DNA水平鉴定获得TXNIP敲除小鼠。结果 在Txnip第一外显子上设计了TALEN识别剪切位点, 并在细胞水平验证具有剪切活性, 注射mRNA到受精卵获得了4只敲除小鼠, 其中2只Txnip发生移码突变, 成功制备了TXNIP敲除小鼠。结论 通过注射TALENs mRNA可以高效制备TXNIP敲除小鼠。     

Tex101条件性基因敲除小鼠模型的建立和表型鉴定

目的建立Tex101（Testis expressed gene101）条件性基因敲除小鼠模型并进行表型鉴定。方法构建针对小鼠Tex101基因2、3号外显子的重组载体,通过电穿孔的方法转染胚胎干细胞（ES细胞）,用正负筛选法筛选阳性ES细胞并进行PCR鉴定。利用显微注射把发生正确同源重组的ES细胞注射进C57BL／6J小鼠囊胚,移人受体小鼠子宫。将得到的嵌合体小鼠与C57BL／6J雌鼠交配获得Tex101-LoxP转基因小鼠。该小鼠与EⅡa—Cre转基因小鼠杂交,通过子代自交获得Tex101条件性基因敲除（cKO）小鼠并进行初步分析。结果得到2只Tex101cKO雄鼠。冰冻切片观察发现Texl01cKO雄鼠睾丸形态和大小与野生型小鼠相比无明显差异。结论成功建立了Tex101条件性基因敲除小鼠模型,并初步验证了该基因对雄性小鼠睾丸大小和形态无明显影响,为进一步研究Tex101基因功能奠定了基础。     

肝细胞条件性Eva1a/Tmem166基因敲除小鼠的表型分析

目的 应用Cre-LoxP技术构建自噬相关基因Eva1a肝细胞条件性敲除小鼠初步探讨Eva1a基因敲除对小鼠表型的影响。方法 LoxP标记的Eva1a^flox/+小鼠与Alb-Cre工具鼠通过多次繁殖杂交,构建纯合型肝细胞条件性Eva1a基因敲除(Eva1a^flox/flox: Alb-Cre)小鼠模型。选取Eva1a^flox/flox: Alb-Cre小鼠与同窝野生(Eva1a^flox/flox)小鼠雌雄进行体质量、肝指数、肝脏组织学、肝功能、糖脂代谢以及细胞自噬等表型分析。结果 Eva1a纯合型基因敲除小鼠无胚胎致死现象,出生后一般生理状况良好。常规饲养条件下,肝脏Eva1a基因条件性敲除在小鼠体质量、肝脏外观以及组织结构、肝指数、肝功能、糖脂代谢及自噬等与野生型小鼠差异无统计学意义。结论 肝细胞条件性Eva1a基因敲除对小鼠生理条件下的表型无显著影响,为进一步探讨Eva1a在肝脏疾病状态下的作用及分子机制提供了动物模型。     

ASIC1基因敲除小鼠的繁殖及基因鉴定

饲养并繁殖酸敏感离子通道1(ASIC1)基因敲除杂合子小鼠,提取小鼠尾部组织DNA,采用聚合酶链反应( PCR)方法鉴定子代小鼠基因型. ASIC1 基因敲除小鼠的繁育和鉴定均获得成功,子代小鼠基因型分别为杂合子( ASIC1+/-)、纯合子( ASIC1-/ -)和野生型( ASIC1+/ +).     

P-选择素缺失对小鼠生理特征的影响

目的 探讨P-选择素基因（P-selectin）缺失对小鼠生理特征的影响。方法 P-选择素敲除（PKO）小鼠和C57小鼠饲养于SPF级环境中,通过基因鉴定确定其为纯和PKO小鼠。观察PKO小鼠的活动状态、繁育状况,检测血常规,确定P-选择素敲除后对小鼠一般情况的影响。分别于6周和18周处死小鼠,通过伊红&苏木素（HE）染色,观察P-选择素敲除后对小鼠各个脏器组织结构的影响。结果 PKO小鼠与正常C57小鼠的繁育状况相似,血常规无异常,HE染色发现PKO小鼠肝、脾、肺、肾组织结构均较正常。结论 P-选择素的缺失不会对小鼠生殖繁育、血液造成影响,对重要的组织脏器也未见明显影响,为以后进一步研究P-选择素在疾病中的作用提供了动物模型研究理论基础。