甲基化寡核苷酸诱导灭活RASSFl基因在肝癌发病机制中的应用

目的:甲基化寡核苷酸诱导灭活RASSFl基因并探索其启动子甲基化在肝癌发病机制中的应用.方法:将与RASSF1基因启动子互补的甲基化寡核苷酸转染至肝癌SMMC-7721细胞系内,分别采用BSP和RT-PCR检测转染前后RASSFl基因启动子甲基化状态和mRNA表达状况.结果:正常SMMC-7721细胞系RASSF1基因启动子表现无甲基化状态并表达相应mRNA.转染互补甲基化寡核苷酸后,相应CG位点被诱导成完全甲基化状态.mRNA表达明显受到抑制.结论:互补甲基化寡核苷酸可诱导基因启动子甲基化状态.RASSF1基因启动子甲基化在原发性肝细胞癌发病机制中扮演重要角色.     

RASSF1A基因甲基化在乳癌中的研究进展

随着人们对肿瘤的深入研究．发现多数实体肿瘤存在3号染色体短臂（3p）缺失，提示3p区域所含的基因对肿瘤发生发展起着重要作用，可能隐含肿瘤抑制基因。因此，人们从染色体3p上发现了BLU、FUS1、RASSF1A等抑癌基因。现将RASSF1A甲基化在乳癌中的研究进展综述如下。     

RASSF1基因与肿瘤的关系

RASSF1基因位于染色体3p21.3,其转录本RASSF1A已被确认为一种候选肿瘤抑制基因,在多种实体肿瘤中表达异常,参与细胞周期和细胞凋亡的调控,并抑制细胞生长,但作用机理尚未阐明。     

RASSF2A基因启动子甲基化与肿瘤关系的研究进展

肿瘤抑制基因（TSG）的失活是癌症发病机制的关键因素。TSG失活可能是不可逆的,比如基因缺失或突变;TSG失活也可能通过表观遗传的机制,是可逆的,这为寻找更适合的治疗方法或治疗药物提供了理论基础。CpG 双核苷酸很少出现在人类基因中,但在某些基因的启动子区发现 CpG 保持或高于正常概率,即CpG岛,其甲基化在基因表达的调控上起关键作用。RAS相关区域家族2A（RASSF2A）位于染色体3p21．3,这个区域被证实在一些肿瘤中频繁缺失;其中RASSF2A的表观遗传失活是重要的分子改变。最近的一些研究已陆续阐明了RASSF2A启动子甲基化在肿瘤诊断和预后中的潜在意义,本文对其研究进展综述如下。     

SHOX2和RASSF1A基因甲基化检测在早期肺癌的诊断研究

目的：探讨SHOX2和RASSF1A基因甲基化检测在早期肺癌的诊断价值。方法：选择2020年8月-2021年3月期间我院收治肺部小结节患者107例为研究对象,其中经病理活检确认早期肺癌患者72例（肺癌组）,肺部良性病变患者35例（对照组）。采集患者肺泡灌洗液（BALF）样本,进行细胞学检查且荧光PCR法测定样本中SHOX2和RASSF1A基因甲基化阳性率,分析甲基化情况及其病理诊断关系。结果：肺癌组和对照组SHOX2基因甲基化阳性率分别为51.4%和2.9%,RASSF1A基因甲基化阳性率分别为61.1%和5.7%,均差异显著（P<0.05）,且SHOX2和RASSF1A基因甲基化任意阳性率显著高于细胞学检查阳性率（P<0.05）;并联SHOX2和RASSF1A基因甲基化检测早期肺癌的灵敏度和特异性分别为76.4%(55/72)、91.4%(32/35),且在不同病理分型中存在差异,灵敏度在小细胞癌中最高（95.7%,22/23）,鳞癌次之（76.5%,13/17）,腺癌最低（68.8%,22/32）。结论：SHOX2和RASSF1A基因甲基化任意阳性率在患者BALF中诊断...     

实时荧光定量检测人血浆中RASSF1A基因启动子甲基化

目的 建立检测人血浆DNA中RASSF1A基因甲基化的方法.方法 以肺癌细胞株NCI-H460作为RAssF1A基因启动子区甲基化阳性样本,传统酚/氯仿法提取细胞DNA,经紫外分光光度计定量后以10倍稀释的浓度梯度依次投入到200 μl健康人血浆中,制备得到模拟肺癌患者血浆.用磁珠法从模拟血浆样本和15例早期肺癌患者血浆中提取总DNA.对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以TaqMan技术的实时荧光定量甲基化特异性PCR(MSP)进行检测.以模拟血浆样品作为标准品,用外标准曲线法对肺癌患者血浆中的甲基化RASSF1A进行定量.结果 实时荧光定量MSP对模拟肺癌患者血浆的检测最低限为150拷贝(甲基化的肿瘤DNA)/ml(血浆).15例肺癌患者5例RASSF1A甲基化阳性(33.3%).5例肺癌患者血浆中甲基化的RASSF1A基因的浓度分别为2.56×103,8.20×104,1.45×104,3.31×104和4.24×104拷贝/ml.结论 实时荧光定量MSP法检测肺癌患者血浆DNA中RASSF1A基因甲基化,灵敏度高,特异性强.     

胶质瘤患者RASSF1A基因转录表达和启动子区甲基化的研究

目的 探讨RASSF1A(RAS association domain family 1A)基因mRNA表达水平和基因启动子区CpG岛甲基化程度及其与启动子甲基化的关系。方法 用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测28份胶质瘤组织和4份正常脑组织中RASSF1A基因mRNA相对表达水平;用甲基化特异性PCR方法研究胶质瘤组织、正常脑组织和U251细胞株中,RASSF1A基因启动子区CpG岛甲基化状态。结果 RASSF1A mRNA在4份正常脑组织中全部表达;在脑胶质瘤中表达缺失率为21.4％(6/28),且表达量低于正常脑组织,但与患者年龄、性别、肿瘤大小、恶性程度间的差异无显著意义(P>0.05)。按病理学分类,胶质母细胞瘤与少突胶质肿瘤的差异有显著意义(P=0.011)。脑胶质瘤中RASSF1A基因启动子发生甲基化的频率为39.3％(11/28),正常脑组织和U251细胞株中,RASSF1A基因启动了未发生甲基化。11份启动子区甲基化的胶质瘤标本中,5份同时伴mRNA表达缺失(P=0.022)。结论 RASSF1A基因启动了在胶质瘤中发生异常甲基化。尽管RASSF1A mRNA在脑胶质瘤中表达缺失并不广泛,但其表达普遍下调。推测启动子区CpG岛甲基化可能是导致RASSF1A基因在胶质瘤中表达缺失或表达水平下调的一种机制。     

膀胱癌和肾癌中RASSF1A和BLU的甲基化状态

目的探讨RASSF1A和BLU在膀胱癌和肾癌中启动子甲基化状态及其意义。方法采用甲基化特异性PCR（MSP）技术分别在45例膀胱癌组织和相应癌周正常组织、12例肾癌组织及其相应癌周正常组织和3例非肿瘤患者正常膀胱组织中检测RASSF1A和BLU启动子区域的甲基化状态。结果膀胱癌组织中,RASSF1A和BLU甲基化率分别为55.6%和31.5%;肾癌组织中,两基因甲基化率为66.7%和33.3%。RASSF1A和BLU启动子甲基化状态与膀胱癌临床病理参数无明显相关性（P〉0.05）。在膀胱癌或肾癌中,RASSF1A和BLU启动子甲基化状态之间均无明显相关性（P〉0.05）。结论膀胱癌和肾癌中,RASSF1A和BLU频繁发生高甲基化,高甲基化可能参与膀胱癌和肾癌两类肿瘤的发生。     

甲基化特异性PCR在原发性肝细胞癌p16INK4A基因甲基化检测中的应用

目的设计一种将亚硫酸氢化测序PCR和甲基化特异性PCR相结合的巢式PCR技术，即BS—MSP技术，对原发性肝细胞癌手术切除组织中p16INK4A甲基化情况进行检测。方法基因组DNA经亚硫酸氢化修饰后，首先通过亚硫酸氢化测序PCR评估模板的质量，然后再分别用甲基化和非甲基化特性PCR分析基因的甲基化状态，并将所得的扩增产物进行测序验证。结果在40例HBV感染的肝细胞癌中，有3例（7．5％）因模板质量原因无法检测，其余37例标本中p16INK4A基因甲基化发生率为78％，测序结果证实了所用方法的可行性。结论BS-MSP技术对于肿瘤发生过程中基因甲基化的研究，以及临床诊断方面都具有一定的应用价值。     

肾癌组织中BHD、RASSF1A、SPINT2基因启动子的甲基化研究

目的：检测肾癌组织中伯特-霍格-杜贝（BHD）、Ras相关结构域家族（RASSF）1A、丝氨酸蛋白酶抑制剂（SPINT）2基因启动子的甲基化状态,探讨其在肾癌发病中的可能作用。方法：收集肾肿瘤组织标本24份,其中透明细胞癌19份、错构瘤2份、癌旁组织3份,应用甲基化特异性聚合酶链反应法分别检测其BHD、RASSF1A、SPINT2基因启动子区CpG岛甲基化状态。结果：19例透明细胞癌同时检出3种抑癌基因甲基化3例,2种抑癌基因甲基化9例,1种抑癌基因甲基化7例。2例错构瘤中检出1种抑癌基因甲基化1例,3例癌旁组织中检出2种抑癌基因甲基化1例。检出BHD基因甲基化9例,均为透明细胞癌。检出RASSF1A基因甲基化8例,其中透明细胞癌7例,癌旁组织1例。检出SPINT2基因甲基化20例,其中透明细胞癌18例,错构瘤1例,癌旁组织1例。结论：肾癌组织中BHD、RASSF1A、SPINT2基因启动子区存在甲基化状态,抑癌基因甲基化可能在肾癌的发病机制中起重要作用。     

结肠癌中RASSF 1A基因启动子甲基化及其临床意义

本研究探讨结直肠癌组织中RASSF1A基因启动子甲基化和mRNA表达异常与结直肠癌病理生物学特征的关系,为阐明抑癌基因RASSF 1A基因在结直肠癌发生发展中作用及其分子机理提供有力科学实验依据。     

抑癌基因RASSF1A与RASSF1B基因的关系

目的：研究RASSF1基因2个转录本基因在胃癌组织及相对应的癌旁组织中表达情况以及RASSF1 2个转录本基因与肿瘤发生的相关性。方法：设计特异性的引物,用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法检测胃癌及癌旁组织中RASSF1家族中2种不同转录本mRNA的表达情况。结果：40例胃癌组织中RASSF1A基因表达缺失率为60.2%（24/40）,RASSF1B基因表达缺失率为37.5%（15/40）。结论：RASSF1A和RASSF1B2种转录本在胃癌组织中的表达下调,RASSF1A基因在胃癌的发展中起重要的抑制作用,RASSF1B的表达还可能与细胞的分化程度有关。     

宫颈脱落细胞RASSF1A基因甲基化在宫颈癌中的临床意义

目的研究宫颈脱落细胞RAS相关区域家族1A(RASSF1A)基因启动子甲基化在宫颈癌中的临床意义。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应检测宫颈癌患者和健康女性宫颈脱落细胞RASSF1A基因启动子甲基化,分析与病理因素间的关系。结果宫颈癌患者宫颈脱落细胞RASSF1A基因启动子甲基化率为64.0%,高于健康女性的1.3%(P<0.05)。宫颈脱落细胞RASSF1A基因启动子甲基化率在宫颈癌不同组织学分级、肿瘤最大径、淋巴结转移、器官转移、Figo分期患者间的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论宫颈脱落细胞RASSF1A基因启动子甲基化与宫颈癌病理因素密切相关,可作为宫颈癌病情判断和预后评估的标志物。     

应用MSP方法检测非小细胞肺癌RASSFlA基因启动子甲基化

目的探讨应用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测非小细胞肺癌（NSCLC）RASSF1A基因启动子甲基化情况。方法留取58例非小细胞肺癌患者手术标本及正常肺组织，甲基化特异性PCR分析RASSF1A基因启动子甲基化情况。结果58例非小细胞肺癌中RASSF1A基因启动子甲基化阳性率为34．5％，甲基化与各临床参数之间无显著相关性。结论原发性非小细胞肺癌中存在着较高比例的RASSF1A启动子过度甲基化，提示RASSF1A在非小细胞肺癌的发生中起着重要作用。     

Dickkopf-1基因在宫颈鳞癌组织中的甲基化研究

目的检测Dickkopf-1(DKK1)基因在宫颈鳞癌组织中的甲基化状态,分析其临床意义。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测28例宫颈炎、20例CINⅠ、31例CINⅡ~Ⅲ及36例宫颈鳞癌组织中DKK1基因启动子区甲基化情况,并分析宫颈鳞癌组织中DKK1基因甲基化水平与临床病理特征之间的相关性。结果宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ~Ⅲ和宫颈鳞癌组中DKK1基因甲基化阳性率分别为10.7%、10%、32.3%和44.4%。宫颈鳞癌组织的甲基化阳性率明显高于宫颈炎和CINⅠ组,DKK1基因启动子甲基化与肿瘤分化程度以及肿瘤的直径相关。结论 DKK1基因启动子区甲基化检测可能为宫颈鳞癌的诊断以及鉴别诊断提供一个新的检查方法。     

抑癌基因RASSF1A及其甲基化的研究进展

RASSF1A基因位于染色体3p21.3区,是一种新型抑癌基因,多项研究表明它可参与细胞凋亡和多种恶性肿瘤的发生。在多种肿瘤中失活,该基因的失活与其启动子区CpG岛甲基化有关。通过逆转RASSF1A基因甲基化状态使其重新表达,为肿瘤的治疗提供了新思路。     

妊娠中期妇女超甲基化 RASSF1A 基因表达水平与子痫前期的关系

目的：探讨妊娠中期妇女血浆中超甲基化 RASSF1A 基因表达水平变化与子痫前期的关系。方法选择规律产前检查孕妇506例,分别于孕15～19周及孕20～24周采外周血,同时监测孕妇血压、尿蛋白值,其中诊断为妊娠期高血压疾病的孕妇中包括子痫前期组（48例）、妊娠期高血压组（48例）,从同期单胎健康孕妇中随机选取96名为对照组。收集入组孕妇外周血,提取游离DNA,经甲基化敏感的限制性内切酶消化处理,联合荧光定量 PCR 检测血浆中超甲基化 RASSF1A 基因的表达水平,分析其与子痫前期的关系。结果 孕15～19周,子痫前期组及妊娠期高血压组的超甲基化 RASSF1A 基因表达水平均高于对照组（P ＜0．05）,子痫前期组与妊娠期高血压组组间比较差异无统计学意义（P ＞0．05）。孕20～24周,子痫前期组孕妇血浆中超甲基化 RASSF1A 基因表达水平高于妊娠期高血压组及正常妊娠组（P ＜0．05）,妊娠期高血压组孕妇血浆中超甲基化 RASSF1A 基因表达水平亦高于正常妊娠组（P ＜0．05）。结论妊娠中期妇女血浆中超甲基化 RASSF1A 基因水平升高可能提示子痫前期的发生。     

RASSF1A 基因甲基化与胃癌的相关性分析

目的：探讨 RASSF1A 甲基化与胃癌临床病理资料的关系。方法通过计算机检索 PUBMED （1998．01～2012．07）、中国知网（1998．01～2012．07）、万方数据库（1998．01～2012．07）等数据库,收集RASSF1A 甲基化与胃癌关系的相关文献,按纳入与排除标准筛选病例对照试验。评价质量及提取资料后,采用 RevMan 5．1软件对数据进行 Meta 分析。结果共检索到36篇,经筛选最终纳入9篇,共506例胃癌组织。Meta 分析结果显示,早期（Ⅰ期-Ⅱ期）与中晚期胃癌（Ⅲ期-Ⅳ期）患者胃癌组织中 RASSF1A 甲基化阳性率合并的 OR 值为0．36[95％CI（0．22,0．60）,P ＜0．01],中高分化与低分化胃癌组织中 RASSF1A 甲基化率合并的 OR 值为0．73[95％CI（0．39,1．34）,P ＞0．05],淋巴结转移与无转移患者胃癌组织中 RASSF1A 甲基化阳性率合并的 OR 值为2．07[95％CI（1．19,3．60）,P ＝0．01],男性与女性患者 OR 值为1．09[95％CI（0．68,1．73）,P ＞0．05],＜60岁与≥60岁患者胃癌组织中 RASSF1A 甲基化阳性率合并的 OR 值为0．77[95％CI （0．47,1．25）,P ＞0．05],肠型与弥漫型患者胃癌组织中 RASSF1A 甲基化阳性率合并的 OR 值为0．95[95％CI（0．37,2．46）,P ＞0．05]。结论胃癌患者病理分期、有无淋巴结转移与胃癌组织 RASSF1A 甲基化密切相关,中晚期胃癌患者 RASSF1A 甲基化阳性率高于早期胃癌患者,有淋巴结转移的胃癌患者 RASSF1A 甲基化阳性率较高。而胃癌患者的性别、年龄、分化程度、Lauren 分型与胃癌组织中的 RASSF1A 甲基化阳性率无显著相关性。     

白血病患者RASSF1A基因甲基化状态及其临床意义

目的研究白血病患者骨髓中Ras相关区域家族1A(RASSF1A)基因启动子甲基化状态及其临床意义。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测86例白血病患者和60例非白血病患者对照组骨髓中RASSF1A基因启动子的甲基化状况,分析不同白血病类型之间的差异。结果 86例白血病患者中,有12例(13.95%)RASSF1A基因启动子甲基化,而60例非白血病患者骨髓均未检测到甲基化,二者比较差异均有统计学意义(P<0.05)。淋巴系白血病患者RASSF1A基因甲基化比例(23.1%)明显高于髓系白血病患者(6.4%)(P<0.05)。结论白血病患者骨髓中存在RASSF1A基因甲基化,淋巴系白血病甲基化比例明显高于髓系白血病。RASSF1A基因甲基化检测可能成为白血病分型的生物标志物之一。     

改进的PCR在抑癌基因启动子CpG岛甲基化检测中的应用

目的改进聚合酶链反应(PCR),并检验改进后的方法在甲基化检测中的可行性。方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,提取基因组DNA,利用亚硫酸氢盐测序法,用常规、降落及改进PCR分别扩增,比较扩增效果,PCR产物纯化回收后,TA克隆入载体pGEM-T,转化大肠杆菌(E.coliDH5α),筛选阳性克隆,经PCR扩增鉴定后获得阳性重组质粒,测序比对。结果改进后PCR与常规、降落PCR相比,扩增效率增高,二聚体及非特异性扩增减少;测序结果显示,MCF-7细胞基因组DNA中,RASSF lA基因启动子CpG岛是高甲基化的,E-cadherin基因启动子CpG岛未呈现高甲基化状态。结论改进后方法提高了以PCR为基础的甲基化分析的可行性,更适用于基因甲基化状态的检测,并为扩增富含CG的基因启动子区域提供参考。