未培养环境微生物培养方法的研究进展

自然界中微生物种类繁多、功能多样、分布广泛,对人类健康安全、生态稳定和物种进化等发挥不可替代的作用。尽管微生物培养技术至今已有一百多年,然而由于各种限制因素的制约,目前成功分离培养的微生物仅占0.1%-1.0%,自然界中仍有十分丰富的微生物资源有待挖掘和开发利用。如何理解难培养微生物的制约因素并探索作用机制,同时借此开发新型微生物培养方法则尤为必要。本文首先分析了典型环境微生物生长的限制因素,然后介绍了目前利用传统培养改进措施进行分离筛选的研究成果,进一步综述了原位培养、共培养、微流控培养技术、细胞分选技术等新型培养技术在难培养微生物分离培养中的应用,最后对目前培养法存在的瓶颈问题进行深入分析,提出今后可在多技术联合使用、难培养微生物复苏机制、微生物互作机制、代谢途径与调控机制等方面进行研究,以期为今后微生物资源开发利用提供借鉴。     

未培养微生物研究策略概述

基于未培养微生物数量巨大、种类繁多、基因资源丰富等特点。扼要介绍了未培养微生物的纯培养分离策略和分子生物学研究方法。随着新型培养策略如原位仿生境培养、限制性培养、单细胞微操作等的出现,使未培养微生物的纯培养成为可能。同时由于宏基因组学和高通量DNA测序等现代分子生物学方法技术的逐渐成熟,使来源于未培养微生物的新基因和新活性物质的分离筛选出现了新的机遇与挑战。     

口腔未培养微生物分离培养策略的研究进展

口腔微生物是人体微生物组的重要组成部分,其群落组成丰富且独特。现有研究显示,口腔微生物与龋病、牙周炎等口腔健康问题有直接的联系,因而具有重要的研究价值。随着高通量测序技术的发展,人们对口腔中未培养微生物多样性的认识不断加深,这进一步催生对微生物分离培养技术需求的增加。为此,本文将围绕口腔未培养微生物及其分离培养策略的研究进展,首先介绍口腔中未培养微生物的研究现状;其次分析口腔微生物分离培养中可能的限制因素;最后综述微生物分离培养技术发展及其在口腔未培养微生物研究中的应用。全文旨在为口腔未培养微生物的分离培养提供思路和技术参考。     

单细胞分选技术在微生物分离与培养中的应用与展望

自然界相当多的微生物是未培养的,对这些"微生物界暗物质"进行研究,对于研究微生物的进化过程,充分利用微生物资源具有重要意义。对未培养微生物的分离与培养已成为当前国际研究热点,本文对显微操作、荧光活化分选、微流控分选、光镊技术、激光诱导向前转移等可用于微生物分离与培养的技术原理、发展历程进行简单介绍,对比分析了每种分选技术的优点与不足,重点阐述了激光诱导向前转移技术应用于微生物分离的技术优势,并进一步对未来应用于未培养微生物的研究进行了初步展望。     

连续流生物反应器技术在微生物培养中的应用

自然环境中99%微生物在实验室条件下仍是不能被培养的,称之为"未培养"微生物或微生物"暗物质"。对其进行研究不仅有助于认识环境中微生物代谢多样性,丰富生命之树,同时未培养微生物还蕴含着巨大的新基因和新天然产物资源。但传统培养技术的局限性阻碍了"未培养"微生物资源的开发和利用。虽然随着分子生物学技术的发展,可以直接从环境中获得未培养微生物的遗传信息,分析微生物的广泛代谢多样性,但微生物的生理特征和代谢产物等分析仍然需要建立在研究纯菌株的基础上。目前,已经有很多新颖的培养技术被研发,如原位培养技术、共培养技术和连续流生物反应器培养技术等用于挖掘未培养微生物资源。本文主要介绍了连续流生物反应器培养新技术的发展与改进,探讨了"未培养"微生物培养技术及设备的发展方向,以进一步促进"未培养"微生物资源的开发与利用。     

海绵中可培养与原位微生物组成的DGGE指纹分析

采用不依赖于分离培养的PCR-DGGE基因指纹技术对我国南海4种海绵体内的原位微生物种群组成以及混合培养的海绵微生物组成进行分析,通过比较不同指纹图间的差异与相似性,揭示可培养微生物与海绵原位存在的微生物的关系。由实验可以看出,来自同一海域的不同海绵体内的微生物存在宿主特异性,不同的培养条件是影响微生物可培养的重要因素,目前所能培养的海绵微生物还仅占自然环境下海绵微生物总量的很少一部分。     

海绵中可培养与原位微生物组成的DGGE指纹分析*

采用不依赖于分离培养的PCR-DGGE基因指纹技术对我国南海4种海绵体内的原位微生物种群组成以及混合培养的海绵微生物组成进行分析,通过比较不同指纹图间的差异与相似性,揭示可培养微生物与海绵原位存在的微生物的关系。由实验可以看出,来自同一海域的不同海绵体内的微生物存在宿主特异性,不同的培养条件是影响微生物可培养的重要因素,目前所能培养的海绵微生物还仅占自然环境下海绵微生物总量的很少一部分。     

自然界中不可培养微生物的研究进展

尽管微生物培养技术已经发展了几十年,但是环境中可培养的微生物比例仍然较低。目前研究者对微生物不可培养的原因有了进一步的了解,其关键在于：高浓度的营养基质、无法实现原位培养、不明确环境中微生物之间的相互作用、缺乏尖端的微生物检测方法等。研究者为了克服这些培养障碍,不断研究出许多提高微生物培养效率的方法,简要介绍改进培养基、发展新的培养条件等提高微生物可培养性的方法。     

海洋动物来源微生物分离培养的新方法

海洋动物体内有着丰富的微生物,它们可以帮助动物宿主合成一些营养物质或者抵御其他动物侵害所需的化合物。在海洋动物来源微生物的生物活性化合物中,目前已有功能较好且应用于临床治疗的化合物。由于实验室分离培养条件的限制,目前仅有小部分的微生物被分离利用。因此开展新颖而有效的海洋动物来源微生物分离培养方法的研究十分必要。本文概括了近些年从海洋动物中分离微生物的新方法的结果和不足,这些方法包括原位培养技术、电回收法和培养基的改良等,重点介绍了扩散盒技术、I-tip技术和微囊包埋技术等。这些新方法的应用有助于获得更多新的微生物菌种和微生物次生代谢产物,了解微生物与动物宿主之间的关系,以及扩大海洋微生物资源的开发和利用。     

昆虫肠道微生物分离培养策略及研究进展

昆虫肠道作为一种特殊生境,生存着多种多样的共生微生物,并且肠道内的很多微生物与自然界其他生境的微生物种类显著不同。基于对纯培养微生物的研究,科学家们发现,肠道微生物与昆虫营养、生长发育及免疫等功能密切相关。因此,分离培养是发现微生物新种类、新基因和新功能的基础。然而,自然界可培养的微生物大约只占总数的1%。为了能够对更多的微生物进行分离和培养,近二十年来,微生物学家们发展了诸多新的培养技术和策略并利用它们从昆虫肠道分离出了很多新的难培养微生物。这些新的微生物种类极大地丰富了我们对肠道共生微生物生理作用与功能的认识。以此为基础,本文综述了昆虫肠道微生物分离培养的策略及研究进展,并对未来该领域的发展进行了展望。     

未/难培养微生物可培养策略研究：机遇与挑战

微生物分布广泛、种类众多、功能多样,虽体积微小但功能强大,关乎人类的安全健康和生态的稳定发展,在整个地球生命系统中起着举足轻重的作用。17世纪以来,研究者们一直努力获得、了解和利用这些微生物,然而目前分离方法的局限性使得环境中绝大部分微生物仍不能被纯培养,严重阻碍了我们对微生物生命活动规律的认知。因此,如何分离获得这些仍未被培养出来的“暗物质”是微生物研究面临的严峻挑战和重大机遇。本文分析了环境中制约微生物分离培养的因素,综述未/难培养微生物可培养研究的最新进展,着重论述优化的传统培养方法及网络导向培养、膜扩散培养、微流控分选培养和细胞分选培养等新型技术的应用,并对未来研究进行展望,探索多技术联合使用策略,为未/难微生物资源的挖掘及开发利用提供借鉴。     

未培养真菌分离培养方法初探

据估计自然界中真菌有220万到380万种,目前已经描述的真菌仅约12万种,不超过总数的8%。大量基于高通量测序的研究显示,自然环境中蕴藏的真菌多样性可能远远超出我们的预估。然而基于传统的分离培养技术的研究中,大量真菌却因难以获得纯培养而未被认知。因此探索新的真菌分离技术有助于提高我们对自然界中真菌多样性的认识,并获得可供开发利用的全新生物遗传资源。本研究以淡水湖底泥为调查对象,从优化培养条件和原位培养两个方面探索未培养真菌的分离培养方法,并与传统培养方法及免培养的高通量测序结果比较,评估各方法的分离效果。结果显示,低温分离显著影响获得的真菌组成,有利于嗜冷真菌的获得;无论在4℃低温还是25℃常温条件下,在培养基中添加维生素都能显著提高分离获得的真菌多样性,在属级水平上提高比例分别高达207%和81%。相较于传统25℃稀释平板法,基于分离芯片技术的原位培养在分离纯化效率、未知真菌捕获率以及物种多样性和均匀度等方面具有显著优势,显示原位培养技术在未来真菌分离培养中可能具有极大应用前景。     

南极乔治王岛冰锥洞微生物培养探索

【目的】南极洲具备独特的环境和相对的生物地理隔离,南极洲各类生境中蕴藏了大量尚未培养和难培养的微生物,也是新颖微生物物种的重要来源之一。本研究以南极冰锥洞这类特殊生境为研究对象,通过培养条件的多样化提升南极微生物的培养率和多样性,揭示南极冰锥洞可培养微生物类群多样性,为该环境可培养微生物功能研究奠定基础,也为南极极端环境未培养微生物的培养方法提供借鉴。【方法】通过采用不同培养基添加复苏促进因子(resuscitation promoting factor, Rpf)的方式,提高南极柯林斯冰盖冰锥洞生境中微生物的可培养率,探究该生境中微生物的多样性。采用4种不同营养水平的培养基,平行添加Rpf进行菌株培养,经分离纯化与16S rRNA基因鉴定,分析冰锥洞可培养微生物的多样性及培养条件对多样性的影响。【结果】本研究共分离培养细菌407株,涵盖5个门、18个科、29个属,其中：放线菌门(Actinomycetota)为优势门,占72.73%;微杆菌科(Microbacteriaceae)为优势科,占69.78%;Lacisediminihabitans属为优势属,占45.70%。从培养基效果...     

肠道微生物培养的研究进展及应用

肠道中栖居着组成复杂、功能多样的微生物群,这些微生物群在宿主免疫、营养吸收、代谢调节等方面发挥着重要作用。随着测序技术的快速发展,肠道微生物研究通过16S rRNA基因测序和宏基因组测序产生了大量的数据,其中许多未组装的序列成为微生物“暗物质”。近年来,不少研究利用多种不同微生物分离培养方法,结合高通量鉴定技术,从人、小鼠、猪肠道中分离了大量的微生物,丰富了菌株资源,为解析微生物“暗物质”以及后续肠道微生物功能和应用研究提供了基础和保障。尽管微生物的可培养性受到多种因素的影响,大部分微生物尚处于“未培养”的状态,但无论是病因研究还是生理和遗传特征的解析都离不开微生物实体资源的获取。肠道微生物的分离培养对微生物研究从关联分析向菌群功能验证、因果机制解析和功能菌株开发的深入研究具有重要意义。本文旨在探讨和综述影响微生物可培养性的因素,总结回顾肠道微生物的培养方法并阐述肠道微生物培养研究的进展,以期为肠道微生物培养研究提供新的视角。     

人体微生物“暗物质”：勘探、培养及应用

微生物广泛存在于自然界,其代谢活动对环境和人类健康有重要影响。定植于人体表面和内部的微生物无论从细胞还是基因数量上都远超人体,而90%以上的微生物是未培养的,这严重限制了对人体共生微生物功能的研究。因此,鉴定和分离未知或以前无法培养的微生物的必要性是显而易见的。随着各种技术的进步,可培养的微生物数量不断增加,但仍存在不足。本文论述了利用基因组测序探索微生物“暗物质”的效果,以及分离培养未培养微生物和对其进行开发利用的重要性;综述了当前有效的微生物鉴定和培养技术,如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）、基因组信息抗体工程等;阐述了微生物与人体健康的相互作用,揭示了人体微生物“暗物质”的潜力,对人体微生物“暗物质”未来的研究和发展进行了讨论。     

未培养微生物分离培养技术研究进展

自然环境中的微生物具有多样性高的特点,而99%的微生物使用传统的方法仍然是"不可培养的",并且能被培养的小部分微生物不能够代表微生态的多样性。因此,确定新的微生物物种和功能仍然是目前的重要任务。本文将综述基于调整培养基、考虑微生物间相互作用、捕获分离培养、高通量分离培养来分离培养微生物群体中的未培养微生物的方法,及功能性研究的进展情况。     

太原北齐徐显秀墓壁画可培养真菌多样性及危害防治

【背景】原址保护的墓葬壁画普遍存在着有害微生物的威胁,对壁画菌害的长效防治是文物保护领域久未解决的难题。【目的】确定太原北齐徐显秀墓墓道霉变壁画上可培养真菌多样性,分离优势菌株,并筛选长效的生物杀灭剂,为墓葬壁画菌害的抢救性防治提供科学依据。【方法】利用无菌棉签采集壁画表面白色菌丝体样品,使用扫描电子显微镜分析病害菌微观形貌特征;通过培养、分离及纯化获得真菌菌株,运用形态学和分子技术鉴定种属;结合实验室抑菌圈测试和原位杀菌试验,分析不同生物杀灭剂的抑菌圈大小、杀菌后原位可培养微生物浓度以及ATP荧光值差异,以期找到长效的生物杀灭剂。【结果】霉变壁画表面有大量菌丝体并伴有分生孢子,白色菌丝体样品中可培养真菌属于子囊菌门(Ascomycota)的6个属,其中白色侧齿霉菌(Parengyodontium album)相对丰度最高(98.13%),为优势病害菌。经实验室和原位试验筛选评估,确定了双氯酚复配型杀灭剂(0.5%双氯酚+75%乙醇)对该病害真菌杀灭效果最好,在7年连续监测期内未出现病害菌的复发。【结论】白色侧齿霉菌是引起徐显秀墓墓道壁画霉变的主要可培养病害菌;双氯酚复配型杀菌剂用于该病害菌防治的时效性最长;建议后期结合抢救性防治、环境调节和跟踪监测,以达到墓葬壁画微生物危害的长效防控。     

宏基因组学在未培养微生物研究中的应用

自然环境中约99%的微生物不能用传统的分离培养方法获得其纯培养。随着宏基因组技术的出现,人们可以对这一庞大的未知世界进行多方面的研究,包括微生物的生理、生态及其基因功能等。利用这一技术,研究者已经对地球上的许多生境进行了研究,并取得了很多新的成就。简要概述这一技术在研究未培养微生物方面的应用。     

环境微生物培养新技术的研究进展

遍布于地球上各种生境中的微生物具有丰富的物种多样性.迄今为止,能够在实验室条件下培养的微生物仅仅是其中的一小部分,微生物物种的绝大多数还都难以在现有培养技术和条件下进行繁殖和生长.人们把那些尚未在实验室获得培养生长的微生物称之为未培养微生物(Uncultured microorganisms).本文概述了一些制约微生物培养生长的影响因素,重点介绍了近年来出现的一些新颖独特的环境微生物培养技术和方法,包括稀释培养法、高通量培养技术、模拟自然环境的扩散盒技术、土壤基质膜装置、细胞微囊包埋技术等.此外,本文还总结了通过改善微生物培养条件、设计开发新型的微生物培养基等方面取得的令人瞩目的进展.这些新颖培养技术和培养方法的出现,显著提高了微生物的可培养性,发现和鉴定了许多新的微生物物种,极大地丰富了可培养微生物的多样性和微生物资源,并为深入研究和开发微生物奠定了良好的资源研究基础.     

宏基因组技术在开发未培养环境微生物基因资源中的应用

环境微生物宏基因组是一个巨大的基因资源库,但是仅有0.1%～1%的微生物在现有技术条件下是可培养的,因此致使未培养微生物基因资源的开发利用受到限制.宏基因组技术直接提取环境样品总DNA,避开了微生物分离培养的问题,极大扩展了微生物资源的利用空间,增加了获得新生物活性物质的机会.简要介绍了宏基因组的概念及宏基因组克隆技术的基本操作流程和技术要点,重点阐述了目的基因富集、核酸提取、载体和宿主系统选择、宏基因组文库筛选等"瓶颈"技术的研究进展.目的基因富集技术主要包括稳定同位素探针(SIP)、抑制消减杂交(SSH)和差异显示(DD)等.基因文库筛选分为序列依赖性筛选和非序列依赖性筛选,其中序列依赖性筛选包括特定基因PCR、反转录PCR (RT-PCR)、DNA微阵、亲和捕获等技术;非序列依赖性筛选主要指基于基因表达活性筛选和基因"陷阱"技术等.此外,介绍了一些近年来通过构建宏基因组文库筛选目的基因的应用实例.