PCR－RFLP技术在检测登革病毒中的应用

从登革病毒感染的C₆/36蚊细胞培养液,感染的白纹伊蚊及患者血清中提取病毒RNA,用合成的一对引物通过逆转录一聚合醉链反应(RT-PCR)扩增.取产物用Hse Ⅲ醉切,琼脂精凝胶电泳,紫外透射观寮。结果,扩增的产物及阵切片段均与预期的靶序列长度和限制醉谱分析相一致。故应用PCR-RFLP(聚合醉链反应一限制醉醉切片段长度多态性分析)技术是诊断登革病毒感染的一种简易快速的新方法。     

疟疾的实时荧光PCR快速检测方法

目的:建立疟疾的实时荧光PCR检测方法并用于疟疾的快速检测。方法:设计了疟原虫通用型实时荧光PCR检测的引物和探针,建立了疟疾的实时荧光PCR检测方法。对40份疟疾镜检阳性样本和20份镜检阴性样本进行实时荧光PCR检测,并和巢式PCR方法检测结果进行了比较。结果:疟疾实时荧光PCR检测速度快,20分钟即可完成。40份镜检阳性样本的荧光PCR检测均为阳性,2份样本的巢式PCR结果为阴性;20份镜检阴性样本中有3份样本为实时荧光PCR阳性,其余17份样本为实时荧光PCR阴性,与疟疾巢式PCR检测结果相同。结论:该实时荧光PCR方法检测速度快,特异性强,准确性高,阳性率高,不易漏检,适用于疟疾的快速检验,这对防止该病在国境口岸的传入提供了技术依据。     

实时荧光PCR和RT-PCR方法检测甲型流感病毒的比较

目的比较实时荧光PCR检测(FQ-PCR)与RT-PCR在鉴定甲型流感病毒中的优劣,建立能快速简便、特异地从临床标本中检测并鉴定流感病毒的新方法。方法对200份临床采集的咽拭子样本进行FQ-PCR与RT-PCR检测,综合比较2种监测方法之间的差异。结果 FQ-PCR检测200份临床咽拭标本,96份甲型阳性,阳性率为48.0%;从RNA提取到检测结果仅需3～3.5 h。RT-PCR检测200份临床咽拭标本,69份阳性,阳性率为34.5%;从RNA提取到检测结果约需8 h。结论 FQ-PCR方法快速、特异、灵敏,在甲型流感病毒检测中具有较大的应用价值。     

TaqManTM实时荧光PCR快速检测沙门氏菌的初步研究

[目的]建立实时荧光TaqManTM检测沙门氏菌的快速检测方法,为食物中毒快速准确的定性检测及食品中沙门氏菌染菌的调查提供手段,也为建立实时荧光TaqManTM同时检测多种细菌性食物中毒目标菌奠定基础. [方法]通过分析沙门氏菌invA、hilA、fimA、hns、spy、hut基因和16S rDNA等目的基因,对比不同目的基因的优缺点,最终选择hut基因作为目的基因,在Genebank进行中查找多条hut基因序列,并利用DNAssist软件进行同源性分析,选取相对保守区段,用Beacon Designer软件自行设计引物和TaqManTM探针,并利用硅胶模型基因组DNA提取法制备基因组DNA,通过对TaqManTM实时荧光PCR缓冲液浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度、引物浓度和探针浓度等反应条件的优化,初步建立沙门氏菌的TaqManTM实时荧光PCR快速检测方法. [结果]选取的hut基因同源性达到99％以上,特异性好.通过对各实验条件的优化,得到沙门氏菌TaqManTM实时荧光PCR的最佳反应条件,初步建立TaqManTM实时荧光PCR检测沙门氏菌的快速检验方法,该方法能在1h内完成整个检测过程.[结论]TaqManTM实时荧光PCR检测不但灵敏度高、特异性好,而且检测周期短,能提高沙门氏菌的检出率和检测准确性,可望应用于沙门氏菌食品及食物中毒的快速定性检测.     

TaqMan-实时荧光PCR快速检测副溶血性弧菌

[目的]建立TaqMan-实时荧光PCR快速检测副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,VP)的方法,用于食物中毒快速诊断和食品中VP的污染状况调查。[方法]根据GenBank公布的VP tdh基因序列,设计引物和探针,建立TaqMan-实时荧光PCR快速检测体系,应用于食品中VP检测。[结果]TaqMan-实时荧光PCR快速检测体系灵敏度为1.3×104cfu/ml(33 cfu/PCR反应体系),特异性好,无交叉反应。[结论]TaqMan-实时荧光PCR检测体系灵敏度高,特异性强,能提高VP的检出率和准确性,可应用于VP食品污染状况调查和食物中毒的快速诊断。     

食品中沙门菌实时荧光PCR快速检测方法的研究

目的利用荧光定量PCR技术，建立食品中沙门菌污染的快速敏感特异的检测方法。方法以沙门菌的fimY基因作为靶序列，设计一对引物和探针，以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板，优化引物和探针的浓度比和Mg^2＋浓度，以沙门菌和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性，并初步应用于样品的检测。结果本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为0．8μmol／L，1．0μmol／L，Mg^2＋浓度为3mmol／L时，具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中，除沙门菌出现很好的阳性外，其余菌株均为阴性。在纯菌条件下，定量检测低限33cfu／ml。稳定性分析表明：同一样品重复检测3次Ct值的变异系数均小于5％。检测样品结果显示实时PCR方法较传统方法敏感、快捷、简便。结论该方法特异性强，稳定性高，操作简便快捷，适应食品微生物检验发展需要，具有较大的推广及应用价值。     

阪崎克罗诺杆菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测技术研究

[目的]建立阪崎克罗诺杆菌TaqMan—MGB探针实时荧光定量聚合酶链反应（RT．PCR）快速检测方法。[方法]在阪崎克罗诺杆菌保守序列设计一对特异性引物和TaqMan—MGB探针,通过对PCR反应条件和扩增体系的优化,建立阪崎克罗诺杆菌TaqMan—MGB探针实时荧光PCR检测方法;用已知浓度的阪崎克罗诺杆菌验证其敏感性;用阪崎克罗诺杆菌、大肠埃希菌、鸭沙门菌株、柠檬酸杆菌等菌株验证其特异性;用婴幼儿配方粉等食品开展TaqMan—MGB探针实时荧光PCR技术与常规检测方法符合性比较。[结果]本研究建立的阪崎克罗诺杆菌实时荧光PCR检测技术,反应循环（cyclethreshold,CT）值-9模板浓度的对数值具有良好的对应关系[Y=-3．06×log（X）＋36．63,R^2=0．999],最低检测浓度为100CFU／mL,经36℃增菌8h最低检测限可达1CFU／mL,敏感性较普通TaqMan探针高10倍;11株阪崎克罗诺杆菌CT值均小于30,而大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、柠檬酸杆菌等30株菌株CT值大于30或扩增曲线成一平滑直线;隔天连续5次反应CT值变异系数小于5％;140件不同批次不同婴幼儿配方粉、192件婴幼儿谷物辅助食品检测结果与常规分离培养比较,差异无统计学意义（X^2=0．624,P〉0．05）。[结论]阪崎克罗诺杆菌TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速检测技术具有特异性强、敏感性高、易操作等优点,适用于婴儿配方粉等食品开展阪崎克罗诺杆菌快速检测与监测工作。     

实时荧光PCR检测风疹病毒的应用研究

目的建立风疹病毒的实时荧光PCR检测方法并应用于临床标本的快速检测。方法分析近四十年来流行的风疹病毒E1基因序列,设计用于病毒实时荧光PCR检测的引物和探针,建立风疹病毒实时荧光PCR检测方法。对30例临床诊断为风疹的患者标本进行实时荧光PCR检测,并与血清学检测结果进行比对。结果 30例患者标本中实时荧光PCR检测,27份阳性,3份阴性,阳性率为90.0%,远高于血清学检测(阳性率70.0%)。结论该方法具有方便快捷、特异性强、敏感性高等特点,为风疹病毒的快速诊断和分子流行病学调查提供了技术支撑。     

实时荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用

目的探讨实时荧光RT-PCR和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测手足口病病毒核酸的应用价值。方法采集2009年5-8月奉贤区幼儿疑似肠道病毒感染者粪便和咽拭子标本,分别用实时荧光RT-PCR和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对肠道病毒EV71、Coxsackie A16(CoXA16)病毒进行检测。结果在对38例疑似病例的粪便和咽拭子标本进行检测时,用实时荧光RT-PCR方法检测到EV71、CoXA16阳性标本为63份,阳性率为82.89%;而用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测到52份阳性标本,阳性率为68.42%。结论实时荧光RT-PCR技术具有特异性强、灵敏度高的特点,且能在采样后数小时内检测到病毒的RNA,从而达到快速诊断的目的。因此,该方法对肠道病毒的流行病学调查及控制起重要作用。     

登革1型病毒荧光定量PCR快速检测

目的建立登革1型病毒的快速特异的荧光定量PCR检测方法。方法设计登革1型病毒特异的引物和TaqMan探针,制作标准曲线,并检测其特异性、重复性、再现性和敏感性,采用荧光定量PCR和常规PCR对临床标本进行检测比较。结果成功构建了标准曲线,回归方程为Y=-3.410logX+45.10,相关系数R²=0.999,扩增效率Eff=96.5%,灵敏度可达10³ copies/mL,此荧光定量PCR方法对登革1型病毒检测高度特异,与其他3型登革病毒和乙型脑炎病毒之间并无交叉反应;采用登革病毒种特异引物探针和本研究建立的登革1型病毒型特异引物探针对166份cDNA样本进行荧光定量PCR检测,均发现126份为阳性,阳性率均为75.9%,Ct值为20.84～36.36,浓度范围为1～1.3×104copy/μL;常规PCR方法检测到其中36份为阳性,阳性率为21.7%。结论荧光定量PCR方法能够快速灵敏地检测登革1型病毒,并能实现对病毒滴度的绝对定量。     

污蝇杆菌荧光定量PCR快速检测方法建立

目的 污蝇杆菌(Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacilli)是近年新发现的条件致病菌,临床上曾引起爆发性脓毒血症,本文拟建立污蝇杆菌荧光定量PCR的快速检测方法。方法 根据污蝇杆菌W.chitiniclastica SH04的全基因组DNA序列,采用Primer Express 3.0设计引物和Taqman荧光探针,建立实时荧光定量PCR的快速检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行验证。结果 污蝇杆菌荧光定量PCR快速检测方法具有良好的特异性,重复性试验的变异系数均<2%,灵敏度为19 CFU/反应(20μL反应体系),使用该方法检测6份人为污染的样品,结果均为阳性,6份阴性对照及空白对照均为阴性。结论 本研究建立的荧光定量PCR方法可以快速、准确地检测污蝇杆菌。     

建立Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法

目的利用Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌。方法根据沙门氏菌属共有基因序列和肠炎沙门氏菌的特异序列分别设计2组引物及探针,运用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验。结果采用沙门氏菌属探针可检测到25种不同血清型沙门氏菌(共49株),而11株阴性对照菌株未得到扩增;利用肠炎沙门氏菌探针可从25种不同血清型的沙门氏菌(共49株)和11株阴性对照菌株中特异性的检测出全部15株肠炎沙门氏菌;以肠炎沙门氏菌系列稀释度菌液DNA为模板进行实时荧光PCR扩增,菌株的模板浓度与Ct值之间呈现良好线性关系,线性系数(R2)0.993,扩增效率87%,最低检测浓度260cfu/mL;分别接种肠炎沙门氏菌于四种样品进行模拟样品检测,实时荧光PCR检测结果与经典培养鉴定方法的检测结果相吻合。结论实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法特异性强、敏感度高,可应用于食品中肠炎沙门氏菌的检测。     

应用多重TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测A型和B型流感病毒的研究

目的 应用多重real-time PCR方法检测A型和B型流感病毒,探讨其在快速诊断流感病毒感染中的优越性.方法 根据A型和B型流感病毒M基因的相对保守序列,设计两套特异性引物和TaqMan MGB探针,进行多重real-time PCR检测A型和B型流感病毒.将该方法与病毒分离、免疫层析、传统RT-PCR进行比较,并对多重real-time PCR的特异性进行评估.并应用multiplex real-time PCR方法和常规的病毒分离方法对广东省流感样病例334份咽拭标本进行检测,比较其灵敏性和特异性.结果 多重real-time PCR反应可以检测到A、B型流感病毒的最低病毒量分别为10-1和10-3TCID50/反应.该方法在对流感病毒株以及其他呼吸道病毒株样品的检测中,未发现假阳性和假阴性现象,特异性为100%.该方法对334份临床标本进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定结合血清学检测)的符合率达100%,且灵敏度明显高于病毒分离.结论 该研究建立的多重TaqMan MGB real-time PCR是一种快速、灵敏性和特异性高的流感病毒检测方法,对于流感的早期诊断及指导临床有重要意义.     

Taqman MGB探针实时荧光定量PCR检测布鲁菌病的研究

目的 建立血液标本布鲁菌DNA荧光定量检测方法,探讨其临床应用价值.方法 用PUCm-T载体和PCR纯化产物连接,转染DH5a菌,筛选阳性菌落,提取质粒,制作外标准品；在布鲁菌基因组IS711序列设计一对引物和TaqMan MGB探针,严格优化反应物的组成和扩增条件,并对该方法进行评价.结果 建立的布鲁菌DNA荧光定量PCR方法最低检出率为400拷贝/ml；批内误差为1.8％～6.5％,批间误差为2.6％～9.1％；在4.0×102～4.0×108拷贝/ml之间与Ct值具有很好的线性(Ct =-1.391 1 Ln (x) +41.65,r=-0.995 8)；具有较好的稳定性.在布鲁菌临床监测中发现,157份血液标本,用荧光定量PCR检测与临床检查结果(临床阳性、慢性期患者、症状可疑、阳性畜周围人群与重点职业人群(重点人群)的阳性率和阴性对照的符合率分别为90.3％、40％、6.7％、12.2％和100％.结论 建立的荧光定量PCR检测方法能鉴定布鲁菌种属,具有良好的特异性、灵敏度和稳定性.在临床布鲁菌基因诊断方面具有重要意义.     

诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR的检测研究

目的建立特异、灵敏的诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速检测方法。方法根据GenBank诺如病毒遗传组Ⅱ型代表株保守序列设计特异引物对和TaqMan～MGB探针，调整引物、探针浓度，优化最佳反应条件，建立一步法实时荧光PCR快速检测反应体系，进行灵敏度、特异性、稳定性试验，以评价反应体系，并与引物P289／P290常规RT—PCR进行灵敏度比较。结果诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR检测时限短，仅1h就出结果；最低检出下限为100拷贝/mL，比引物P289／P290常规RT—PCR灵敏度高100倍；与轮状病毒、腺病毒、星状病毒、甲肝病毒无交叉反应；4份核酸含量不同的标本重复检测5次，平均G值变异系数范围0．96％-2．27％。结论诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速、特异、灵敏、稳定性好。可应用于突发公共卫生应急检测，提高快速检测能力。     

实时荧光PCR快速检测粪便中艰难梭菌方法

目的:建立实时荧光PCR快速检测艰难梭菌的方法。方法:以艰难梭菌磷酸丙糖异构酶(tpi)基因的保守序列为模板设计和合成特异性引物和荧光标记探针,建立实时荧光PCR检测体系,通过检测含有艰难梭菌标准菌株浓度为106-10 CFU/ml的细菌培养物及加标模拟样本进行敏感性分析,并对其特异性和干扰性进行评价。结果:该方法只对艰难梭菌进行特异性扩增,其他常见的病原菌均不能扩增;整个检测过程只需要2 h,对艰难梭菌菌悬液可检测至10 CFU/ml细菌,对加标粪便样本可检测至1000 CFU/ml细菌。结论:本研究建立的实时荧光PCR检测艰难梭菌方法具有快速、特异、敏感性高等优点,能实现对艰难梭菌的快速检测。     

应用多重PCR技术快速鉴定登革病毒

目的建立一套应用多重PCR技术快速分型鉴定4种血清型登革病毒的方法。方法用随机引物将1~4型登革病毒RNA逆转录成cDNA,再将4对登革病毒型特异性引物同时加到一个反应管中进行多重PCR扩增,根据扩增片段的大小判断血清型,并用2004年收集的登革热病人血清标本验证新建立的方法。结果同时用4对登革病毒型特异引物进行多重PCR,1~4型登革病毒标准毒株相应扩增的片段大小分别为391、319、216和152bp,与预期的扩增片段大小相符。2004年4份登革热病人血清标本扩增的片段大小均为391bp,属1型登革病毒。结论新建立的方法是一种特异、快速的登革病毒分型鉴定方法。     

双重荧光定量RT-PCR快速检测A、B型流感病毒的研究

目的：建立双重荧光定量RT—PCR技术同时快速检测A、B型流感病毒，并应用于临床样本的检测。方法：在A型流感病毒M基因和B型流感病毒NP基因的保守区序列分别设计特异性引物和Taqman探针，建立优化单一和双重荧光RT—PCR反应体系，评价所建双重RT—PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性，并应用于疑似流感含漱液标本检测。结果：该方法对A、B型流感病毒检测具有高度特异性，检出限分别为0．1TCID50和0．01TCID50，可从疑似流感患者含漱液中直接检测到流感病毒核酸。构建的体系定量标准曲线相关系数分别为0．998和0．999，具有较好的稳定性。结论：本研究建立的双重荧光定量RT—PCR可以同时准确分型A、B型流感病毒，灵敏度高，稳定性好，是一种快速检测流感病毒的新方法。     

应用Taqman实时PCR法检测猪肉中单核细胞增生李斯特菌

目的建立敏感快速的检测猪肉中单核细胞增生李斯特菌的实时PCR方法。方法以hlyA基因为靶标,建立并验证实时PCR法的特异性。选用单核细胞增生李斯特菌CMCC 54004,制备不同浓度的纯菌液,用实时PCR进行检测,制作标准曲线并计算扩增效率。进行人工染菌实验,染菌量分别为每25g猪肉样本1.3×100、1.3×101、1.3×102、1.3×103、1.3×104、1.3×105和1.3×106CFU。分别在增菌0、4、8、12、18、24、30、36和46 h取1 ml培养液,提取DNA进行实时PCR检测,并用PCR和传统方法进行检测,比较3种方法检测的敏感性和特异性。采集24份市售猪肉样本,用这3种方法进行检测,进一步比较三者的阳性检出率。结果建立的实时PCR法特异性好,对纯菌液的检出限为1.3×103CFU/ml。人工染菌样本增菌24 h后,实时PCR检出限1.3 CFU/25 g,PCR及传统方法达到这一检出限需要增菌46 h。根据增菌24 h的检测结果,建立实时PCR样本标准曲线。24份猪肉样本,实时PCR检出17份阳性,阳性率70.83%(17/24),与PCR和传统方法的阳性率一致。根据所得的样本标准曲线,对检测样本进行定量分析,确定了阳性样本中初始含量菌。结论所建立的实时PCR具有快速简便、敏感特异等优点,整个操作可在27 h内完成,适用于猪肉中单核细胞增生李斯特菌的快速定量检测。     

Taqman实时定量PCR检测产毒艰难梭菌方法的建立

目的 建立以毒素基因A/B为靶基因的产毒艰难梭菌的快速定量检测方法.方法 通过设计艰难梭菌毒素A/B基因的特异引物及探针,建立标准产毒菌株DNA(ng)含量与Ct值的标准曲线.结果 该方法仅对产毒艰难梭菌进行特异性扩增,11种其他常见的致病菌及非产毒艰难梭菌均不能扩增; tcdA和tcdB基因扩增标准曲线线性关系R值分别为0.9975、0.9984,检测低限均为2.5×10-3ng.结论 该研究建立的方法具有快速、灵敏、特异性高等优点,可用于艰难梭菌毒素基因的定量检测.