内皮祖细胞移植的研究现状与展望

内皮祖细胞血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）是干细胞的研究热点之一,它经过诱导分化后所得内皮细胞不仅能够在体外成功诱导分化生长,而且还能够分泌多种血管活性物质,具有修复内皮,重建血管等生理功能,相关的研究也证明EPCs移植可用于血管新生或心血管组织工程上。这为EPCs移植治疗的进一步研究奠定了基础,本文就内皮祖细胞在移植方面的研究现状与展望进行综述。     

血管内皮祖细胞与脑肿瘤血管生成

自Asahara等于1997年首次提出血管内皮祖细胞（endothelial progenitor ceils,EPCs）以来,有关EPCs的研究日益增多。EPCs是血管内皮细胞（endothelial cells,EC）的前体细胞,又称为血管母细胞,在某些情况下EPCs可被动员至外周血,归巢至靶组织参与生理和（或）病理性血管形成,内皮祖细胞被认为是脑肿瘤新生血管生成重要的起始环节,现就EPCs与脑肿瘤血管生成综述如下。     

血管内皮祖细胞在血管生物学中的作用

胚胎期血管生成存在两种方式，即血管发生(vasculogenesis)和血管形成(angiogenesis)。血管发生是指中胚层衍生的成血管细胞(angioblast)迁移、聚集、分化为成熟内皮细胞，在原位或远处形成原始毛细血管网的过程。血管形成系在原有血管基础上，成熟血管内皮细胞通过发芽(sprouting)、搭桥(bridging)方式形成新的血管的过程。以往认为，出生后血管生成仅以血管形成的方式进行。然而，自1997年Asahara等首次证明成人外周血中CD34^ 细胞能够在体外分化为血管内皮细胞、在体内缺血组织中整合形成新生血管以来，已有越来越多的证据表明，成年体     

外周血内皮祖细胞体外培养分化研究

目的从人外周血中分离、培养和鉴定内皮祖细胞(EPCs),并观察其在体外增殖分化过程中各种细胞表型的变化。方法采用密度梯度离心方法获得外周血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,于培养第7天选择免疫荧光(DiI-acLDL/FITC-UEA-Ⅰ)鉴定EPCs,并且用流式细胞仪和RT-PCR方法观察上述细胞在第0、4、10和21天的CD34、CD31、KDR和eNOS的表达变化。结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;第7天免疫荧光染色表明,约70%的细胞呈双荧光阳性;流式细胞仪分析显示,CD31和KDR表达在体外培养过程中逐渐升高,至第21天分别达到(72.1±11.2)%和(81.0±12.5)%,而CD34在第10天达到高峰(38.0±13.4)%后,第21天下降为(28.3%±12.2)%;RT-PCR结果表明,第4、10和21天eNOS的表达逐渐增强。结论本试验成功从外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增分化为成熟内皮细胞的过程中,CD31、KDR和eNOS等内皮细胞标志表达逐渐增强,而CD34的表达在内皮祖细胞的成熟分化过程中略有下降。     

外周血内皮祖细胞体外培养分化研究

目的从人外周血中分离、培养和鉴定内皮祖细胞(EPCs),并观察其在体外增殖分化过程中各种细胞表型的变化.方法采用密度梯度离心方法获得外周血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,于培养第7天选择免疫荧光(DiI-acLDL/ FITC-UEA-Ⅰ)鉴定EPCs,并且用流式细胞仪和RT-PCR方法观察上述细胞在第0、4、10和21天的CD34、CD31、KDR和eNOS的表达变化.结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;第7天免疫荧光染色表明,约70%的细胞呈双荧光阳性;流式细胞仪分析显示,CD31和KDR表达在体外培养过程中逐渐升高,至第21天分别达到(72.1±11.2)%和(81.0±12.5)%,而CD34在第10天达到高峰(38.0±13.4)%后,第21天下降为(28.3%±12.2)%;RT-PCR结果表明,第4、10和21天eNOS的表达逐渐增强.结论本试验成功从外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增分化为成熟内皮细胞的过程中,CD31、KDR和eNOS等内皮细胞标志表达逐渐增强,而CD34的表达在内皮祖细胞的成熟分化过程中略有下降.     

血管内皮祖细胞临床应用与生物安全性

血管内皮祖细胞是机体成熟血管内皮细胞的前体细胞，近年来，它在心血管疾病和外周血管疾病中的治疗作用受到广泛关注，成为一个研究热点。现就其动员、临床应用和安全性作一综述。     

内皮祖细胞对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的：观察内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPCs)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)增殖的影响。方法：采用6%羟乙基淀粉沉降红细胞和密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,EGM-2细胞培养基进行培养,诱导单个核细胞贴壁并向EPCs分化;采用荧光显微镜双染色、流式细胞术鉴定EPCs,间接免疫荧光检测VSMCs收缩表型标志物α-SM-actin和calponin的表达;Transwell培养板建立早期EPCs和大鼠VSMCs共培养模式,以20%胎牛血清刺激VSMCs增殖,分别共培养6,12,24,48,72 h后收集VSMCs,采用BrdU标记法、蛋白定量、流式细胞术分析VSMCs DNA合成能力、细胞总蛋白含量以及细胞周期进程。结果：从脐血单个核细胞成功培养了EPCs。EPCs和大鼠VSMCs共培养12,24,48,72 h后,VSMCs DNA合成能力、细胞总蛋白含量均较对照组明显降低(P＜0.05),其中以48 h最明显;流式细胞术显示,共培养组VSMCs细胞周期中S期细胞所占百分率较对照组显著降低(P＜0.05),而细胞周期中G1期细胞所占百分率均相应高于对照组(P＜0.05),其中均以48 h最明显。结论：早期EPCs能够抑制VSMCs增殖。     

内皮祖细胞生物学特性及其在血管新生障碍性疾病中的作用

内皮祖细胞是一种原始细胞,能够迁移至外周血并分化为成熟内皮细胞,参与胚胎时期的血管生成、出生后的微血管新生。现就内皮祖细胞的生物学特性及其功能作一综述。     

血管内皮生长因子基因修饰内皮祖细胞对内膜损伤血管修复的影响

目的 探讨人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)基因转染骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)及对EPCs增殖的影响,在体研究VEGF基因修饰EPCs对内膜损伤血管再内皮化的影响.方法 体外分离、培养、鉴定EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组、pcDNA3空质粒转染组、空白对照组.ELISA法检测EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测hVEGF165基因修饰对EPCs增殖的影响.基因修饰EPCs移植到内膜损伤血管模型中,观察基因修饰对EPCs修复内膜损伤的效应.结果 FITC-UEA-Ⅰ和DiⅠ-acLDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs迁移、黏附和增殖.基因修饰EPCs促进损伤内膜修复.结论 EPCs可以成功转染hVEGF165基因,并且促进EPCs的迁移、黏附和增殖,增强EPCs对损伤内膜修复的能力.     

血管内皮祖细胞与冠心病的研究进展

近年来,冠心病已成为严重威胁人类健康的主要疾病之一,其致死率极高,在欧美国家已占到总人口死亡数的1/3～1/2。对本病的发病机制,目前多数学者支持"内皮损伤反应学说",认为反复的内皮细胞损伤是动脉粥样硬化的起始病变。自1 997年,Asahara等首次从循环外周血中分离得到能分化为血管内皮细胞的前体细胞,并将其命名为内皮祖细胞以来,已有大量临床前试验证明内皮祖细胞具有参与出生后血管新生及修复损伤内皮的潜能,并在临     

外周血来源的内皮祖细胞的体外培养与分化

目的研究内皮祖细胞(EPC)的分离、培养、分化及鉴定.方法Ficoll密度梯度离心分离外周血获取单核细胞,在加有EGM-2-MV-SingleQuots的EBM-2培养液中培养和扩增,免疫组化和免疫荧光测定分化细胞表面特异性抗原的表达.结果培养后10 d细胞融合,呈克隆样生长,20 d后细胞呈现典型的鹅卵石样内皮细胞形态;免疫组化和免疫荧光显示,CD31、vWF、FLK-1/KDR/VEGFR-2和VE-cadherin均呈阳性.结论外周血来源的单核细胞含有内皮祖细胞,能在一定的培养条件下分化成为血管内皮细胞.     

回阳生肌膏抗小鼠骨髓内皮祖细胞功能损伤的研究

目的观察回阳生肌膏对过氧化氢(H₂O₂)诱导的小鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs)功能损伤的影响。方法通过密度梯度离心法联合差速贴壁法提取、分离、培养小鼠骨髓EPCs,观察细胞形态及采用FITC标记的荆豆凝集素-1联合Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)双摄取法鉴定EPCs。制备回阳生肌膏水提取物,采用细胞增殖/毒性试剂盒(CCK-8)筛选出最大无毒质量浓度(C)。针对回阳生肌膏水提取物进行化学成分定性分析。以0.12 mL/L H₂O₂刺激EPCs模拟糖尿病足溃疡氧化应激状态建立模型,将细胞密度调整至5×10⁸ L^-1,分别种于培养板,5孔为1组。将细胞分为空白对照组,模型组,回阳生肌膏高、中、低剂量组。空白对照组与模型组不予干预,各给药组分别予回阳生肌膏水提取物高剂量(C)、中剂量(C/2)、低剂量(C/4)。采用CCK-8法、Transwell实验、小管形成实验分别检测细胞的增殖、迁移、小管形成功能,酶联免疫吸附测定(ELISA)及硝酸还...     

血管内皮生长因子对大鼠骨髓内皮祖细胞生物学特性的影响

目的 观察内皮祖细胞(EPC)在不同浓度血管内皮生长因子(VEGF)作用下的生物学特性,探讨VEGF对EPC生物学特性的影响.方法 采用密度梯度离心法获取鼠骨髓单个核细胞,培养7 d后收集贴壁细胞鉴定EPC,用含不同浓度VEGF(0、10、50 ng/ml)的培养基继续培养.采用MTT比色法、Transwell小室实验观察EPC的增殖和迁移能力,应用纤维蛋白凝胶观察EPC体外血管形成能力,流式细胞术检测EPC的分化能力.结果 培养7 d的细胞CD133和CD34阳性率分别为69.44%和81.05%.MTT实验显示,10 ng/ml组细胞的吸光值明显大于0 ng/ml组和50 ng/ml组,0 ng/ml组的吸光值明显大于50 ng/ml组(P＜0.05);迁移实验、体外血管形成实验及诱导分化实验显示,50 ng/ml组和10 ng/ml组较0 ng/ml组更能促进EPC的迁移、体外血管形成及诱导分化,且50 ng/ml组强于10 ng/ml组(P＜0.05).结论 VEGF能够提高EPC迁移能力、体外血管形成能力及促进诱导分化,且随着VEGF浓度的升高而增强.VEGF能够提高EPC增殖能力,但随着浓度的升高而减弱.     

兔外周血内皮祖细胞的培养与鉴定

目的研究兔外周血内皮祖细胞(EPCs)的分离和定向培养的方法,并对其功能进行鉴定。方法从兔股静脉插管抽取静脉血20 mL,采用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心法分离单个核细胞,接种于人纤连蛋白包被的培养板上,分别予含血管内皮生长因子(VEGF)20 ng／mL或内皮细胞生长添加剂(ECGS)30μg／mL的M199培养基培养。培养2周后进行免疫荧光染色鉴定内皮祖细胞。结果每毫升外周血可分离1×106～2×106个单个核细胞,两组均于接种后第2～3天细胞胞体增大,有的呈多边形或梭形;第4天出现条带或栅栏状分布;第7～8天梭形细胞增多;第14天左右出现细胞集落,其特点是中央为圆形细胞,外周是梭形细胞;添加VEGF的培养基组每接种5×105个单个核细胞出现5～10个细胞集落,而添加ECGS者出现8～15个。第4周,添加VEGF的培养基组的细胞开始脱落而死亡,而添加ECGS的细胞仍持续稳定生长,呈铺路石样分布。两组在荧光显微镜下均可见双阳性的EPCs,血管性假性血友病因子(vWF)染色阳性。结论采用VEGF和ECGS均可体外培养兔外周血内皮祖细胞,且均能使其诱导分化为内皮样细胞,而ECGS较VEGF诱导效果更佳。     

内皮祖细胞移植对扩张型心肌病大鼠血管新生的影响

目的 探讨内皮祖细胞（EPC）对扩张型心肌病大鼠心肌内血管新生的影响。方法 50只雌性SD大鼠于腹股沟皮下注射异丙肾上腺素,250mg/kg,连续2d,制作扩张型心肌病（DCM）模型。随机分为EPC治疗组和对照组;心脏彩超评估心功能情况免疫组化方法检测心肌细胞内的血管密度。结果 细胞移植3个月后EPC组心肌内血管密度高于对照组。结论 心肌内移植EPC是治疗扩张型心肌病的有效方法,安全,可行。     

血管内皮祖细胞治疗缺血性心脏病的研究进展

内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞,是一类能够迁移、增殖,并分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞,属于干细胞群体,参与人胚胎血管生成及出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程,还可在一定条件下分化为心肌细胞。近年来的研究表明其与冠心病发生、发展及治疗的关系密切,为冠心病治疗提供了新思路。本文就内皮祖细胞的生物学特性及其在缺血性心脏病中的临床研究现状予以综述。     

血管内皮细胞生长因子基因转染血管内皮祖细胞移植促进缺血皮瓣存活的实验研究

目的探讨VEGF165基因转染血管内皮祖细胞(EPCs)移植促进缺血皮瓣的血管新生,提高皮瓣存活率。方法体外分离、培养人脐血中EPCs,利用脂质体介导血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)基因体外转染EPCs,然后移植于裸鼠随意皮瓣,皮瓣早期断蒂。结果脐血中分离培养的EPCs表达CD34、KDR及CD133,VEGF165基因转染EPCs体外及体内检测均有VEGF165蛋白的表达。转染VEGF165基因的EPCs组和EPCs组移植裸鼠皮瓣后,EPCs整合到缺血部位新生血管中,与对照组的皮瓣存活率分别为97 2% ±2 8%、60 3% ±2 1%、34 2% ±1 8% (P<0 05 ),而且前二组毛细血管密度、血流灌注差异均有统计学意义(P<0 05),较对照组均有明显改善(P<0 05)。术后第7d时三组皮瓣中的EPCs密度分别为136个/mm2 ±10个/mm2、75个/mm2 ±6个/mm2、0个/mm2 (P<0 05 ); 第11天时EPCs密度分别为305个/mm2 ±26个/mm2、199个/mm2 ±18个/mm2、0个/mm2 (P<0 05)。结论脐血中的EPCs体外培养后移植体内可促进缺血皮瓣的血管新生,提高存活率,而转染VEGF165基因的EPCs具有更强大的促血管新生的作用。     

人血管内皮细胞生长因子165基因转染大鼠内皮祖细胞的实验研究

目的探讨人血管内皮细胞生长因子165（hVEGF165）基因转染骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对其影响。方法体外分离、培养、鉴定大鼠骨髓EPCs,ELISA检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测对其增殖的影响。结果FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs增殖,注射转基因EPCs的大鼠皮下局部血管增加。结论hVEGF165基因可成功转染EPCs,并且具有血管内皮增殖刺激活性,为进一步研究hVEGF165基因修饰EPCs治疗血管内膜损伤性疾病提供实验依据。     

内皮祖细胞及其在血管组织工程中的应用

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是指能从骨髓迁移到外周血,并分化为血管内皮细胞的祖细胞,又称血管内皮干细胞(endothelial stemcells)。1997年Asahara等[1]应用免疫磁珠法从成人外周血中分离CD34+细胞,并在预衬纤维连接蛋白(fibronectin,Fn)的培养皿培养,得到的细胞可表达vWF、CD34、CD31、VEGFR-2等内皮细胞特异性抗     

Fn14⁃PI3K⁃Akt介导TWEAK促人脐血内皮祖细胞血管生成研究

目的：探讨Fn14?PI3K?Akt信号通路介导的肿瘤坏死因子样弱凋亡因子（tumor necrosis factor?like weak inducer of apoptosis,TWEAK）对人脐血来源的内皮祖细胞（human endothelial progenitor cells,hEPCs）增殖、迁移、血管形成能力的影响。方法：体外培养、分离和鉴定hEPCs,以其受体成纤维细胞生长因子14 siRNA（Fn14 siRNA）及PI3K特异性抑制剂LY294002（LY）作干预处理。细胞分为对照组、TWEAK干预组、TWEAK+ Fn14 siRNA阻断组和TWEAK+LY阻断组。分别采用CCK?8法检测细胞增殖能力,Transwell小室检测细胞迁移能力,Matrigel小管形成试验评价细胞血管生成能力,Western blot法测定细胞裂解液中p?Akt和T?Akt的表达。结果：hEPCs体外培养实验表明,TWEAK可明显促进hEPCs的增殖和迁移,并能提升hEPCs的血管形成能力,但在TEWAK+Fn14 siRNA及TWEAK+LY组中hEPCs的增殖、迁移及血管形成能力显著降低。且TWEAK组p?Akt表达较对照组显著增加,而TWEAK+Fn14siRNA组、TWEAK+LY组p?Akt表达较TWEAK组显著降低。结论：TWEAK具有调控hEPCs促血管新生的作用,其促血管新生的作用可能受到Fn14?PI3K?Akt信号通路的限制。