一株产紫杉醇罗汉松内生真菌的分离和鉴定

[目的]紫杉醇是重要的抗癌药物,主要从罗汉松等植物中提取,为了保护罗汉松等种质资源,本文从罗汉松植株中分离产紫杉醇内生真菌,并对内生真菌所产紫杉醇的抗肿瘤活性进行了分析.[方法]采用组织块法自罗汉松的根、茎、叶等组织中分离内生真菌;通过四唑蓝(Methyl ThiazolylTetrazolium,MTT)比色法筛选有抗肿瘤活性的内生真菌菌株,通过薄层层析(Thin Layer Chro-matography,TLC)和高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)对内生真菌所产活性物质进行鉴定;采用抽提法抽提内生真菌所产紫杉醇,应用Vero细胞对抽提的紫杉醇的活性进行了分析.[结果]从罗汉松属(Podocrapus)植物中分离到155株内生真菌,其中28株内生真菌具有较高的抑癌活性.将其中一株菌株A2命名为EPTP-1,经形态学和分子分类学分析鉴定为烟曲霉(Aspergillus fumigatus).菌株EPTP-1中抽提的紫杉醇5.553μg/L～555.3 μg/L作用24h表现出明显的致细胞凋亡作用.菌株EPTP-1发酵5天时紫杉醇的产率为0.5578±0.0294 mg/L.[结论]从罗汉松中分离到了一株产紫杉醇内生真菌EPTP-1,可作为紫杉醇类药物工业化生产的候选菌株.     

一株产白藜芦醇虎杖内生真菌的分离和鉴定

从药食同源植物虎杖根中分离得到15株内生真菌,在马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中发酵后对所有内生真菌发酵液进行HPLC检测,有5株菌的发酵液中相关成分与白藜芦醇标准品保留时间一致,确定5株菌能产生白藜芦醇,在此基础上测定了5株菌的生长曲线。其中菌株H8生长最旺盛,白藜芦醇产量最高。应用形态学及ITS序列分析方法对其进行鉴定,确定为拟轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides。     

一株产紫杉醇内生真菌YN6的分离及鉴定

从云南红豆杉（Taxus yunnanensis）树皮内表皮中分离得到75株内生真菌,采用基于紫杉醇合成关键酶10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-O-乙酰基转移酶（10-deacetylbaccatin Ⅲ-10-O-acetyl transferase,DBAT）和C-13苯丙氨基侧链CoA乙酰基转移酶（C-13-phenylpropanoid side chain-CoA acyltransferase,BAPT）基因为标志分子的快速筛选方法获得一株可产紫杉醇的内生真菌YN6,并通过高效液相色谱法和质谱法对其紫杉醇进行分析.同时,通过对内生真菌YN6的形态特征分析以及18S rDNA序列分析将其初步鉴定为拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis sp.）真菌. 拟盘多毛孢YN6的紫杉醇产量约为120~140 μg/L,是目前已报道的紫杉醇产量较高的野生菌株之一. 拟盘多毛孢YN6的发现为微生物发酵生产紫杉醇提供了潜在的优良种质资源.     

重楼中一株产纤维素酶内生真菌的分离及鉴定

从重楼根茎中分离、鉴定具有产纤维素酶活性的内生真菌。采用表面消毒法从重楼块茎中分离内生真菌;用纤维素酶活性CMC平板检测分离菌株的产纤维素酶活性;对高产菌株进行形态学观察和分子生物学测序鉴定;探究影响纤维素酶活力的因素;利用平板法检测该株菌产其他胞外水解酶的活性。从3个来源的重楼中分离出41株内生真菌,通过平板检测发现AS-5、AS-7、AS-9和AS-18菌株能产生纤维素酶,其中AS-9菌株活性最强;通过形态学观察和ITS、LSU序列分析将AS-9菌株鉴定为Setophoma terrestris;该菌在pH值为7.0和温度为28℃时表现出最大纤维素酶活性,紫外线照射对产纤维素酶活性无明显作用;检测发现AS-9菌株同时具有产酪蛋白酶、脂肪酶、天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶和脲酶活性。首次在重楼中发现内生真菌Setophoma terrestris,且具有较好的产纤维素酶能力,值得深入研究。     

一株产紫杉醇中国红豆杉内生真菌的分离和鉴定

从秦巴山区中国红豆杉茎和根中分离得到一批内生真菌,其中一株内生真菌LB-10的发酵液经紫外分光光度法、HPLC和HPLC-MS分析,表明其代谢产物中存在紫杉醇,含量为846.1μg/L。通过形态学研究、ITS序列分析,确定该菌株为绿僵菌。     

一株产没食子酸的茶条槭内生真菌的分离鉴定

从采自黑龙江省植物园的茶条槭(Acer ginnala Maxim.)的种子和枝条中分离内生真菌,用形态学和分子生物学方法鉴定分离菌株,应用高效液相色谱法检测内生真菌中没食子酸含量。结果从分离得到的链格孢属(Alternaria)菌株中选出没食子酸含量为9.52mg/g的高产菌株CP11。     

一株银杏内生真菌的分离及其产黄酮类物质的初步研究

从银杏(Ginkgo biloba L.)树叶中分离得到一株内生真菌EG4,经鉴定为刺盘孢Colle-totrichum sp．。应用薄层层析、显色反应及分光光度法对该菌的发酵产物进行了初步分析,结果表明该真菌能够产生黄酮类化合物。     

无花果内生真菌的分离及其鉴定

从无花果(Ficus carica)的根、茎、叶中分离得到87株内生真菌,经显微形态特征观察鉴定为14个属,其中根部35株涉及8个属,茎部37株涉及10个属,叶部15株涉及3个属。结果表明,无花果的不同部位内生真菌的数量、分布和种群存有差异。     

一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生真菌的分离和鉴定

从药用蕨类植物蛇足石杉叶中分离得到53株内生真菌,在马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）中发酵后对内生真菌发酵提取物液进行TLC、HPLC 和ESI-MS检测,结果表明菌株LF40为产石杉碱甲内生菌株,含量达80.1μg/gdcw,并具有体外乙酰胆碱酯酶抑制活性;运用形态学及ITS-rDNA序列分析方法对菌株LF40进行鉴定,确定为黄曲霉Aspergillus flavus LF40。     

产黄酮银杏内生真菌的分离与鉴定

本研究利用组织块培养法从健康的银杏根、茎中分离得到116株内生真菌。通过显色反应、高效液相色谱(HPLC)等方法对内生真菌的代谢产物进行分析,最终筛选出2株能够产黄酮的内生真菌,利用分光光度法测定其发酵液中总黄酮产量均达到20 mg/L以上。形态学特征和真菌r DNA间隔序列(Internal Transcribed Spacer,ITS)的系统进化分析结果表明两株菌分别属于青霉属和毛霉属,其中青霉属为产黄酮银杏内生真菌的首次报道。本研究为利用微生物发酵生产黄酮类化合物奠定了良好的基础。     

银杏产黄酮内生真菌的分离与鉴定

为实现真菌发酵生产黄酮,用HPLC和氯化铝比色法,从四川、贵州、山东等地采集的银杏根、茎、叶中分离到7株产黄酮真菌。分子和形态学鉴定结果表明:这些菌株分别属于Colletotrichum和Fusarium,菌株QC102经鉴定为Colletotrichumacutatum Simmonds,其总黄酮产量为8.2μg/mL。     

南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离鉴定

从南方红豆杉(Taxus chinensisvar.mairei)植株分离到内生真菌63株,其中24株经鉴定分属于19个种(属).真子囊菌纲的2个属2株,半知菌纲的14个属22株.真子囊菌纲的无毛毛壳属(Achaetomiumsp.)的1株为新发现种.半知菌纲的葡萄孢属(Botrytissp.)1株和无孢菌群(Mycelia sterlia)2株的培养液,经浓缩萃取,薄层层析检测,Rf值分别为0.404、0.404、0.401,与紫杉醇对照品Rf值一致,为南方红豆杉产紫杉醇内生真菌.     

一株产重楼皂甙内生细菌的分离与鉴定

从产自四川彭州的华重楼(Parispolyphyllavar·chinensisFranch)地下块茎中分离得到16株菌。经以薯蓣皂甙元为标准对照的薄层层析分析,表明其中编号为SNUS-1(AY842149)的菌株能分泌重楼皂甙或其类似化合物。16SrDNA序列(约1,500bp)系统发育分析表明:菌株SNUS-1与Pseudomonastolassii(AF255336)和Pseudomonastolassii(D84028)的遗传距离分别为0和0·003,在系统进化树上三者又严格聚为一族,结合形态及生理特征确定其为托氏假单孢菌(Pseudomonastolassii)。     

一株产槲皮素类色素的银杏内生真菌的研究

从银杏树根中分离出70余株内生真菌.将它们置于马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基中培养,发现其中一株(Gh01)能产生橙黄色色素.经过化学反应及HPLC检测证明该橙黄色色素为槲皮素类糖苷.这是关于内生真菌产槲皮素类糖苷的首次报道.本文深入探讨了碳源,氮源,金属离子,初始PH及培养温度对色素产量的影响.PD液体培养基的最适培养温度和初始PH分别为28℃和7.0.正交设计结果显示:最适碳源和氮源分别为20g/L葡萄糖和5g/L蛋白胨.增加1g/L的氯化锌可提高色素产量.在最适培养条件下连续培养120h色素的产量可达到27.515g/L.     

一株灰肉红菇内生真菌的分离鉴定及其抑菌活性研究

灰肉红菇（Russula griseocarnosa）是岭南地区著名的野生食药用真菌。本研究通过组织分离的方法,从灰肉红菇子实体分离获得一株内生真菌,经形态学和分子生物学分析鉴定为爪哇虫草（Cordyceps javanica）。以牛津杯抑菌圈法及二倍稀释法测试了其菌丝体胞内和胞外多糖粗提物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的抑菌活性。结果表明：水溶性胞内、胞外多糖对金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌均具有抑菌活性,最低抑菌浓度（MIC）为37.5 mg/mL。     

一株产紫杉醇真菌的分离

从四川省阿坝地区生长的红豆杉树中,分离到一株内生丝状真菌.在液体培养基中, 该真菌于25℃经过3周发酵,其发酵液经HPLC和MALDI-TOF分析,结果表明,发酵液中含有紫杉醇.因此,这是一株产紫杉醇真菌, 暂定名为Taxomyces sp.     

一株具有脱胶功能大麻内生真菌的分离和鉴定

采用组织块法对大麻(Cannabis sativa)根、茎、叶等组织中的内生真菌进行分离,利用平板透明圈法筛选具有脱胶功能的菌株,对获得的脱胶菌菌株进行形态学鉴定和分子生物学鉴定。结果表明:(1)从大麻根、茎、叶的组织部位共分离得到内生真菌16株,茎部分离到9株真菌,叶部5株,根部2株。(2)编号为DM6的内生真菌具有较强的果胶分解能力,其透明圈直径为2.49cm。(3)形态学鉴定发现,内生真菌DM6不能产生孢子,菌丝较为粗壮、分支较少、有明显的隔;分子学鉴定表明,内生真菌DM6与Phoma aliena(KC311486)序列的相似性最高,为99%,并且在系统发育树上位于同一分支上。因而内生真菌DM6可以鉴定为茎点霉属一种(Phomasp.)。     

一株满江红内生真菌的分离鉴定及分生孢子发育研究

水生植物满江红是蕨类与固氮蓝藻的共生体。本研究旨在分离和鉴定它的另一种共生伙伴——内生真菌。经ITS测序和电镜观察,该分离物被鉴定为聚多曲霉,具有产生多种有经济价值的活性物质的潜力。用透射电镜观察其分生孢子发育和衰亡进程的结构特征,显示12 d培养物比6 d培养物有更多分生孢子以自噬的形式死亡,表明在后续开发研究中有必要通过优化发酵条件来调控分生孢子的发育状态以取得较高的产物得率。文中还对分生孢子的自噬进程作了较详细的描述及探讨。     

一株仙人掌植物内生真菌的分离鉴定及活性研究

从元江仙人掌的茎中分离到一株产广谱、高活性抑菌物质的内生真菌,经测定对细菌、植物病原真菌和皮肤致病真菌共21种病原微生物有较为明显的抑制作用。形态特征表明,该菌株与曲霉属（Aspergillus）中的土生曲霉（Aspergillus terreus）的特征基本一致,18SrDNA序列分析显示本菌株与土生曲霉的同源性高于99％,但该菌株的分生孢子梗上有明显的瘤状突起,不同于模式菌株。因此认为该菌株为土生曲霉的一个变种,命名为土生曲霉云南变种（Aspergillus terreus vat．yunnanensis）。并对其活性物质的生产条件进行了初步摸索,确定用查氏培养基为最佳种子培养基,PDA培养基为最佳发酵培养基,4d为最适发酵时间。     

一株产木质素降解酶真菌的分离与鉴定

从自然界中分离到一株产木质素降解酶真菌.平板显色反应显示,该菌株具有产多种木质素降解酶的能力,并通过酶活力测定得到证实.为确定该菌株的分类地位,对其ITS序列进行了扩增并测序,并利用MEGA4.0生物学软件计算其与同属其它菌株的遗传距离并构建系统发育树,在分子水平上确定它们之间的亲缘关系.试验结果表明,该菌株的ITS序列与Irpex lacteus乳白耙菌序列相似度达99%,且与Irpex lacteus XSD-2亲缘关系最近.