作物数量遗传学基础 二、遗传力及其估算

一、遗传力的概念 生物的变异是普遍存在的。对于作物的数量性状 来说,其变异既受基因型也受环境因素的影响。从前 一讲(1-1)式可知 Vp=V_G+V_E     

杜氏盐藻psaB基因cDNA的克隆与序列分析

根据真核生物莱茵衣藻(Chlamydornonas reinhardtii)、Chlamydomonas moewusii、Chlorella vulgaris以及Mesostigma viride的psaB基因的氨基酸高度保守序列,设计一对简并引物,利用TRIzol试剂提取杜氏盐藻(Dunaliella salina)细胞的总RNA,通过RTPCR,得到的一段长为1．8kb左右的cDNA片段。PCR产物经T-A克隆并测序分析以及测序结果推导成氨基酸序列进行同源性比较．表明所克隆的1815bp序列为杜氏盐藻psaB cDNA片段,GenBank收录号为AY820754。根据已经得到的psaB序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的psaB基因相比较,同源性分别为Chlamydomonas reinhardtii 92％,Chlamydornonas moewusii 91％,Chlorella vulgaris 86％,Mesostigma viride 85％,Physcomitrella patens subsp．Patens 85％,Nephroselmis olivacea 84％。据此可推断本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻psaB cDNA序列.     

杜氏盐藻psaB基因cDNA克隆及系统进化分析

根据真核生物莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、Chlamydomonas moewusii及Chlorella vulgaris等光系统Ⅰ反应中心蛋白psaB基因的氨基酸高度保守序列,设计一对简并引物,利用TRIzol试剂提取杜氏盐藻(Dunaliella salina)细胞的总RNA,通过RT-PCR,得到的一段长为1.8kb左右的cDNA片段。PCR产物经T-A克隆并测序以及测序结果推导成氨基酸序列进行同源性比较,表明所克隆的1815bp序列为杜氏盐藻光系统Ⅰ反应中心psaB基因的cDNA片段,GenBank收录号为AY820754。根据已经得到的psaB的核苷酸序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的psaB氨基酸序列相比较,同源性分别为Chlamydomonas reinhardtii 92%,Chlamydomonas moewusii 91%,Chlorella vulgaris 86%,Mesostigma viride 85%,Phy -scomitrella patenssubsp.Patens 85%,Nephroselmis olivacea 84%。此外,psaB密码子偏爱性分析表明:杜氏盐藻psaB基因第三位密码子A和T的组成分别为35.7%和39.17%,而G和C分别为7.27%和17.85%,即杜氏盐藻psaB基因密码子的组成大多为NNA和NNT。根据psaB基因的特征,作者对绿藻门的50个物种的psaB基因作了进化分析,结果表明:杜氏盐藻与Haematococcaceae中的大多数种类进化地位最为接近,这为更进一步弄清杜氏盐藻的遗传背景提供了理论依据。     

杜氏盐藻光系统Ⅰ反应中心psaB基因cDNA克隆及系统进化分析

杜氏盐藻是一种抗逆性很强的单细胞真核绿藻,能在010525mol/L 的盐水中生长,繁殖1。杜氏盐藻的突出优点在于培养条件简单,光合自养,抗逆性极佳,这些特性为利用其进行实验提供了便利。本研究通过比较现有已知物种的psaB 基因的氨基酸序列,利用 psaB 基因的氨基酸高度保守序列设计一对简并引物,采用 RT2PCR 从杜氏盐藻中克隆了psaB cDNA 片段,为进一步研究杜氏盐藻A2 亚基的结构与功能以及它的光合机理打下基础,同时通过 psaB 基因的进化分析可以更加深刻地了解杜氏盐藻与其他高等植物以及真核藻类之间的亲缘关系.       

杜氏盐藻叶绿体atpA基因片段的克隆及序列分析

根据莱因衣藻、卵形肾藻、普通小球藻等10种藻类的atpA全基因氨基酸高度保守序列,设计简并引物,利用PCR方法从盐藻叶绿体DNA中扩增出约400bp的片段,将该片段连接到T-vector上进行序列测定。结果表明,核苷酸长度为405bp,编码135个氨基酸。推导的氨基酸序列与莱因衣藻的同源性为92%,普通小球藻88%,Mesostigmaviride87%,卵形肾藻86%,Cyanidioschyzonmerolae85%。以所克隆的DNA片段为探针,与盐藻叶绿体基因组进行SouthernBlot杂交结果有明显的杂交信号。据此可推断本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻叶绿体atpA基因片段。该基因序列已被GenBank收录,接受号为AY435096。     

杜氏盐藻psaB基因cDNA的克隆与序列分析

根据真核生物莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、Chlamydomonas moewusii、Chlorella vulgaris以及Mesostigma viride的psaB基因的氨基酸高度保守序列,设计一对简并引物,利用TRIzol试剂提取杜氏盐藻（Dunaliella salina）细胞的总RNA,通过RT-PCR,得到的一段长为1.8kb左右的cDNA片段。PCR产物经T-A克隆并测序分析以及测序结果推导成氨基酸序列进行同源性比较,表明所克隆的1815bp序列为杜氏盐藻psaB cDNA片段,GenBank收录号为AY820754。根据已经得到的psaB序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的psaB基因相比较,同源性分别为Chlamydomonas reinhardtii 92%,Chlamydomonas moewusii 91%,Chlorella vulgaris 86% , Mesostigma viride 85%,Physcomitrella patens subsp.Patens 85%, Nephroselmis olivacea 84%。据此可推断本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻psaBcDNA序列。     

简并PCR技术及其在基因克隆中的应用

本文简要介绍简并PCR技术,包括什么是简并引物,如何设计简并引物,进行简并PCR的反应条件,应用简并PCR获得全长基因的方法和简并PCR技术的应用范围,并对简并PCR技术的局限性及其新进展进行讨论。在此基础上,简述基因的克隆策略以及简并PCR技术在基因克隆中的应用。简并PCR技术是寻找和发现“新”基因或蛋白质家族新成员的一种非常有用的工具。 Abstract:Degenerate PCR is introduced in this paper,including what is degenerate PCR,how to design degenerate primers,how to optimize degenerate PCR parameters,how to applying degenerate PCR to obtain full-length gene and which fields can apply degenerate PCR.The limits and recent advances of degenerate PCR are also discussed.Based on this introduction,strategies of gene cloning and applications of degenerate PCR in gene cloning are summarized in brief.Degenerate PCR is a very useful tool for searching and discovering new genes and new members of a protein family.     

作物数量遗传学基础 三、遗传力与选择效果

育种工作的一个重要环节,就是在杂种群体或人 工弓1变群体中进行选择,从中选择合乎需要的理想材 料。因为选择效果的好坏直接影响到育种工作的成败, 因此如何制定最有效的选择方案提高选择效果,一直 是育种工作者关心的重要课题。通常,我们所观察到 的只是作物的表现型值。如前所述,由于表现型值中 包含有遗传和环境两方面的变异因素,有些在早期世 代表现优良的材料可能会随着世代的递增而变劣,因 此,直接根据表现型值进行选择不一定得到理想的效 果。如果我们用前面的方法把表现型方差中的基因型 方差和环境方差分离出来,就能够判断要进行选择的 群体的各种性状的遗传变异的程度,从而使得选择具 有一定的预见性。这样就可以进一步改进选择方案, 提高选择效果,因此遗传力在育种工作中的应用除了 可以决定选择方式之外,还可以对选择的效果作出判 断。     

杜氏盐藻β-酮酯酰-ACP合酶(DsKASⅡ)基因的分离及功能分析

酮脂酰-ACP合成酶Ⅱ(KASⅡ)是催化棕榈酸(16∶0-ACP)延伸为硬脂酸(18∶0-ACP)的关键酶,其活性强弱决定着18碳脂肪酸含量的高低。本文以杜氏盐藻(Dunaliella salina)为试材,分离鉴定杜氏盐藻DsKASⅡ基因编码序列,采用生物信息学工具解析DsKASⅡ酶蛋白的亚细胞定位、高级结构、理化性质及系统发育等特性。检测氮胁迫下的DsKASⅡ表达量,以及藻细胞脂肪酸、叶绿素和β-胡萝卜素的含量。结果表明,DsKASⅡ编码的酶蛋白长度为476 aa,pI为6. 99,含叶绿体靶向肽和较多亲水区。二级结构主要由α-螺旋(22. 48%),β-片层(22. 06%)和无规则卷曲(55. 46%)组成。三级结构预测表明该蛋白整体呈紧密的心形结构,活性酶蛋白为同源二聚体。系统发育分析表明,DsKASⅡ氨基酸序列与莱茵衣藻CrKASⅡ同源性达99%,可能二者有着共同的进化祖先。qRT-PCR揭示,与正常培养的杜氏盐藻相比,DsKASⅡ在氮胁迫条件下的表达量明显上调,第3天时的表达量比正常培养的高4. 5倍。氮胁迫下藻细胞总油脂、油酸(C18∶1)和类胡萝卜素含量显著提高,然而棕榈酸(C16∶0)和叶绿素的含量明显降低。这表明,氮胁迫诱导杜氏盐藻DsKASⅡ基因上调表达,将更多的棕榈酸催化为硬脂酸,进而提高了单不饱和油酸的富集以及类胡萝卜素的积累。本研究为后续进一步解析杜氏盐藻氮胁迫条件下,油脂与胡萝卜素合成积累及藻细胞响应胁迫机制和优质富油藻种培育提供了科学参考。     

杜氏盐藻GAPDH cDNA的克隆鉴定及其启动子功能表达载体的构建

根据藻类甘油醛3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)氨基酸高度保守序列设计简并引物,采用5',3'-RACE和巢式PCR的方法,得到了杜氏盐藻(Dunaliella salina)GAPDH cDNA全长序列.序列同源性比较和进化树等生物信息学分析结果表明,根据获得的盐藻GAPDH的核酸序列推导的氨基酸序列与其他已知物种的GAPDH有较高的同源性.定向克隆于原核表达载体的盐藻GAPDH cDNA在大肠杆菌中以融合蛋白的形式得到了高效表达,并成功构建了由盐藻GAPDH基因启动子驱动的cat(氯霉素乙酰转移酶)基因表达载体pUCGCat,为进一步研究杜氏盐藻GAPDH基因和启动子功能奠定了试验基础.     

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)cDNA文库构建及功能基因筛选

采用Qiagen公司的植物总RNA提取技术、Clontech公司的CreatorTM技术平台以及SMARTTM技术进行cDNA文库构建.从杜氏藻中提取出了高质量的总RNA,通过PowerScript反转录酶反转录杜氏藻的总RNA,采用LD-PCR、酶处理等方法对cDNA进行等比例扩增、纯化,同时使用CHROMA SPIN-400柱子将cDNA分段化,最后将长片段连入pDNR-LIB质粒,1.5 kV,25 μ F电转化大肠杆菌JM109,得到含1.5×106个克隆子的原始文库,滴度为1.5×106cfu ml-1.结合酶切和PCR,对该文库的质量进行了鉴定和统计,文库的平均片段插入长度为1.5kb.采用烯醇酶和UDP葡萄糖脱氢酶的EST作为同源探针,对文库中的功能基因进行筛选,并采用放射性原位杂交法,对扩增文库进行了初筛和复筛,得到了含这两条基因全编码序列的cDNA,烯醇酶为1.8kb,UDP葡萄糖脱氢酶为1.9kb,为今后对该种进行大规模功能基因组学研究奠定基础.     

盐藻PSY基因cDNA的克隆、序列测定及其进化分析

以盐藻总RNA为模板,根据已获得的盐藻PSY基因起始和终止密码子附近的核苷酸序列设计引物,通过RT—PCR扩增获得盐藻PSY cDNA片段．盐藻PSY基因cDNA全长1260bp,编码的盐藻PSY蛋白由420个氨基酸组成,大小为47．3kD,等电点为8.67．在GenBank中进行Blast P检索,发现该片段与许多植物PSY具有较高的相似性(78％～89％)．系统进化分析进一步证明,藻类PSY与蓝细菌PSY亲缘关系最近．     

通过cDNARDA法分离和识别盐藻(Dunaliella salina)盐胁迫相关基因

采用cDNA代表性差异分析 (RDA)技术 ,对盐藻在盐胁迫时差异表达的基因进行了分离鉴定 .在分离到的 10个基因中 ,有 5个与已知基因同源 (包括叶绿素a b结合蛋白基因、蛋白磷酸酶I催化亚基基因和 3个核糖体蛋白基因 ) ,还有 5个未知功能基因则是首次在盐藻中被分离 .值得注意的是 ,所有这 5个已知基因的功能都与细胞分裂或盐胁迫有关 .结果表明 :取样时盐藻细胞仍处于恢复阶段 ,所分离到的基因对于盐藻耐盐可能具有重要意义 ;蛋白磷酸酶I的下调表达可能是盐藻调节离子平衡的一个重要过程和细胞分裂受阻的原因所在 ;盐藻减缓细胞分裂速度可能是为了减少能量消耗 ,以留出足够的能量来应对盐胁迫 ;其它 5个未知基因可能也与盐藻适应盐胁迫机制有关 .     

杜氏盐藻寡糖基转移酶亚基STT3a功能结构域的克隆与表达分析

为了研究STT3a基因在杜氏盐藻耐盐及鞭毛再生方面的作用,根据衣藻、拟南芥等STT3a蛋白的氨基酸高度保守序列VCVFTA、DVDYVL设计一对简并引物,采用RT-PCR及3'RACE的方法扩增杜氏盐藻STT3a蛋白功能结构域的cDNA序列。序列分析显示克隆的cDNA全长1650bp,具有一定保守性,与衣藻、拟南芥和人的相似性分别为48%、50%和46%。实时荧光定量PCR结果显示杜氏盐藻STT3amRNA水平随着盐浓度的升高而逐渐增加,其水平在3.5mol/LNaCl浓度时比在1.5mol/LNaCl浓度时升高了11倍(P0.01)。另外,与没有脱鞭毛的杜氏盐藻相比,STT3amRNA在鞭毛再生过程中持续高表达。本研究显示杜氏盐藻STT3a基因的高表达可以增强其盐适应和鞭毛再生能力。     

盐藻基因组DNA文库的构建(英文)

以ＬａｍｂｄａＦＩＸ○ＲⅡ为载体,构建了盐藻（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｓａｌｉｎａ）的基因组文库。该文库包含了１．１×１０６个重组子,插入片段平均大小为１８ｋｂ左右,含插入片段的频率为１００％。该文库的容量约为盐藻单倍体基因组的２００倍。     

盐生杜氏藻对盐度改变的生理响应

以盐生杜氏藻为实验材料,采用f/2培养基,设置了8个盐度(15、20、25、30、50、70、90、110)处理,分盐度改变前(A)和盐度改变后(B)两个实验阶段,研究了盐生杜氏藻在不同盐度处理下的生长情况,测定了藻液的OD值、叶绿素a、β-胡萝卜素、可溶性蛋白质和可溶性糖含量等指标。结果表明,A阶段,几个较低盐度(15、20、25和30)处理生长状况较好,其中又以盐度20的处理最好;余下的处理,盐度越高,其生长所受的影响越大。B阶段,盐生杜氏藻的生长进入平台期后,50、70、90、110几个盐度较高处理的细胞密度、叶绿素a、β-胡萝卜素含量均显著超过了作为对照的盐度20的处理。且B阶段末期,先前盐度15的处理蛋白质、糖的积累量,与A阶段末期相比都有了不同程度的增加,而其余盐度处理组的蛋白质、糖含量则分别产生了不同程度的下降。     

盐生杜氏藻甘油-3-磷酸脱氢酶的分离纯化及其特性的研究

利用ＰＥＧ分级,ＤＥＡＥ离子交换层析,ＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ拟亲和层析,ＭｏｎｏＱ离子交换层析等手段,分离纯化盐生杜氏藻（Ｄｕｎａｌｉｅｌａｓａｌｉｎａ（Ｄｕｎａｌ）Ｔｅｏｄ．）甘油三磷酸（Ｇ３Ｐ）脱氢酶（ＥＣ１．１．１．８）,得到比活为１２．６Ｕ／ｍｇ的电泳纯的酶,并对此酶的生化特性进行了研究。４％～２０％非变性聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳测得全酶分子量约为２７０ｋＤ,ＳＤＳＰＡＧＥ表明该酶只有一种分子量约为６５ｋＤ的亚基,据此推测该酶应为同四聚体。酶催化磷酸二羟丙酮（ＤＨＡＰ）还原的最适ｐＨ值为７．５,催化Ｇ３Ｐ脱氢的最适ｐＨ值为１０。该酶对４个底物还原型辅酶Ⅰ（ＮＡＤＨ）,二磷酸吡啶核苷酸（ＤＨＡＰ）,辅酶Ⅰ（ＮＡＤ）,Ｇ３Ｐ的表观Ｋｍ值分别为６３μｍｏｌ／Ｌ,２７２μｍｏｌ／Ｌ,１．５３ｍｍｏｌ／Ｌ,６．５２ｍｍｏｌ／Ｌ。该酶在保存过程中易失活。ＮＡＤＨ能降低酶失活的速度,而ＮＡＤ则不然。低浓度ＮａＣｌ对酶略有保护作用,但高浓度ＮａＣｌ加快酶的失活,且浓度越高效应越明显。