真皮间充质干细胞的分离培养及其NOV基因的表达

目的：分离培养大鼠真皮来源成体多能干细胞并研究其NOV基因表达。方法：分离培养新生大鼠真皮间充质干细胞，采用形态学观察及免疫组化法进行鉴定。用脂质体法将构建的NOV基因真核表达载体转染入大鼠真皮多能干细胞中，在荧光倒置显微镜下观察转染产物，RT—PCR法检测转染细胞中NOV基因表达。结果：新生大鼠真皮间充质干细胞86％处于G0／G1期，多向诱导后可分化为神经细胞及中胚层来源细胞。NOV重组质粒体外转染大鼠真皮多能干细胞后，转染细胞中检测到NOV基因。结论：大鼠真皮组织中存在着成体多能干细胞，具有多胚系分化潜能。该细胞可作为NOV基因表达的细胞载体。     

NOV在真皮来源大鼠间充质干细胞中的表达及活性检测

目的：检测肾母细胞瘤过度表达（NOV）基因在真皮来源大鼠间充质干细胞（DMSCs）中的表达及活性。方法：NOV基因重组质粒转染DMSCs，在荧光倒置显微镜下观察转染产物，RT—PCR法检测转染细胞中NOV基因表达。收集NOV基因修饰DMSCs的条件培养液（简称NOV—CM），作用于对照组DMSCs及转染了NOV基因的DMSCs（简称NOV—DMSCs），检测NOV基因及其分泌蛋白在DMSCs分化中的活性作用。结果：NOV重组质粒体外转染入大鼠真皮多能干细胞后，转染细胞中检测到NOV基因。免疫荧光检测结果显示，NOV基因修饰及NOV—CM培养DMSCs时，DMSCs向神经元方向分化的比例增高，且细胞突起较长。结论：NOV基因可在DMSCs中稳定表达，可能具有促进DMSCs向神经元分化的作用。     

12C对人肝癌SMMC-7721细胞中survivin表达的影响

目的 通过采用RNA干扰技术下调survivin基因在人肝癌SMMC-7721细胞中的表达,观察survivin表达下调对细胞G₂/M期阻滞、细胞凋亡和重离子辐射敏感性的影响。方法 针对survivin mRNA体外化学合成小干扰RNA(siRNA),转染细胞,以实时 PCR方法检测转染后24和48 h细胞survivin mRNA的表达。Annexin-FITC检测细胞的凋亡情况;流式细胞仪检测周期阻滞情况;克隆存活法确定细胞的辐射敏感性。结果 转染24和48 h后,细胞中survivin的表达量分别为未转染组的59%和39%;转染survivin siRNA后24 h,引起细胞G₂/M期阻滞,48 h阻滞明显。转染survivin siRNA 48 h后的细胞凋亡率为21.41%,明显高于未转染组细胞(t=9.13,P<0.01)。siRNA 转染组细胞受辐照后的存活率明显降低。结论 以siRNA下调survivin的表达可有效诱导细胞凋亡,引起G₂/M期阻滞,提高细胞对重离子的辐射敏感性。     

人端粒酶反转录酶基因转染对人胎儿表皮干细胞增殖的影响

目的 探讨外源性人端粒酶反转录酶(hTERT)基因转染对人胎儿表皮干细胞增殖的影响.方法 采用脂质体转染法,将含有hTERT基因的质粒pIRES2-EGFP-hTERT和卒载体质粒pIRES2-EGFP分别导人体外培养的人胎儿表皮干细胞,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选.用RT-PCR和Western blot检测表皮十细胞hTERT mRNA及其蛋白的表达,端粒重复序列扩增法(TRAP)-ELISA检测其端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞周期.结果 非转染组和空载体质粒转染组表皮干细胞弱表达hTERT mRNA和蛋白,而质粒转染组表皮干细胞强表达hTERT mRNA和蛋白;与非转染组和窄载体质粒转染组比较,质粒转染组表皮干细胞端粒酶活性的表达量显著升高,G_0/G_1期细胞比例明显下降,而S、G_2/M期细胞比例升高,增殖指数增加.结论 外源性hTERT基因转染能有效增强体外培养的人表皮干细胞hTERT mRNA和蛋白的表达及端粒酶活性,细胞增殖能力明显增强.     

siRNA对骨肉瘤细胞细胞周期及survivin表达的影响

目的 构建人survivin特异性siRNA,探讨其对骨肉瘤细胞MG63细胞周期及survivin表达的影响.方法 构建survivin特异性的RNA干涉载体,转染MG63细胞,G418筛选稳定转染的细胞系,以Western blot法检测survivin蛋白表达变化,透射电镜、Hoechst染色检测细胞凋亡情况,流式细胞仪检测细胞周期变化.结果 成功构建了survivin基因siRNA真核表达载体PsiS,获得了稳定转染的细胞系.与正常MG63细胞、阴性对照细胞相比,MG63/PsiS细胞中survivin蛋白表达减少,部分细胞核致密浓染或碎块状浓染,凋亡率增加了7倍,而G2/M期细胞减少近50%.结论 特异性siRNA能够明显抑制survivin基因在MG63细胞中的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡.     

siRNA抑制STAT3基因对HepG2细胞辐射敏感性的影响

目的 研究瞬时转染的siRNA抑制STAT3基因表达对人肝癌HepG2细胞辐射敏感性的影响。方法 以人肝癌HepG2细胞作为研究对象，脂质体包裹化学合成的siRNA进行转染。采用实时RT-PCR和Westernblotting法分别从mRNA水平和蛋白水平检测STAT3基因的表达及编码蛋白磷酸化活化的改变，用CCK-8法和Hoechst33258DNA染色法检测辐射敏感性的变化。结果STAT3特异性的siRNA转染后HepG2细胞中STAT3基因mRNA拷贝数、STAT3蛋白表达和磷酸化水平均明显降低。mRNA水平的抑制效率可达70％。siRNA转染联合60Coγ射线照射后HepG2细胞增殖活力显著低于对照组（P〈0．05）。结论 针对人STAT3基因的siRNA能够抑制HepG2细胞STAT3基因的表达，降低STAT3蛋白活化水平，进而产生辐射增敏作用。     

RNAi沉默dUTPase对SW620细胞黏附的影响

目的 采用RNAi沉默dUTPase的表达,观察SW620细胞黏性的改变。方法 合成两条编码发夹siRNA序列的单链DNA,并将其克隆到pSilenCircle载体中,构建重组质粒sidUTPase／pSilenCircle和无关基因的重组质粒siFly／pSilenCircle。以上述重组质粒分别转染SW620细胞,RT-PCR和Westem blot检测dUTPase的表达,异质黏附实验分析细胞黏附性的改变。结果 成功地构建了2个dUTPase发夹siRNA的真核表达载体sidUTPase／pSilenCircle和无关基因重组质粒siFly／pSilenCircle。与siFly／pSilen-Cirele转染组比较,sidUTPase／pSilenCircle转染组SW620细胞dUTPase的表达明显下调,细胞异质黏附能力减弱。结论 构建的dUTPase发夹siRNA的真核表达载体sidUTPase／pSilenCircle可有效抑制SW620细胞的dUTPase表达,降低细胞的异质黏附性。     

Dlx5 mRNA在室管膜前下区神经干细胞中的表达规律及其对神经元分化的影响

目的研究D lx5 mRNA在培养的室管膜前下区(anterior subventricu lor zone,SVZa)神经干细胞(NSCs)中的表达规律及其对SVZa NSCs方向分化的影响。方法提取每一代培养的SVZa NSCs的总RNA,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测D lx5及Er81 mRNA表达的情况;将重组质粒pEGFP-mD lx5用电穿孔的方法转染不表达D lx5 mRNA代次的NSCs,再检测D lx5 mRNA的表达情况,并将转染细胞分化后进行免疫荧光染色,分析基因转染细胞与神经元分化的关系;另外,还用100 ng/m l的骨形态发生蛋白-2(BMP-2)处理不表达D lx5 mRNA的NSCs,24 h后检测D lx5 mRNA的表达情况。最后将不同D lx5 mRNA表达情况的NSCs分化后用流式细胞仪检测神经元分化的比例。结果细胞传代至第4代时D lx5 mRNA表达消失,相应地,其神经元分化比例为(8.34±0.36)%,比表达D lx5 mRNA的第3代NSCs的(19.16±0.75)%明显下降;用D lx5基因转染该代NSCs后,外源转染基因能够使内源性D lx5 mRNA恢复表达,神经元分化比例也明显升高,为(35.66±0.58)%,免疫荧光染色也证实基因转染细胞分化成了神经元;而BMP-2处理也能诱导D lx5 mRNA重新表达,神经元分化比例也有一定程度上升,与第3代NSCs的相似,为(22.27±0.12)%。除第3代NSCs分化组与BMP-2诱导组神经元分化比例差异无统计学意义外,其余各组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论随着传代次数的增加,到第4代时,SVZa NSCs D lx5 mRNA表达消失,而外源性D lx5基因转染及BMP-2可以诱导其重新表达;D lx5基因能使新生大鼠来源的SVZa NSCs向神经元方向分化。     

RNA干扰沉默cyclin D1基因表达对乳腺癌细胞迁移和侵袭力的影响

 目的 利用RNA干扰技术下调cyclin D1基因表达,探讨其对乳腺癌细胞体外侵袭和迁移能力的影响,了解cyclin D1在肿瘤细胞转移的作用.方法 设计cyclin D1基因的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)片段siRNA51和siRNA52,脂质体介导转染入乳腺癌MDA-MB-231细胞株.应用Western印迹法检测转染前后cyclin D1表达水平;通过单层细胞划痕实验观察细胞转染前后迁移能力的变化,Transwell侵袭实验检测细胞体外侵袭力.结果 乳腺癌MDA-MB-231细胞株转染cyclin D1的siRNA后,cyclin D1蛋白水平明显下调,细胞的迁移及侵袭能力明显减弱.结论 利用RNA干扰技术能够特异阻断cyclin D1基因表达;cyclin D1基因表达下调能够明显抑制乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力.     

siRNA真核表达载体对大鼠耳蜗前体细胞Notch3基因表达的影响

目的 构建Notch3基因的siRNA真核表达载体,探讨其对大鼠耳蜗前体细胞中Notch3基因表达的影响.方法 机械分离并胰酶消化新生大鼠耳蜗感觉上皮,悬浮培养基培养耳蜗前体细胞.根据Notch3基因序列设计并合成2对siRNA,插入pSilencer4.1-CMV neo载体,进行酶切及测序鉴定.采用脂质体法向大鼠耳蜗前体细胞转染重组质粒,采用Real time-PCR和Western blotting法检测重组质粒对Notch3基因的干扰效果.结果 经前体细胞标记物Abcg2染色鉴定证实原代培养的细胞球为耳蜗前体细胞.酶切及测序鉴定证实成功构建了siRNA真核表达载体pSilencer-Notch3-S1和pSilencer-Notch3-S2. Real-time PCR和Western blotting检测结果显示所构建的Notch3基因真核表达载体成功地干扰了目的基因的表达.与空白对照组比较,转染pSilencer-Notch3-S1和pSilencer-Notch3-S2的细胞Notch 3 mRNA和蛋白表达量均有明显减少,而转染空质粒的细胞与空白对照组比较无显著差异.结论 成功构建了大鼠Notch3基因的RNAi真核表达载体,该载体在大鼠耳蜗前体细胞中对Notch3基因的表达可发挥抑制作用.     

Nanog的生物功能研究进展

Nanog是近年来在胚胎干细胞（ES细胞）内发现的一个重要转录因子,该因子对维持ES细胞的自我更新及全能性起着关键作用。本文简要综述了Nanog对细胞增殖的作用及其机制。     

人Sox2和Nanog基因的克隆及其对胎肺成纤维细胞分化的影响

目的 克隆人Sox2、Nanog基因编码序列,构建pSG5-Sox2及pSG5-Nanog真核表达重组质粒,转染胎肺间质成纤维细胞,观察Sox2、Nanog基因表达并鉴定其功能.方法 应用RT-PCR方法分别从4～6周龄流产胎儿脑组织和膀胱癌细胞中扩增出Sox2及Nanog基因编码全序列,将其连接至pSG5表达载体.经...     

EMMPRIN基因表达对胶质瘤U251细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨特异性小分子干扰（small interference,siRNA）抑制人脑胶质瘤U251细胞株内细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN）基因的表达后,对U251细胞株增殖、凋亡的影响。方法构建EMMPRIN基因小干扰RNA,转染人胶质瘤U251细胞株,运用半定量RT-PCR及Western blot的方法验证转染组及对照组的胶质瘤细胞EMMPRIN基因mRNA及蛋白的表达水平,通过MTT法观察转染48 h后对U251细胞增殖的变化,流式细胞术观察转染48 h后U251细胞周期及凋亡的改变。结果 EMMPRIN基因的特异性siRNA转染U251细胞后,EMM-PRIN基因的mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡增加。结论 EMMPRIN基因的特异性siR-NA能抑制胶质瘤U251细胞株的增殖,促进细胞凋亡。     

siRNA真核表达载体构建及对细胞MSTN基因抑制的研究

肌肉生长抑制素是肌肉生长的负调控因子。本研究为了得到有效抑制绵羊MSTN基因的siRNA分子,设计8对siRNA寡聚核苷酸引物,经退火与pSilencerTM4.1-CMV neo连接构建siRNA真核表达载体,转染C2C12细胞后,利用RT-PCR及real time PCR检测干扰效果。结果显示,8条siRNA分子中有3条对MSTN基因有显著的抑制作用,其中psi-mstn-717和psi-mstn-986分子对MSTN mRNA抑制效率分别达到61%和53%。本研究证实载体表达siRNA能有效抑制细胞MSTN mRNA的表达,下一步筛选的siRNA将用于体内实验。     

代谢综合征相关新基因MSRG实时荧光PCR检测方法的建立

目的 建立测定MSRG mRNA表达量的实时荧光定量PCR检测方法,为新基因的功能研究奠定基础.方法 根据MSRG cDNA序列设计荧光PCR适用的引物和探针,构建质粒标准品,建立标准曲线用于荧光PCR相对定量,检测荧光PCR方法的灵敏性、特异性和重复性.荧光PCR检测不同浓度葡萄糖[5 6mmol/L(G5.6)、22mmol/L(G22)、33.3mmol/L(G33.3)]刺激人肝癌细胞株HepG2细胞MSRG的表达并与半定量RT-PCR方法进行比较.结果 建立了MSRG mRNA表达的实时荧光PCR检测方法.荧光PCR检测显示G33.3、G22和G5.6组HepG2细胞MSRG表达均有显著差异,半定量RT-PCR方法检测G33.3组MSRG表达显著增加,但不能检测出G22和G5.6组间有差异.结论 本实验建立的MSRG mRNA表达实时荧光PCR检测方法灵敏性、特异性和重复性较好,为MSRG功能的研究提供了一种重要手段.     

Radioresponse of fetal testes of mice and its modification by MPG (2-mercaptopropionylglycine)

Radiosensitivity of the primordial germ cells and its protection was estimated from the surviving number of spermatids in the 6 weeks old testes of control and MPG-pretreated mice after intrauterine exposure to 0.5, 1.5 and 2.5 Gy60Co gamma rays during fetal growth period. Radiosensitivity of fetal testes was found to increase with the advent of embryonic age. Quantitatively, significant protection in testes weight and spermatids count was registered in the MPG-pretreated animals at all the 3 dose levels studied.     

应用RNAi技术沉默survivin基因对肺腺癌A549细胞的影响

目的 探讨RNA干扰(RNAi)沉默survivin基因对肺腺癌A549细胞的影响.方法 应用RNAi技术,以化学合成的survivin小干扰RNA(siRNA)体外转染A549细胞,采用MTT法及流式细胞仪检测转染前后A549细胞增殖、凋亡和细胞周期的变化,通过RT-PCR及Western blot分析survivin mRNA和蛋白的表达情况.结果 survivin siRNA对A549的生长抑制作用呈浓度依赖性(P＜0.05),并能引起G1期细胞比率的增加和S期细胞相应的减少,诱导一定数量的细胞凋亡,转染后36、60、84、108、132h的IC50值分别为152.4、151.2、136.0、144.0、150.4nmol/L.100～200nmol/L siRNA转染组细胞的survivin表达在蛋白及RNA水平都显著低于对照组(P＜0.01),但空白对照组与空质粒组间无明显差异(P＞0.05).结论 应用siRNA沉默survivin基因可以下调肺腺癌A549细胞survivin的表达,进而抑制细胞生长、增殖并诱导细胞凋亡.RNAi的抑制效果具有特异、高效和持久的特点.     

TRIM基因家族一个新成员的克隆及功能研究

目的:克隆小鼠早期胚胎发育相关的新基因uTRIM,研究其胞内亚定位及功能.方法:通过数字差异显示搜索到可能和小鼠早期胚胎发育相关的新基因uTRIM,用RT-PCR方法从体外培养的小鼠囊胚中分离得到其全长cDNA;将其克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1中,在HEK 293细胞内表达后确定uTRIM分子的亚细胞定位.用RNAi对其在胚胎发育早期的功能进行初步的研究.结果与结论:uTRIM基因只在胚胎发育早期和成体睾丸组织中表达,亚细胞定位显示该蛋白位于细胞质中.RNAi结果显示抑制uTRIM表达使小鼠受精卵体外发育速度加快,提示uTRIM参与早期胚胎发育的负调控.     

High sensitivity of rat foetal germ cells to low dose-rate irradiation

Purpose : To investigate the response of germ and Sertoli cells to γ-irradiation at two distinct periods of testicular development in rat foetuses. Materials and methods : Pregnant rats were exposed to 60 Co γ-rays at days 15, 19 or 21 post-coitum (p.c.), at doses ranging from 0.1 to 1.5Gy, and at different dose-rates. Testicular weight, seminiferous tubule condition and the number of germ and Sertoli cells were measured at early and late times after irradiation. Apoptosis was studied by the ISEL method and p53 expression was studied by immunohistochemistry Results : At high dose-rates (≥3.3 Gy min -1) , 1.5Gy radiation at day 15 p.c. had a short-term effect on germ cell survival. A large proportion of these cells rapidly underwent p53-independent apoptosis. Apoptotic cells were strongly clustered. The remaining germ cells divided and differentiated normally leading to a majority of normal tubules in the adult testis. However, at low dose-rate (0.6 mGy min -1) , much greater depopulation of the seminiferous tubules occurred. When irradiation was given at day 19 p.c., the same dose had a delayed effect on germ cells, leading to sterility. Sertoli cells had a normal survival for irradiation at day 15 p.c. Their proliferation became higher in prepubescent testis compared with controls, when irradiation occurred at day 19 p.c. Conclusion : The position of gonocytes in the cell cycle at the time of irradiation seems to be a determining parameter for inducing gonocyte apoptosis. The strong effect of irradiation on germ cells at very low dose-rate and the appearance of clusters of apoptotic gonocytes may be a consequence of the syncitial organization of germ cells, favouring their cell synchronisation or the transmission of death signalling when they are in a radiosensitive period.