兔成骨细胞与纳米氧化锆强韧化高孔隙率磷酸钙人工骨细胞支架生物相容性研究

目的 研究成骨细胞与纳米氧化锆强韧化高孔隙率磷酸钙人工骨细胞支架在体外培养条件下的生物相容性。方法 将成骨细胞株置于含体积分数为10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养，分为纳米支架复合细胞组和单纯细胞组，不同时间用倒置相差显微镜、HE染色光镜及扫描电镜观察。MTT法进行细胞增殖测定，并进行细胞微量蛋白含量检测和碱性磷酸酶的定量检测。结果 成骨细胞体外培养时复合或不复合纳米支架均生长良好，表现出典型的细胞形态特征和生物学特性，纳米支架利于细胞的贴附、生长与增殖，并对细胞的功能无不良影响。结论 纳米支架是较理想的骨组织工程支架材料，成骨细胞复合纳米支架用于骨缺损的修复，具有广阔的临床应用前景。     

纳米磷酸钙/氧化锆骨组织工程支架体内降解的实验研究

目的研究纳米磷酸钙/氧化锆骨组织工程支架材料体内降解特性,为进一步构建组织工程化纳米人工骨提供研究依据。方法制作兔股部肌袋,将灭菌的纳米磷酸钙/氧化锆骨组织工程支架材料植入肌袋内,在植入4周、8周、12周、16周时取材通过大体、组织学、扫描电镜观察材料降解情况,同时将材料取出后煅烧,测量残余无机物含量,判断降解的量,同时进行X线衍射实验,测量残余材料的组成。结果材料植入8周内降解较慢,生物力学强度减低不明显,12周时降解加速,材料强度明显减低,16周时新骨形成明显,降解残余材料分布于新形成的骨组织内部,X线衍射发现12周时材料内有羟基磷灰石成分出现,提示有新骨形成,16周时羟基磷灰石成分明显增多。结论纳米磷酸钙/氧化锆骨组织工程支架材料具有较好的降解性和生物相容性,具有诱导成骨作用,可作为骨组织工程的支架材料。     

蛇床子素和纳米氧化锆强韧化磷酸钙支架对成骨细胞增殖影响的研究

目的研究蛇床子素与纳米氧化锆强韧化磷酸钙骨支架的相容性，以及其在体外对幼兔成骨细胞增殖和成骨作用的影响。方法酶消化法分离培养幼兔股骨成骨细胞，噻唑兰法(MTT)测量成骨细胞增殖率，用碱性磷酸酶试剂盒测定细胞内骨碱性磷酸酶(ALP)活性。结果蛇床子素对大鼠新生成骨细胞的增殖和ALP活性具有显著的促进作用，与纳米氧化锆强韧化磷酸钙人工骨支架生物相容性良好。结论纳米氧化锆强韧化磷酸钙人工骨支架复合蛇床子素刺激的成骨细胞，是一种性能良好的复合骨组织工程材料。     

成骨细胞株与强韧化纳米人工骨支架联合培养实验研究

目的 :观察成骨细胞株 ( 3T3 E1)在新型纳米氧化锆强韧化高孔隙率人工骨支架 (下文简称人工骨支架 )材料上生长情况。方法 :成骨细胞株 ( 3T3 -E1)与人工骨支架联合培养 ,通过光镜观察和细胞计数的方法了解成骨细胞与支架结合能力 ,扫描电镜观察细胞生长的情况。结果 :新型强韧化纳米人工骨材料与建株成骨细胞有良好的结合能力 ,成骨细胞株 ( 3T3 E1)在人工骨材料上生长良好。结论 :纳米骨支架是较理想的骨组织工程支架材料 ,成骨细胞复合支架用于骨缺损的修复 ,具有广阔的临床应用前景。     

人工肋骨支架多孔磷酸钙的制备及体内降解研究

目的 对多孔磷酸钙(CPC)体内降解情况进行研究,为其作为组织工程化人工肋骨支架提供实验基础.方法 将CPC材料埋植于兔皮下,并于预定的时间点将材料取出,称重并送扫描电镜检查,以观察其降解情况;其周围组织则进行苏木素-伊红(HE)染色和透射电镜检查,以观察其炎症反应和生物相容性.结果 CPC材料在术后2、4、8、12、24周的生物吸收率分别为(2.500±0.098)%、(7.000±0.167)%、(10.000±0.242)%、(14.000±0.251)%、(30.000±0.177)%,降解速度平稳,能有效维持缺损部位的稳定性;HE染色和透射电镜结果 显示其炎症反应于4周时消失,有良好的生物相容性.结论 CPC的体内降解速度平稳,组织相容性好,是承重部位和非承重部位的良好组织工程支架.     

纳米氧化锆磷酸钙骨支架体内免疫及相容性研究

目的检测纳米氧化锆磷酸钙骨支架的体内致免疫反应和生物相容性。方法将材料植入新西兰大白兔股部肌袋内,在植入前和植入后3、7、14、21d不同时间点内抽血查T淋巴细胞亚型T4和T8数量并计算其比值,对数据进行统计学分析;在植入后3、7、14、21d分别处死动物观察材料对植入局部周围组织的致敏作用及植入局部周围组织的炎性反应。结果材料植入后周围组织大体和组织学观察未见明显的过敏、炎性及排斥反应,植入后血液内T淋巴细胞亚群与植入前统计学结果无明显差别。结论纳米氧化锆磷酸钙骨支架无免疫源性,体内植入具有良好的相容性。     

新型多孔双相磷酸钙支架与兔骨髓间充质干细胞相容性的体外实验研究

目的：研究新型多孔双相磷酸钙支架与兔骨髓间充质干细胞的体外相容性。方法：体外分离、扩增兔骨髓间充质干细胞。取传二代细胞,按照经典组织工程构建方法,分别接种双相磷酸钙（对照组）和双相磷酸钙复合纳米羟基磷灰石（实验组）支架。单纯细胞培养为空白对照组。体外成骨诱导培养14天。倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞生长情况;MTT法检测细胞增殖功能;碱性磷酸酶（ALP）检测细胞成骨分化功能。结果：细胞在新型支架上吸附、生长良好。各组MTT及ALP值随培养时间延长而增大。培养各时段实验组均高于其他两组,差别有统计学意义（P〈0.01）。结论：新型BCP支架与兔BMSC在体外具有良好的相容性,二者具有体外构建工程骨的潜力。     

取向性仿生双相磷酸钙支架的制备、结构评价和初步应用

目的利用三维凝胶叠层成型法(3DGellamination)制备出取向性仿生双相磷酸钙生物陶瓷支架,并在体外对支架的结构进行三维重建和相关评价。方法2003年11月至2005年3月,以犬股骨头的松质骨样本显微CT(MicroCT)图像为基础,提取其中的图像信息,利用三维凝胶叠层成型法制备出具有仿骨小梁结构的双相磷酸钙(BCP)仿生生物陶瓷支架。随后对支架进行MicroCT扫描,用三维结构参数对支架和松质骨样本进行三维评价和比较。并利用体外细胞培养技术观察细胞在支架表面的生长情况。同时将复合骨髓间充质细胞的支架植入股骨头负重区的骨缺损内,初步观察其治疗效果。结果本方法制备出的股骨头仿生支架具有良好的三维空间结构,支架小梁具有一定的方向性,呈板状模型,其轴向方向的弹性模量和强度分别达到(464.0±36.0)MPa和(5.6±0.8)MPa。细胞在支架表面大量生长。动物实验结果表明,支架与周围骨床结合紧密,骨质沿支架小梁表面生长。结论本研究制备的BCP多孔支架的小梁具有一定的取向性,支架具有良好的生物相容性、一定的力学强度和良好的适于血管长入的空间结构。     

组织工程化人工胸骨支架材料的制备及生物学评价

目的 通过生物学评价探讨不同比例聚己内酯/天然骨粉( polycaprolactone/bone powder,PCL/BP)作为组织工程化人工胸骨材料的安全性.方法 将聚己内酯(PCL)与天然骨粉(BP)分别以8∶2及6∶4混合成备用材料,并利用材料的浸提液进行热源、溶血、急性全身毒性等生物学实验,同时将受试材料分别与骨髓基质于细胞进行培养,观察其接种后细胞的生长情况.结果 受试材料均无急性全身毒性反应、溶血和热源反应.培养的骨髓基质干细胞经材料浸提液处理后形态良好,增殖旺盛.细胞增殖试验显示,受试材料组细胞生长无明显差别(P≥0.05).结论 PCL/BP复合物具有良好的生物相容性,不同比例的PCL/BP不影响其生物安全性.     

纳米羟基磷灰石/甲基丙烯酸2-羟基乙酯人工骨支架的制备及其功能评价

[目的]体外研究评价纳米羟基磷灰石/甲基丙烯酸2-羟基乙酯(nHA/pHEMA)生物支架的生物特性及其对转染骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein 7,BMP-7)的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal-stem cells,BMSCs)成骨分化的影响。[方法]将nHA与pHEMA复合构建nHA/pHEMA复合物支架。将BMP-7体外转染BMSCs并作为种子细胞接种至n HA/p HEMA支架。采用MTT、荧光显微镜及电镜扫描评价nHA/pHEMA支架的生物相容性和细胞毒性。ALP活性和RT-PCR检测分析BMP-7对复合nHA/pHEMA支架BMSCs成骨分化的影响。最后进行无侧限抗压试验评价nHA/pHEMA支架的生物力学特性。[结果]MTT荧光显微镜及电镜检测结果表明接种于nHA/pHEMA支架的BMSCs生长及增殖情况良好。BMP-7转染组与BMSCs组的细胞增殖水平差异无统计学意义(P0.05)。ALP活性检测发现BMP-7-BMSC组的ALP水平在培养第7 d和14 d明显高于BMSCs组(P0.05),RTPCR发现BMP-7-BMSCs组的RUNX2、COLI、OPN和OCN表达水平在培养第7 d和第14 d显著高于BMSCs组(P0.05)。生物力学检测发现nHA/pHEMA支架在高压力负荷及形变条件下未出现脆性骨折。[结论]nHA/pHEMA支架具有良好的生物相容性及生物力学特性,BMP-7能够显著促进复合nHA/pHEMA支架的BMSCs成骨分化,BMP-7-BMSCs与nHA/pHEMA支架复合可以作为理想的骨修复材料促进骨形成。     

An X-ray crystallographic examination of calcium phosphate formation in Ca(OH)2/H3PO4 mixtures

Precipitates formed over a 10 day period by adding variable amounts of Ca(OH)₂ to H₃PO₄ were examined chemically and by X-ray diffraction in order to determine and to relate the crystallographic changes observed during calcium phosphate formation in this system to those seen previously in dental plaque. In the lower Ca(OH)₂/H₃PO₄ ratio mixtures the initial precipitates were amorphous or poorly crystalline. The latter deposits showed an apatite-like diffraction pattern which changed to brushite and decreased in Ca/P ratio from approximately 1.2–1.0. Since the amorphous precipitates showed a similar decrease in the Ca/P ratio and a transient appearance of apatite, it was suggested that these initial precipitates, like the poorly crystalline deposits, may contain brushite amorphous to X-rays. Precipitates from the higher Ca(OH)₂/H₃PO₄ ratio mixtures changed from a poorly crystalline to a more crystalline apatite and the Ca/P ratio remained fairly constant. The relation between the pH, Ca and P on the one hand and the brushite and apatite contents and the pattern of crystallization of the precipitates on the other was strikingly similar to the same relationship observed earlier in dental plaque in situ, suggesting that the system used in this study could be used to study certain aspects of plaque mineralization in vitro.     

Mechanism of estrogens-induced increases in intracellular Ca(2+) in PC3 human prostate cancer cells

BACKGROUND: The effect of estrogens (diethylstilbestrol [DES], 17 beta-estradiol) on intracellular Ca(2+) concentrations ([Ca(2+)](i)) in hormone-insensitive PC3 human prostate cancer cells was examined. METHODS: [Ca(2+)](i) changes in suspended cells were measured by using the Ca(2+)-sensitive fluorescent dye fura-2. RESULTS: Estrogens (1--20 microM) increased [Ca(2+)](i) concentration-dependently with DES being more potent. Ca(2+) removal inhibited 50 +/- 10% of the signal. In Ca(2+)-free medium, pretreatment with 20 microM estrogens abolished the [Ca(2+)](i) increases induced by 2 microM carbonylcyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP, a mitochondrial uncoupler) and 1 microM thapsigargin (an endoplasmic reticulum Ca(2+) pump inhibitor), but pretreatment with CCCP and thapsigargin did not alter DES-induced Ca(2+) release and partly inhibited 17 beta-estradiol-induced Ca(2+) release. Addition of 3 mM Ca(2+) increased [Ca(2+)](i) in cells pretreated with 1- 20 microM estrogens in Ca(2+)-free medium. Pretreatment with 1 microM U73122 to block phospholipase C-coupled inositol 1,4,5-trisphosphate formation did not alter estrogens-induced Ca(2+) release. The effect of 20 microM estrogen on [Ca(2+)](i) was not affected by pretreatment with 0.1 microM estrogens. CONCLUSIONS: Estrogen induced significant Ca(2+) release and Ca(2+) influx in an inositol 1,4,5-trisphosphate-independent manner in PC3 cells. These effects of estrogens on Ca(2+) signaling appear to be nongenomic. Prostate 47:141-148, 2001.     

地塞米松和1，25(OH)2D3对体外人骨髓基质细胞成骨及成脂分化的影响

目的 观察地塞米松（Dex）和1，25（OH）2D3（D3）对骨髓基质细胞（MSCs）成骨及成脂分化的影响。方法 以离心法分离培养人MSCs，以10^-7mol／LDex和，或10^-8mol／Ll，25（OH）2D3作为分化诱导剂对细胞进行干预，分别用细胞碱性磷酸酶（ALP）染液试剂盒及苏丹Ⅲ染液对成骨细胞和脂肪细胞进行组织化学染色，计数；使用RT-PCR技术在转录水平检测成骨细胞标记物骨桥蛋白（OPN）及脂肪细胞标记物过氧化酶体增殖激活受体72（PPARγ2）mRNA的表达。结果细胞染色结果表明各干预组ALP^＋细胞百分比均较对照组增加，与对照组相比有显著性差异（P〈0．05），苏丹Ⅲ^＋细胞百分比Dex组较对照组增多，耽组较对照组减少，差异有显著性（P〈0．05），Dex＋D3组较Dex组苏丹Ⅲ^＋细胞数明显减少，两者相比差异有显著性（P〈0．05）；OPNmRNA及PPARγ2mRNA表达未在对照组测得，Dex诱导了OPNmRNA及PPARγ2mRNA表达，1，25（OH）2D3诱导OPNmRNA表达，并抑制Dex诱导的PPARγ2mRNA的表达。结论 Dex促进MSCs的成骨分化及成脂分化，1，25（OH），D，促进MSCs的成骨分化的同时抑制其成脂分化，与Dex合用抑制Dex成脂分化作用，强化了其成骨分化作用，反映了成骨细胞与脂肪细胞间存在的反变关系，表明两者来源于同一前体细胞的可能性。     

加味小承气颗粒剂对小鼠腹腔巨噬细胞合成白三烯B_4及对细胞内游离钙浓度的影响

目的：研究加味小承气（ＸｉａｏＣｈｅｎｇＱｉ,ＸＣＱ）颗粒剂治疗腹腔炎症机理与小（大）鼠腹腔巨噬细胞（ＭΦ）合成释放白三烯Ｂ４以及对细胞内游离钙浓度的影响。方法：应用高效液相色谱分析ＬＴＢ４,应用Ｆｕｒａ－２／ＡＭ及荧光分光光度计测定细胞内钙离子浓度。结果：不同浓度的ＸＣＱ颗粒剂（０１５～１０ｇ／Ｌ）明显抑制大鼠（ＭΦ）合成释放白三烯Ｂ４并抑制小鼠细胞内钙离子释放（静止期细胞内钙离子浓度为６３４５±１２４４ｎｍｏｌ／Ｌ,与对照组（１４８３９±１６６２ｎｍｏｌ／Ｌ）比较有显著性差别,在细胞外钙浓度增高条件下,ＸＣＱ尚促使外钙内流。结论：小承气颗粒剂抗炎机理与抑制小（大）鼠（ＭΦ）合成释放白三烯Ｂ４及调节细胞内外钙离子浓度有关。     

蛋白酪氨酸磷酸酶-3通过诱导肿瘤性巨噬细胞钙离子依赖性钾离子通道表达增强LoVo细胞侵袭性

目的 观察结肠癌肿瘤微环境中肿瘤细胞与巨噬细胞(M2)相互作用及对肿瘤细胞功能学的改变.方法 将转入蛋白酪氨酸磷酸酶-3(PRL-3)的LoVo细胞和M2细胞模拟肿瘤微环境进行共培养,通过Western blot检测M2细胞钙离子依赖性钾离子通道(KCNN4)蛋白表达,并检测LoVo细胞侵袭性的改变.结果 Western blot检测示PRL-3能通过共培养后诱导M2细胞KCNN4蛋白表达升高,而未作共培养的M2细胞KCNN4蛋白表达未升高.此外,经过共培养后LoVo细胞侵袭性升高(3367±135比1442±89,P＜0.05),而在阻断KCNN4蛋白表达后,LoVo细胞侵袭性降低(1388 ±87比2893±163,P＜0.05).结论 PRL-3在结肠癌肿瘤微环境中通过提高KCNN4表达从而增强LoVo细胞的侵袭性.     

1,25(OH)2VD3对人脐带间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的 研究人脐带组织间充质干细胞(UCMSCs)体外分离、扩增的方法,探讨不同浓度的1,25(OH)2维生素D3[1,25(OH)2VD3]对人UCMSCs增殖及成骨分化的影响.方法 利用组织块贴壁法分离并培养人UCMSCs,通过免疫组化技术对其鉴定;取生长状态良好的第3代人UCMSCs进行干预实验,设置10-7、10-9和10-11mol/L 3种浓度的1,25 (OH)2VD3作为实验组,并设空白对照组(常规DMEM培养基).动态观察干预前、后各组细胞的形态变化,四唑盐(MTT)比色法观察细胞增殖,免疫组化法检测碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原蛋白表达,茜素红染色观察矿化结节形成情况.结果 组织块贴壁培养法可获得人UCMSCs,免疫细胞化学显示CD44、CD105强阳性,CD34、CD45阴性,符合人UCMSCs的特征;1,25 (OH)2VD3对人UCMSCs增殖的影响表现为少于7d促进增殖,超过7d则抑制增殖,高剂量组(10-7mol/L组)抑制干细胞增殖效应更明显,不同浓度效应与时间效应之间存在交互作用(P＜0.05);1,25(OH)2VD3对人UCMSCs成骨分化影响表现为10-11 mol/L组促碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原蛋白分泌作用高于10-7和10-9 mol/L组,低剂量1,25(OH)2VD3促进成骨细胞分化作用更明显(P＜0.05);1,25(OH)2vD3可促进人UCMSCs钙化结节的形成.结论 采用组织块贴壁培养法可以成功获得人UCMSCs,1,25(OH)2VD3可有效调节人UCMSCs增殖并促进其向成骨细胞分化.     

转染BIG-3基因的人骨髓基质干细胞向软骨细胞诱导分化的实验研究

目的研究转染BIG-3基因对人骨髓基质干细胞(hBMSCs)向软骨纠胞诱导分化的影响。方法将构建好的pMSCVpuro-BIG-3转染至建系的hBMSCs,5μg/mL嘌罗霉素筛选12 d后,扩增并收集细胞,电泳证实特定条带无误。实验分三组：hBMSCs-BIG-3组、hBMSCs-EV组和hBMSCs组,每组重复6次,将三组细胞制成微粒模拟三维培养模式,分别加入浓度为400 ng/mL的重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP一2)作用14 d后,检测甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原mRNA,利用MPS60病理图象分析系统采集图像,并进行灰度分析,半定量比较基质表达量。结果灰度值：hBMSCs-BIG-3组为684 481 822,hBMSCs-EV组为439 101 780,hBMSCs组为441 082 183,hBMSCs-BIG-3组灰度值明显高于后两组(P＜0．05),hBMSCs-EV组和hBMSCs组之间差异无显著性意义(P=0．862)。结论BIG-3基因有助于hBMSCs向软骨细胞诱导分化。