妊娠期糖尿病中患者miR-138-5p通过调控缺氧诱导因子1α保护β细胞功能

目的:探讨在妊娠期糖尿病(GDM)患者中miR-138-5p对胰岛β细胞功能的影响及其相关作用机制。方法:通过RT-qPCR对比15例GDM患者与15例的正常健康孕妇外周血中miR-138-5p的表达差异;miR-138-5p mimic及inhibitor分别转染入β细胞系INS-1细胞中,过表达或抑制其在该细胞中的表达水平,并通过RT-qPCR验证转染效率;利用MTT增殖实验、Annexin V-FITC凋亡实验及胰岛素释放实验分别检测miR-138-5p对INS-1细胞的增殖、凋亡和胰岛素释放能力的影响;通过miRNA靶基因预测软件TargetScan筛选miR-138-5p的目标靶基因,并利用双荧光素酶基因报告及Western blot实验进行验证;功能挽救实验证实miR-138-5p是否通过靶向调控其目标基因而发挥对INS-1细胞的增殖、凋亡及胰岛素释放能力影响;Western blot实验检测miR-138-5p在INS-1细胞中作用的分子信号通路。结果:与正常健康孕妇相比,GDM患者外周血中miR-138-5p的表达显著低表达;在INS-1细胞中转染miR-138-5p mimic及inhibitor后可显著促进或抑制miR-138-5p的表达;过表达miR-138-5p可明显促进INS-1细胞的增殖,抑制其发生凋亡并促进细胞对胰岛素的释放能力;而下调miR-138-5p的表达,可显著抑制INS-1细胞的增殖,促进其发生凋亡及抑制细胞的胰岛素释放能力;通过miRNA靶基因预测软件TargetScan筛选缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)为miR-138-5p的目标靶基因,双荧光素酶基因报告实验及Western blot实验提示miR-138-5p可抑制INS-1细胞中HIF-1α的表达;功能挽救实验证实miR-138-5p通过调控HIF-1α的表达,影响INS-1细胞的增殖、凋亡及胰岛素释放能力;Western blot实验明确miR-138-5p可能通过靶向调控HIF-1α的表达,影响PI3K/AKT信号通路中PI3K、AKT及其磷酸化后的p-PI3K、p-AKT蛋白而发挥对INS-1细胞的作用。结论:在GDM患者中,miR-138-5p可能通过靶向调控HIF-1α的表达,进而影响PI3K/AKT信号通路,促进β细胞的增殖、抑制其凋亡,并促进其胰岛素释放能力从而保护β细胞的功能。     

miR-423-5p靶向水通道蛋白1对雨蛙肽诱导的急性胰腺炎AR42J细胞损伤的影响

目的:研究miR-423-5p对雨蛙肽诱导的胰腺AR42J细胞损伤的影响及其分子作用机制。方法:通过雨蛙肽处理AR42J细胞建立胰腺炎损伤模型,qRT-PCR检测AR42J细胞中miR-423-5p的表达,Western blot检测水通道蛋白1（aquaporin 1,AQP1）、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达,ELISA法检测培养上清中IL-6和TNF-α的分泌水平,流式细胞术测定细胞凋亡率,双荧光素酶报告系统验证miR-423-5p与AQP1间的调控关系。结果:在雨蛙肽诱导的AR42J细胞中miR-423-5p表达上调,AQP1表达下调;抑制miR-423-5p和过表达AQP1均可减轻雨蛙肽诱导的AR42J细胞损伤,抑制细胞凋亡;双荧光素酶报告系统结果显示miR-423-5p靶向负调控AQP1的表达;抑制AQP1逆转了抑制miR-423-5p对雨蛙肽诱导的胰腺AR42J细胞损伤的作用。结论:miR-423-5p通过靶向AQP1减轻雨蛙肽诱导的胰腺AR42J细胞损伤,抑制细胞凋亡。     

miR-142-5p通过DNA甲基转移酶1抑制胃癌细胞增殖迁移的机制研究

目的:探究miR-142-5p在胃癌（GC）细胞中的作用并研究其机制。方法:qRT-PCR检测miR-142-5p表达;CCK-8和Transwell实验研究miR-142-5p对细胞增殖及迁移的影响;双荧光素酶报告基因和Western blot验证miR-142-5p的作用靶点。结果:miR-142-5p在GC组织及细胞系中的表达分别低于人正常胃组织及胃正常上皮黏膜细胞系GES-1,且其表达水平与胃癌肿瘤大小及淋巴结转移密切相关。在MKN28细胞中过表达miR-142-5p及在BGC-823细胞中沉默miR-142-5p能够分别抑制及促进胃癌细胞的增殖和迁移。DNA甲基转移酶1（DNMT1）是miR-142-5p直接作用靶点,miR-142-5p能够直接调节DNMT1的表达,并通过DNMT1调控胃癌细胞增殖及迁移。结论:miR-142-5p在GC中的表达降低,并在胃癌细胞中发挥抑癌基因的作用,能够通过抑制DNMT1来抑制胃癌细胞的增殖和迁移。     

白藜芦醇调控miR-409-3p/FKBP14抑制胃癌细胞BGC823恶性进程

目的：探究白藜芦醇（resveratrol, RES）调控miR-409-3p/FKBP14对胃癌（gastric cancer, GC）细胞恶性生物学进程的影响。方法：CCK-8实验研究RES对BGC823细胞活性的影响；qRT-PCR检测RES对miR-409-3p表达的调控；EdU实验研究RES对BGC823细胞增殖的影响；Transwell实验研究RES对BGC823细胞迁移和侵袭的影响；双荧光素酶报告基因和Western blot实验检测miR-409-3p对FKBP14表达的调控。结果：RES（>200 μmol/L）能够显著抑制BGC823细胞活性。RES通过上调miR-409-3p抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。FKBP14是miR-409-3p的靶基因，RES能够通过上调miR-409-3p抑制胃癌细胞中FKBP14的表达。过表达FKBP14后减弱RES的抑癌作用。 结论：RES可通过调控miR-409-3p/FKBP14信号通路在胃癌中发挥肿瘤抑制作用，RES有应用于临床胃癌治疗的潜力。     

白藜芦醇通过miR-937/FOXQ1信号通路抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖

目的:研究白藜芦醇（RES）对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖的影响及其可能的作用机制。方法:CCK-8方法和流式细胞术分析细胞增殖和凋亡情况;TargetScan软件预测miR-937与叉头框蛋白Q1（FOXQ1）之间的关系,并采用双荧光素酶报告基因系统检测它们之间的相互作用;miR-937和FOXQ1 mRNA和蛋白表达水平分别采用逆转录-定量聚合酶链反应法（RT-qPCR）和Western blot法检测。结果:RES抑制Y79细胞增殖,诱导其凋亡;视网膜母细胞瘤细胞系中miR-937表达水平较正常组织明显降低,而RES可明显诱导Y79细胞中miR-937表达;FOXQ1可以与miR-937直接相互作用,且其表达水平与miR-937呈负相关性;视网膜母细胞瘤细胞系中FOXQ1表达水平较正常细胞明显增高,而RES可明显抑制Y79细胞中FOXQ1表达;与RES单纯处理组相比,RES+miR-937 inhibitor组明显降低miR-937表达,促使了FOXQ1表达,诱导Y79细胞增殖,并降低其凋亡。结论:RES通过上调miR-937水平降低FOXQ1表达,进而抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖、诱导其凋亡,提示miR-937/FOXQ1信号通路可能是视网膜母细胞瘤治疗的新靶标。     

microRNA-1304通过靶向血红素氧合酶-1对人肺癌细胞的抑制作用

目的:探讨miR-1304对肺癌细胞增殖和侵袭的作用及机制。方法:应用实时定量PCR检测miR-1304在不同转移能力肺癌A549和NCI-H1975细胞中的表达水平;脂质体2000介导分别转染miR-1304类似物和抑制物入A549 和 NCI-H1975细胞;应用MTT法和细胞集落形成实验分别检测miR-1304对肺癌细胞增殖活性的作用及生长抑制作用;细胞凋亡和细胞周期分别采用膜联蛋白V-PE/7-AAD和PI染色分析进行检测。双荧光素酶报告基因验证miR-1304是否作用于血红素氧合酶（heme oxygenase-1,HO-1） mRNA的3'UTR区预测靶位;Western blot检测HO-1蛋白水平。结果:miR-1304高表达可显著抑制肺癌细胞形成的数量和生存能力,以及诱导细胞凋亡和G0/G1期细胞周期阻滞。体外侵袭实验及细胞增殖实验结果显示,miR-1304可抑制肺癌细胞侵袭和增殖;经双荧光素酶报告基因验证HO-1是miR-1304的靶基因。结论:miR-1304在肺癌中表达,通过直接作用于HO-1可抑制肺癌细胞的侵袭和增殖,miR-1304是肺癌的一个潜在治疗靶点。     

miR-29a/HMGB1信号通路在高糖高脂诱导的心肌细胞纤维化中的作用

目的：探究miR-29a/HMGB1信号通路在高糖高脂（hyperglycemia and hyperlipidemia, HGHL）诱导的H9C2细胞纤维化过程中的作用。方法：使用含葡萄糖（33 mmol/L）和棕榈酸酯（500 μmol/L）的DMEM培养基干预H9C2细胞24 h用于后续实验。共有8个实验分组,分别为NC组、HGHL组、miR-NC组、mimics组、inhibitor组、pc-HMGB1组、si-HMGB1组和miR-29a mimics+pc-HMGB1组。流式细胞术检测各组H9C2细胞的凋亡率。Western blot实验检测各组H9C2细胞内转化生长因子-β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、过氧化物酶体增殖剂激活受体γ（PPARγ）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的表达量。RT-qPCR检测各组细胞中miR-29a以及TGF-β1、CTGF、MMP-9、PPARγ、HMGB1 mRNA的表达水平。划痕实验检测各组H9C2细胞的迁移能力。结果：HGHL干预后,H9C2细胞的凋亡率显著增加（P<0.05）,细胞迁移能力显著增强（P<0.05）,细胞内TGF-β1、CTGF和MMP-9 mRNA表达水平显著增加（P<0.05）,PPARγ mRNA的表达水平显著降低（P<0.05）,相应蛋白的表达量也随mRNA的变化发生改变（P<0.05）,此外H9C2细胞内miR-29a的表达水平也显著降低（P<0.05）。转染miR-29a mimics后,H9C2细胞因HGHL干预引起的凋亡率增加受到显著抑制（P<0.05）,细胞的迁移能力也受到显著抑制（P<0.05）,细胞内TGF-β1、CTGF和MMP-9蛋白表达量和mRNA表达水平相较于HGHL组显著降低（P<0.05）,PPARγ蛋白表达量和mRNA表达水平显著增加（P<0.05）。转染miR-29a inhibitor后促进了HGHL诱导的H9C2细胞纤维化过程。miR-29a负调控HMGB1蛋白及其mRNA在H9C2细胞内的表达,双荧光素酶报告基因实验结果显示HMGB1是miR-29a的下游靶基因。转染si-HMGB1与转染miR-29a mimics对HGHL诱导的H9C2细胞纤维化作用类似。同时转染miR-29a mimics与pc-HMGB1对HGHL诱导的H9C2心肌细胞纤维化无显著影响。 结论：HGHL干预后显著增加H9C2细胞的凋亡率,增强其迁移能力和纤维化的过程。同时HGHL干预显著下调miR-29a在细胞内的表达水平,miR-29a通过负调控HMGB1在细胞内的表达进而影响HGHL诱导的H9C2细胞纤维化。     

MiR-200a抑制Wnt/β-catenin信号通路缓解肾间质纤维化

目的: 探讨miR-200a对单侧输尿管梗阻小鼠肾Wnt/β-catenin信号通路的影响,进一步探讨miR-200a对肾间质纤维化的作用。方法: 应用单侧输尿管结扎(UUO)建立肾间质纤维化模型,24只6周C57BL/6雄性小鼠随机分为假手术组,UUO组,UUO+miR-200a组,UUO+NC组,每组6只。从模型建立第一天开始,给予UUO+miR-200a组每只小鼠尾静脉注射40 mg/kg的miR-200a,给予UUO+NC组每只小鼠尾静脉注射40 mg/kg的Negative Control,连续3 d。第7天取肾组织行HE及Masson染色,RT-PCR及Western Blot检测Wnt4、β-catenin、Fibronectin、α-SMA mRNA和蛋白在肾组织中的表达。结果: 与假手术组比较,UUO组中肾小管损伤,间质胶原沉积明显,Wnt4、β-catenin、Fibronectin、α-SMA mRNA及蛋白表达升高（P<0.05）。与UUO组比较,UUO+miR-200a组肾小管损伤和间质胶原沉积亦明显减轻,Wnt4、β-catenin、Fibronectin、α-SMA基因及蛋白表达降低（P<0.05）。结论: miR-200a能够抑制Wnt/β-catenin通路缓解肾间质纤维化。     

miR-150对药物代谢酶CYP3A4的调控作用

目的: 观察miR-150对药物代谢酶CYP3A4的调控作用。方法: 用不同浓度游离长链脂肪酸（FFA）刺激张氏肝细胞,使之成为脂肪变性肝细胞。通过荧光定量PCR和Western blot测定CYP3A4 mRNA和蛋白表达以及miR-150表达。生物信息学分析并构建野生型CYP3A4 3′-UTR双荧光素酶报告载体,与miR-150模拟物共转染。另外,在张氏肝细胞和脂肪变性肝细胞中分别转染miR-150模拟物和抑制剂,检测CYP3A4 mRNA和蛋白表达。 结果: 张氏肝细胞经1 mmol/L FFA诱导24 h后,与对照组相比,脂肪变性肝细胞中CYP3A4 mRNA和蛋白表达均显著下降（P<0.05）,miR-150表达上升（P<0.05）。经生物信息学分析发现CYP3A4为miR-150的靶基因,转染质粒和miR-150模拟物后,荧光活性下降。miR-150模拟物可使CYP3A4 mRNA表达呈浓度梯度下降（P<0.05）,也可使CYP3A4蛋白表达下降;miR-150抑制剂使CYP3A4 mRNA表达上升（P<0.05）。结论: miR-150可直接与CYP3A4的3'-UTR结合,进而直接调控CYP3A4的表达。     

miR-200c通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路诱导膀胱癌细胞阿霉素耐药

目的:探讨miR-200c表达与膀胱癌细胞阿霉素（DOX）耐药的关系。方法:过表达或抑制miR-200c表达后，检测DOX对膀胱癌细胞（RT4、RT112、T24和TCCSUP）生长抑制作用的变化。Western blot检测miR-200c对Wnt/β-连环蛋白信号通路的影响，检测Wnt/β-连环蛋白信号激活剂Wnt3a干预对miR-200c诱导膀胱癌DOX耐药作用的影响。结果:抗miR-200c转染后，T24和RT4细胞DOX的耐药性显著下降。DOX干预后，与对照组细胞相比，抗miR-200c转染组膀胱癌细胞凋亡和S期积累明显增加。此外，抗miR-200c转染组膀胱癌细胞中Dkk1,Kremen2和sFRP2等Wnt/β-连环蛋白信号的负调控蛋白表达明显升高，Wnt/β-连环蛋白信号通路活性明显下降。Wnt3a干预能够拮抗抗miR-200c转染的膀胱癌细胞生长抑制作用。结论:miR-200c表达与膀胱癌细胞DOX耐药密切相关，且Wnt/β-连环蛋白信号通路激活介导了miR-200c诱导的膀胱癌细胞DOX耐药性。     

下调lncRNA LINC00176对肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药和自噬的影响

目的：研究下调lncRNA LINC00176对肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药和自噬的影响及机制。方法：qRT-PCR方法测定正常支气管上皮16HBE细胞和肺癌A549、A549/DDP、NCI-H1299、SK-MES-1细胞中LINC00176的表达。将A549/DDP细胞分成对照组、si-NC组、si-LINC00176组、si-LINC00176+Anti-miR-NC组、si-LINC00176+Anti-miR-138-5p组。MTT实验检测顺铂对A549/DDP的半数抑制浓度（IC50）。流式细胞术测定细胞凋亡。Western blot测定LC3-I、LC3-II、Beclin 1、C-Caspase-3蛋白表达。利用荧光素酶报告系统鉴定LINC00176和miR-138-5p的靶向关系。结果：与16HBE细胞比较，A549、A549/DDP、NCI-H1299、SK-MES-1细胞中LINC00176表达水平显著升高（P<0.01）。与A549细胞比较，A549/DDP细胞中LINC00176表达水平显著升高（P<0.01）。与对照组、si-NC组比较，si-LINC00176组A549/DDP细胞IC50显著降低（P<0.01），LC3-II/LC3-I、Beclin 1蛋白表达显著降低（P<0.01），凋亡率、C-Caspase-3蛋白表达、miR-138-5p表达水平显著升高（P<0.01）。LINC00176与miR-138-5p直接结合。与si-LINC00176+Anti-miR-NC组比较，si-LINC00176+Anti-miR-138-5p组A549/DDP细胞IC50显著升高（P<0.01），LC3-II/LC3-I、Beclin 1蛋白表达显著升高（P<0.01），凋亡率、C-Caspase-3蛋白表达显著降低（P<0.01）。 结论：下调lncRNA LINC00176通过靶向上调miR-138-5p能够抑制肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药，抑制细胞自噬，诱导细胞凋亡。     

大蒜素对肝脏药物转运体OATP1B1转运功能的影响

目的: 观察大蒜素对肝脏药物转运体-有机阴离子转运多肽1B1(Organic anion transporting polypeptide 1B1, OATP1B1)转运功能的影响。方法: 利用稳定表达人OATP1B1的人胚胎肾293(Human embryonic kidney 293, HEK293)细胞株,以[³H]硫酸雌酮和普伐他汀为底物进行OATP1B1摄取反应,观察大蒜素对OATP1B1摄取功能的影响。结果: 大蒜素对OATP1B1摄取[³H]硫酸雌酮和普伐他汀的功能有竞争性抑制作用,抑制常数K_i值分别为(18.3±5.2) μmol/L 和(15.4±6.8) μmol/L。结论: 大蒜素对肝脏药物转运体OATP1B1转运功能的抑制作用可诱导中药-西药相互作用。     

miR-195-5p通过靶向调控FBXW7基因对氧化型低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞损伤的影响研究

目的：探讨miR-195-5p对氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL）诱导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）损伤的影响及其作用机制。方法：RT-PCR检测miR-195-5p在ox-LDL诱导的HUVECs细胞中的表达;CCK-8、ELISA和流式细胞仪分别检测细胞增殖、氧化应激和凋亡;双荧光酶素报告分析实验检测miR-195-5p的潜在作用靶点;Western blot检测靶蛋白在ox-LDL诱导的HUVECs细胞中的表达及其与miR-195-5p表达之间的关系。结果：miR-195-5p在ox-LDL诱导的HUVECs细胞中的表达显著高于正常HUVECs细胞。随后,在ox-LDL诱导的HUVECs细胞中沉默miR-195-5p能有效促进HUVECs细胞增殖,并抑制氧化应激因子［丙二醛（malondialdehyde, MDA）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）］表达和凋亡水平。双荧光酶素实验和Western blot结果分别显示miR-195-5p可以直接靶向FBXW7蛋白基因并负调控FBXW7的表达。最后,miR-195-5p能通过调节FBXW7的表达影响ox-LDL诱导的HUVECs细胞增殖、氧化应激和凋亡。 结论：miR-195-5p在ox-LDL诱导的HUVECs细胞中高表达。此外,miR-195-5p能通过抑制FBXW7的表达来加剧ox-LDL诱导的HUVECs细胞毒性、氧化应激和凋亡损伤。     

豆腐果苷对人孕烷X 受体介导的CYP3A4 和MDR1 的转录调节作用

目的 建立和验证人孕烷X 受体(humanpregnant X receptor, hPXR) 介导的CYP3A4 、MDR1药物诱导剂的体外筛选体系, 考察豆腐果苷对hPXR 介导的CYP3A4 、MDR1 的转录调节作用。方法 利用构建的双荧光素酶报告基因系统, 将表达载体和报告载体共转染HepG2 细胞, 以10 μmol/L 利福平为阳性对照, 用不同浓度(0.004 、0.04 、0.4 μmol/L) 豆腐果苷处理48 h 后裂解细胞进行双荧光素酶活性检测。结果 不同浓度的豆腐果苷均不能通过激活hPXR 来介导CYP3A4 和MDR1 表达上调, 各浓度处理组的双荧光素酶比活性值与DMSO 溶媒组差异无统计学意义(P >0.05)。结论 成功构建了hPXR 介导的CYP3A4 和MDR1 药物诱导剂的体外筛选体系, 并发现豆腐果苷不能通过激活hPXR 介导CYP3A4和MDR1 的表达上调。