基于单克隆抗体的双酚A间接竞争酶联免疫分析法的建立

为建立一种简便、快速、准确的双酚A检测方法,采用活性酯法将双酚酸与牛血清蛋白、卵清蛋白偶联制备人工抗原免疫BALB/c小鼠。选择抗血清效价和灵敏度高的BALB/c小鼠,采用聚乙二醇法制备杂交瘤细胞,获得一株可分泌双酚A单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过方阵滴定和反应条件优化,建立一种基于单克隆抗体的双酚A间接竞争酶联免疫分析法。该检测方法在0.5 ng/mL～50 ng/mL内有良好的线性关系,最低检测限IC10为0.5 ng/mL,半数抑制率IC50为16.65 ng/mL,水样中加标回收率为89.72%～105.25%。该单克隆抗体效价高、特异性强,该检测方法灵敏度高。     

苏丹红Ⅰ单克隆抗体的制备及其间接竞争ELISA 检测

重氮法合成苏丹红Ⅰ的结构类似物,通过活性酯法将苏丹红Ⅰ的结构类似物偶联到载体蛋白上制备人工抗原,用所制备的人工抗原免疫BALB/c 小鼠,采用细胞融合的方法制备苏丹红Ⅰ单克隆抗体,结果成功筛选到一株抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体,经鉴定为IgG2a 型,并建立间接竞争ELISA 检测方法,线性范围为0.5～10ng/mL,检测下限为0.1ng/mL,加标回收率为52.3%～110%,变异系数为3.2%～8.9%。     

基于单克隆抗体的双酚A半抗原直接包被的酶联免疫吸附法的建立

传统的人工抗原包被酶联免疫吸附法(ELISA)依赖疏水相互作用将人工抗原与酶标板结合,会影响半抗原的呈现与识别,且多采用多克隆抗体为检测抗体,这些均会导致检测灵敏度下降和标准化难度增大。该研究选择双酚酸(BVA)作为双酚A(BPA)的半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原免疫BALB/c小鼠,获得一株可分泌BPA单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株。利用3-氨丙基三乙氧基硅烷硅化处理酶标板,将BVA直接包被在酶标板上,建立了一种基于MAb的半抗原直接包被的BPA间接竞争ELISA法。该检测方法最低检测限IC10为0.29 ng/mL,半数抑制率IC50为5.4 ng/mL,水样中加标回收率为94.04%~102.31%。与人工抗原包被BPA ELISA检测方法(IC10:0.5 ng/mL,IC50:16.65 ng/mL,水样中加标回收率为89.72%~105.25%)相比,检测灵敏度显著性提高。     

同时检测恩诺沙星和环丙沙星单克隆抗体的制备

为了产生同时检测恩诺沙星和环丙沙星的抗体,本研究采用戊二醛法制备突出恩诺沙星和环丙沙星共同结构的人工抗原。免疫Balb/c 小鼠的结果显示：使用糖基化载体所制备的免疫抗原,能够大幅提高所产生特异性抗体的滴度。通过细胞融合,筛选出一株对恩诺沙星和环丙沙星IC50 值分别为9.6ng/mL 和10.2ng/mL 的单克隆抗体。     

诺氟沙星单克隆抗体的制备及初步应用

采用优化的碳二亚胺法制备诺氟沙星（NOR）人工抗原,紫外扫描和红外光谱图表明人工抗原偶联成功。采用细胞融合技术筛选抗NOR单克隆抗体（NORmAb）杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备NORmAb,建立间接竞争ELISA（icELISA）标准曲线。结果表明,筛选的3株杂交瘤细胞分泌的抗体为IgG1亚型,具k轻链;建立的icELISA标准曲线在PBS中的的线性检测范围为0.04～43.6ng/mL,IC50值为0.62ng/mL,检测限（LOD）为0.02ng/mL;抗体与环丙沙星（87.2%）、培氟沙星（76.9%）、依诺沙星（66.8%）、恩诺沙星（48.6%）和洛美沙星（36.6%）有较高的交叉反应率;禽肉基质中NOR添加回收率满足检测要求。     

磺胺嘧啶单克隆抗体的制备与鉴定

采用重氮法同时制备结合比分别为9.0、8.0、3.7 的3 种磺胺嘧啶免疫抗原,并将其免疫BALB/c 小鼠,其中结合比为8.0 的一组免疫效果最佳。获得一株稳定分泌抗磺胺嘧啶单克隆抗体的杂交瘤细胞(1F6),体内诱生法制备腹水。间接ELISA 测定腹水效价为1:1.28 × 106,建立间接竞争ELISA 标准曲线,其检测下限为10.4ng/mL,线性范围为14.8～421.5ng/mL,IC50 值为79.1ng/mL,与磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶交叉反应率分别为 0.3%、0.99%、4.5%,与磺胺甲噁唑、磺胺喹恶啉、对氨基苯甲酸、磺胺、对氨基苯磺酸未见有交叉反应。经鉴定,单克隆抗体免疫球蛋白为鼠IgG 的2b 亚类。     

阿维菌素特异性半抗原合成及多克隆抗体的制备

合成具有阿维菌素特征结构的半抗原,采用活化酯法与载体蛋白BSA偶联制备人工抗原.通过免疫新西兰大白兔成功制备阿维菌素多克隆抗体,抗体效价达1∶20 000,用此抗体建立的阿维菌素间接竞争酶联免疫标准曲线IC50为1.92 ng/mL,IC15为0.13 ng/mL.     

恩诺沙星快速酶联免疫吸附法检测试剂盒的研制

目的：研制恩诺沙星酶联免疫吸附法检测试剂盒。方法：采用EDC-NHS 法制备ENR-M-BSA 免疫原和ENR-OVA 检测抗原,用ENR-M-BSA 免疫BALB/C 小鼠,采用甲基纤维素半固体培养基法筛选单克隆抗体并采用间接竞争ELISA 对其进行分析。结果：通过公式计算ENR-M-BSA 摩尔偶联比为15:1,ENR-OVA 摩尔偶联比为7.2:1。筛选出1 株特异性分泌株3E9,其腹水纯化后间接竞争ELISA 测其效价为107,分型试剂盒测试显示此抗体属于IgG1 型;检测限为1ng/mL,线性范围在1～100ng/mL 之间,半量抑制浓度(IC50 值)为10ng/mL,与4 种结构类似物交叉反应均小于1%。结论：此株单克隆抗体可以用来建立恩诺沙星ELISA 检测试剂盒。     

半抗原直接包被的四环素酶联免疫吸附分析法的建立

为建立更优的四环素（tetracycline,TC）酶联免疫吸附分析法（enzyme?linked immunosorbent assay,ELISA）,将TC 与蛋白质偶联制备人工完全抗原免疫BALB/c 小鼠,获得抗TC 的单克隆抗体（monoclonal antibody,MAb）。采用酸性高锰酸钾羧化酶标板,将TC 直接包被在酶标板上,并对ELISA 反应体系条件进行优化,构建一种半抗原直接包被的TC ELISA 检测方法。所制备的MAb 特异性良好,交叉反应率低。所构建的检测方法最低检测限IC10 值为0.306 ng/mL,半数抑制率IC50值为9.26 ng/mL,牛奶和水中加标回收率分别为96.46%～101.89%、96.84%～102.50%。与人工完全抗原包被的检测方法相比（IC10值：0.624 ng/mL,IC50值：28.24 ng/mL,牛奶和水中加标回收率分别为93.86%～105.12%、94.04%～105.56%）,检测灵敏度有明显提高,并可用于实际样品中TC 含量的检测,具备良好的应用前景。     

毒死蜱单克隆抗体制备及icELISA检测方法优化

目的制备毒死蜱单克隆抗体,建立icELISA(间接竞争酶联免疫吸附方法)检测方法并对其进行优化。方法以毒死蜱为基础物质,制备半抗原CPF-H1和CPF-H2,偶联蛋白制备人工抗原,进而通过免疫、细胞融合、筛选得到特异性的单克隆抗体,建立毒死蜱的icELISA检测方法,并对其分析条件进行优化。结果质谱鉴定结果表明毒死蜱半抗原制备成功;半抗原偶联蛋白,紫外全波长扫描鉴定人工抗原制备成功;免疫动物、细胞融合并制备单克隆抗体;建立了icELISA检测方法,优化得到最佳反应条件:PBST为标准品稀释液,包被抗原最佳稀释倍数为1:1000,抗体最佳稀释倍数为1:1000,一抗反应最佳时间为40 min,二抗反应最佳时间为30 min,制得毒死蜱标准曲线,毒死蜱对抗体的IC_(50)为73-25 ng/mL,线性范围IC_(20)~IC_(80)为32.52~260ng/mL,LOD为19.34 ng/mL。结论本研究为毒死蜱快速检测技术奠定了理论基础,对保障人们的身体健康具有重要的意义。     

化学发光酶联免疫法检测苏丹红Ⅰ

为检测食品中苏丹红Ⅰ残留,建立间接竞争化学发光酶联免疫分析（chemi luminescent enzymeimmunoassay,CLEIA）法。通过优化包被抗原中本抗原与载体物质的量比、包被抗原质量浓度、抗体稀释比例,建立竞争抑制曲线。线性范围为0.156～5 ng/mL,最低检测限为0.078 9 ng/mL,IC50为0.679 ng/mL。CLEIA回收率为75.08%～112.18%,变异系数为8.89%～15.61%;通过与酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法进行比较,在相同抗原抗体质量浓度条件下,CLEIA法测定的IC50较ELISA方法降低30%,具有较高的灵敏度。     

基于异源包被的 曲安奈德竞争酶联免疫检测方法

为监控曲安奈德的滥用情况,本研究建立了曲安奈德竞争酶联免疫检测方法。将曲安奈德(Triamcinolone acetonide,TCA)半抗原通过活泼酯法与钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联获得曲安奈德完整抗原TCA-KLH;通过免疫小鼠、细胞融合及筛选获得一株能够稳定分泌抗曲安奈德的单克隆抗体细胞株,制备并纯化了腹水抗体。将TCA和地塞米松(Dexamethasone,DEX)半抗原通过活泼酯法分别与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)偶联作为包被原,建立曲安奈德同源及异源的间接竞争酶联免疫分析方法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA)。在同源包被情况下,曲安奈德灵敏度为5.4 ng/mL,而DEX异源包下灵敏度为0.53 ng/mL。未观察该方法到对哈西奈德、布地奈德、安西奈德以外的其他糖皮质激素的交叉反应。在添加回收实验中,使用20%甲醇水溶液提取动物组织的添加回收率在75%~95%之间。该方法能有效应用于动物组织中曲安奈德的快速筛查。     

直接竞争化学发光酶免疫法检测呋喃妥因代谢物

建立检测动物组织中呋喃妥因代谢物的直接竞争化学发光酶免疫法。采用棋盘法确定抗体和酶标抗原的最佳稀释度,通过单因素试验优化包被条件、封闭液种类和竞争反应时间,建立直接竞争抑制曲线,并对方法的灵敏度、特异性、准确度和精密度进行方法学评价。结果表明,经优化,最佳反应条件为抗体稀释度1∶4 000,酶标抗原稀释度1∶80,包被条件为37 ℃ 2 h后4 ℃过夜,封闭液为1%牛血清白蛋白,竞争反应1 h。该方法的线性检测范围为0.030～10.595 ng/mL,IC50为0.559 ng/mL;加标回收率为84.9%～103.4%,批内变异系数为3.4%～7.8%,批间变异系数为4.7%～11.8%;除与呋喃妥因原药交叉反应率为36.2%,与其他结构类似物及衍生化试剂交叉反应率均小于0.1%。该方法灵敏、准确,可用于动物组织中呋喃妥因代谢物的快速筛查。     

抗呋喃唑酮单克隆抗体的制备及其应用

为实现呋喃唑酮（furazolidone,FZD）的快速定量检测,本研究制备了抗FZD全抗原的单克隆抗体,建立了抗FZD的单克隆抗体酶联免疫检测方法。结果表明,FZD单克隆抗体在质量浓度为10～500 ng/mL范围具有较好的线性,IC50值为0.06 μg/mL,最低检测限为6.92 ng/mL,对于其他硝基呋喃类抗生素及其代谢物均不存在交叉反应。该方法重现性较好,平均误差为6.54%,回收率为76.84%～88.31%。     

牛初乳中免疫球蛋白G双抗夹心ELISA检测方法的建立

将牛免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选获得分泌抗牛IgG单克隆抗体的细胞株。制备小鼠腹水抗体,进一步纯化获得抗牛IgG单克隆抗体。建立双抗夹心酶联免疫吸附法检测牛初乳中IgG质量浓度,该方法在7.8～1 000 ng/mL范围内有良好的线性关系,最低检出限为7.06 ng/mL,批内变异系数为4.52%,批间变异系数为4.94%,回收率为91.85%～102.45%。此法操作简便、准确度高、稳定性好,可用于实际牛初乳样品的快速检测。     

酶联免疫法检测食品中的双酚A残留

建立检测双酚A(BPA)的间接竞争酶联免疫检测法(icELISA),探讨其在实际样品检测中的灵敏性及准确性。以抗BPA的腹水单抗建立BPA的icELISA法,利用该法对市面上聚碳酸酯(PC)制包装材料中BPA向食物的迁移量进行检测,并与高效液相色谱法检测结果相比较。BPA的icELISA法检测范围为2.817 ng/mL～1.212×106ng/mL,IC50为1 847.9 ng/mL,检测限为0.324 ng/mL,该法测定罐装鱼肉和蔬菜中BPA分别为1 015.25 ng/mL和207.22 ng/mL。     

异丙威单克隆抗体的制备及鉴定

异丙威是我国农业生产中常见的杀虫剂,在果蔬、粮食和烟草等中都有广泛应用,然而这类农药也具有较强生物毒性。为了制备异丙威单克隆抗体,以实现对农药异丙威药物的快速检测。本文以2-异丙基苯酚等为原料,合成异丙威半抗原及人工抗原,并通过免疫小鼠、细胞融合、克隆、筛选获得单克隆抗体细胞株,经腹水诱导法及辛酸-硫酸铵沉淀法制得异丙威单克隆抗体,通过间接竞争ELISA法对抗体的特异性进行鉴定。结果表明,制备的异丙威单克隆抗体检测范围为1.88~82.80 ng/m L,抗体的IC50为11.70ng/m L,最低检测限为0.54 ng/m L,抗体与克百威、西维因、涕灭威、灭多威、2-异丙基苯酚5种异丙威结构类似物均无明显交叉反应,具有高特异性,能够满足农产品中异丙威残留检测的要求。异丙威单克隆抗体的制备为异丙威快速检测产品的开发奠定了基础。     

基于不同半抗原的呋喃唑酮代谢物免疫检测方法的建立与比较

为实现呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone,AOZ）的快速定量检测,制备AOZ- 牛血清蛋白单克隆抗体,建立2 种分别基于抗3-（4-羧基苯亚甲基）-氨基-2-恶唑烷酮（CPAOZ）、抗AOZ的单克 隆抗体酶联免疫检测试剂盒。CPAOZ检测试剂盒在1.0～100.0 ng/mL范围具有较好的线性,IC50值为14.6 ng/mL, 检测限为6.56 ng/mL,回收率为97.6%～101.3%;AOZ检测试剂盒在0.5～12.5 ng/mL范围具有良好线性,IC50值为 3.9 ng/mL,检测限为0.45 ng/mL,回收率为94.1%～97.4%。这2 种检测试剂盒对于其他硝基呋喃类抗生素及其代谢 物均不存在交叉反应。从经济、方便、快速、灵敏等因素来考虑,后者更具有发展前景。     

双抗夹心ELISA检测转Bar基因抗除草剂大豆

为快捷有效地检测转Bar基因抗除草剂大豆,利用已制备的抗除草剂Bar基因编码蛋白,膦丝菌素乙酰转移酶（phosphinothricin acetyltransferase,PAT）单克隆抗体和多克隆抗体,建立PAT蛋白双抗夹心酶联免疫吸附检测方法,对转Bar基因抗除草剂大豆不同组织材料进行定量检测。结果显示,最佳检测条件为捕获抗体质量浓度0.125 μg/mL,包被酶标板,37 ℃孵育1 h后4 ℃静置过夜,检测样品37 ℃孵育1.5 h,检测抗体质量浓度6.25 μg/mL,37 ℃孵育1.5 h;PAT蛋白的最低检测限为0.04 ng/mL,大豆蛋白体系中为8 ng/mL;重复性变异系数小于3%。利用上述检测条件,对实验建立的转Bar基因抗除草剂大豆进行PAT蛋白定量检测,成功地在根、茎、花、叶、种子不同部位检测到该蛋白的表达。