CerS2对膀胱癌细胞增殖、迁移及AKT/mTOR信号通路的影响

目的:探究CerS2基因在膀胱癌细胞中的作用及其可能的机制。方法:构建pEGFP-C1-CerS2重组表达载体,并转染膀胱癌细胞系T24,使用蛋白质免疫印迹实验检测GFP-CerS2的表达;运用CCK-8法检测细胞增殖活性;运用Annexin Ｖ荧光标记实验检测细胞凋亡水平;分别使用细胞划痕实验及Transwell实验检测细胞迁移能力和侵袭能力;使用蛋白质免疫印迹实验检测细胞中AKT、p-AKT、mTOR及p-mTOR的表达水平。结果:重组GFP-CerS2融合蛋白在T24细胞中可以正常表达,过表达GFP-CerS2显著抑制了膀胱癌细胞的增殖活性,且显著增加了细胞凋亡水平。过表达GFP-CerS2抑制了膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。此外,过表达GFP-CerS2也显著抑制了膀胱癌细胞中AKT和mTOR的磷酸化修饰,但不影响总AKT及mTOR的表达水平。结论:过表达CerS2可以抑制AKT/mTOR信号通路,影响膀胱癌细胞的增殖和凋亡,并抑制细胞的迁移和侵袭能力。     

GADD45α在膀胱癌组织和细胞中的表达及作用机制

目的:检测GADD45α基因在膀胱癌中的表达情况及作用机制。方法:分别使用免疫组化、荧光定量PCR和Western blot实验检测GADD45α基因在膀胱癌组织中的表达情况;用慢病毒包装质粒上调膀胱癌细胞中GADD45α的表达后,流式细胞仪分析膀胱癌细胞周期比例分布情况和用Western blot实验检测细胞周期蛋白激酶水平变化情况。结果:膀胱癌组织中GADD45α的表达水平较癌旁正常组织的表达降低;上调膀胱癌细胞中GADD45α的表达后,与control细胞相比,高表达GADD45α细胞的克隆大小和数目皆明显下降（86±12.3 vs 134±13.5,P＜0.05）;升高GADD45α表达后,膀胱癌细胞G2期比例升高至56.54%,而G1期比例则由82.87%下降至40.8%,S期比例由17.13%下降至2.66%,膀胱癌细胞周期被阻滞在G2/M期,伴随细胞周期蛋白激酶cdc2/cyclinB1的表达下降。结论:GADD45α在膀胱癌中表达下降,GADD45α通过抑制cdc2/cyclinB1的表达活性以阻滞膀胱癌细胞周期在G2/M期,抑制膀胱癌细胞的增殖。     

HNF4G对胆囊癌细胞增殖和迁移的影响及可能的作用机制

目的：探讨肝细胞核因子4γ(hepatocyte nuclear factor 4 gamma,HNF4G)对于胆囊癌细胞增殖、迁移、细胞周期和凋亡等的影响及相关作用机制。方法：分别采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测胆囊癌GBC-SD、NOZ和ZJU-0430细胞中HNF4G mRNA和蛋白的表达水平。采用慢病毒感染的方法在GBC-SD、NOZ和ZJU-0430细胞中构建HNF4G基因沉默或过表达的稳转细胞株。随后,分别采用CCK-8法和平板克隆形成实验检测HNF4G基因沉默或过表达对胆囊癌细胞增殖能力的影响,Transwell小室实验检测对胆囊癌细胞迁移能力的影响,FCM法检测对细胞周期和细胞凋亡的影响。最后,再用蛋白质印迹法检测改变HNF4G基因表达水平对细胞周期相关蛋白Cyclin A2和Cyclin B1、凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2、上皮-间充质转化相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug,以及ErbB2/PI3K/AKT信号通路中ErbB2和磷酸化AKT蛋白表达水平的影响。结果：实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测...     

沉默IGF2R促进膀胱癌5637细胞增殖及肿瘤形成的机制探讨

目的:研究IGF2R在膀胱癌5637细胞中的功能。方法:应用Real-Time PCR和Western blot的方法检测膀胱癌组织及癌旁正常膀胱黏膜组织中IGF2R的表达水平。应用免疫荧光方法研究IGF2R在膀胱癌5637细胞中的定位情况。通过MTT法及体内裸鼠移植瘤的方法检测IGF2R对细胞增殖的影响。Western blot方法研究分子机制。结果:IGF2R在膀胱癌组织中呈现低表达(P<0.05)。体外及体内实验证明,沉默IGF2R表达可以促进膀胱癌5637细胞增殖(P<0.05),并且敲减IGF2R后我们观察到了磷酸化AKT水平的增高。结论:IGF2R在膀胱癌发生、发展过程中起到一个抑癌基因的作用。下调IGF2R可能通过激活AKT信号通路促进肿瘤细胞增殖。     

KIF20A对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭、凋亡及细胞周期分布的影响

目的:研究KIF20A对胶质瘤U87细胞系增殖、侵袭、迁移、凋亡及细胞周期分布的影响。方法:利用 RNA干扰技术下调胶质瘤细胞系 U87中 KIF20A 的表达。RT-qPCR 和 Western blot 分别检测 KIF20A 在mRNA 和蛋白水平上的表达。CCK-8 实验检测 U87细胞增殖能力的变化,Transwell 实验检测U87细胞迁移及侵袭能力的变化,流式细胞术检测 U87细胞凋亡及细胞周期的变化。结果:RT-qPCR和Western blot 结果显示 siRNA-KIF20A显著下调 KIF20A 的表达,CCK-8和Transwell 实验显示下调 KIF20A 的表达显著抑制了U87细胞的增殖、迁移及侵袭能力,流式细胞术结果显示下调 KIF20A 的表达显著促进了U87细胞的凋亡,诱导细胞周期阻滞在G0/G1期。结论:下调KIF20A的表达抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移及侵袭,促进胶质母细胞瘤细胞的凋亡并诱导细胞周期G0/G1期阻滞。     

Rab27在膀胱癌细胞中过表达并促进细胞的增殖和侵袭

目的:检测Rab27在人膀胱癌细胞系中的表达情况,并探讨Rab27表达与膀胱癌增殖侵袭的关系.方法:采用Western blot和RT-PCR检测Rab27在BIU-87、5637、RT4、J82 和T24细胞系中的表达.应用Rab27转染人膀胱癌细胞系BIU-87,应用Rab27 siRNA干扰人膀胱癌细胞系5637后,应用CCK-8、集落形成实验和基质胶侵袭实验来检测Rab27对膀胱癌增殖和侵袭的影响.结果:CCK-8、集落形成实验结果表明膀胱癌细胞系中Rab27转染能够提高细胞的增殖率,而Rab27敲除后则抑制细胞的增殖.基质胶侵袭实验表明Rab27敲除后下调了穿过基底膜的细胞数,而转染Rab27后穿过基底膜的细胞数显著增多.结论:Rab27促进着膀胱癌细胞的增殖与侵袭能力.     

miR-147a通过抑制CCND1和CDK4的表达对膀胱癌细胞周期和增殖的影响

目的:探讨miR-147a在膀胱癌组织、细胞中的表达及对膀胱癌细胞增殖和细胞周期的影响,研究miR-147a靶向负性调控CCND1和CDK4的表达对膀胱癌细胞周期和增殖的影响。方法:通过qRT-PCR检测miR-147a在正常膀胱组织和膀胱癌组织及正常膀胱上皮细胞、膀胱癌细胞系中的表达;使用miR-147a mimics转染观察细胞特性变化;CCK-8检测方法观察细胞增殖能力变化;流式细胞术观察细胞周期变化;生物信息学方法分析miR-147a的靶基因,并将靶基因进行GO分类和KEGG分析,找到与增殖和周期相关的基因;通过western blot方法验证miR-147a的靶基因,使用双萤光素酶报告基因系统检测miR-147a对CCND1和CDK4的转录活性影响;使用CCND1和CDK4特异性siRNA观察它们对细胞周期的影响,使用miR-147a inhibitor进行回补实验。结果:同正常组织/细胞相比,miR-147a在膀胱癌组织/膀胱癌细胞系中表达水平显著降低（P＜0.05）,miR-147a能够使膀胱癌细胞发生G1/S期阻滞,细胞增殖能力降低;通过一系列生信分析找到两个与细胞增殖和周期相关的miR-147a的靶基因CCND1和CDK4;通过间接和直接实验验证CCND1和CDK4是miR-147a的靶基因;下调CCND1和CDK4能够使膀胱癌细胞发生G1/S期阻滞,同时抑制miR-147a的表达能够解除G1/S期阻滞。结论:miR-147a作为一个抑癌因子,可作为诊断膀胱癌的生物标志物;miR-147a通过抑制CCND1和CDK4的表达抑制膀胱癌细胞周期G1/S期进程并抑制膀胱癌细胞增殖。     

miRNA-20a在膀胱癌中的表达及其机制研究

  目的  探讨miRNA-20a在膀胱癌组织中的表达及其机制。  方法  收集2014年1月至2015年1月昆明医科大学第二附属医院96例患者的组织标本,运用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）方法检测miRNA-20a在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达;生物信息学方法预测miRNA-20a的靶基因并采用双荧光素酶报告基因实验进行验证;qRT-PCR、Western blot以及细胞免疫荧光分别检测人膀胱癌细胞系T24和J82细胞转染miRNA-20a模拟物或阴性对照后对靶基因mRNA和蛋白表达的影响;CCK-8、Transwell侵袭小室和划痕实验检测过表达miRNA-20a后T24细胞体外增殖、迁移和侵袭能力的改变。  结果  miRNA-20a在膀胱癌组织中高表达,且与肿瘤的病理分级、临床分期、转移以及复发密切相关（P＜0.001）;双荧光素酶报告基因实验证实miRNA-20a与人源性长寿保障基因2（Homo sapiens longevity assurance homologue 2,LASS2）的3'-UTR直接靶向结合;转染miRNA-20a模拟物可显著下调膀胱癌细胞中LASS2 mRNA和蛋白的表达（P＜0.01）,增强膀胱癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力（P＜0.01）。  结论  miRNA-20a在膀胱癌组织中高表达,且miRNA-20a可通过靶向抑制LASS2促进膀胱癌细胞的增殖、侵袭和迁移,与膀胱癌的发生发展相关。      

CD24在复发性膀胱癌中的表达及其对癌细胞增殖的影响

目的：分析 CD24在复发性膀胱癌组织中的表达,探讨抑制 CD24表达对膀胱癌细胞增殖的影响。方法：应用免疫组化检测36例复发性膀胱癌组织中 CD24的表达情况,并进行半定量分析。利用脂质体转染法将含有 CD24特异性 siRNA 的真核表达质粒转染至人膀胱癌 BIU －87细胞中,实时定量 PCR 和 Western blot 法检测 BIU －87细胞中 CD24的表达情况改变,MTT 法、Transwells 侵袭实验分别检测下调 CD24的表达后,膀胱癌细胞增殖、侵袭能力发生的变化。并分析细胞中信号转导及转录活化因子（STAT3）、细胞周期蛋白（CyclinD1）、基质金属蛋白酶（MMP －9）的表达变化。结果：CD24在复发性膀胱癌组织中高表达,高级别膀胱癌组织中,阳性率达76．2％。细胞学实验中,经实时定量 PCR 和 Western blot 法证实实验组较对照组细胞CD24 mRNA 转录和蛋白表达水平明显降低。MTT 检测发现实验组较对照组细胞的增殖能力显著下降;Tran-swells 侵袭实验显示实验组的穿膜细胞数显著少于对照组。实验组中 STAT3、CyclinD1、MMP －9表达有明显下降。结论：CD24在复发性膀胱癌中高表达,并与肿瘤的分级呈正相关。体外实验中,抑制 CD24基因表达能显著抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭能力,间接提示 CD24可能参与膀胱癌的复发进程。     

CDO1通过PI3K/AKT信号通路调控胃癌细胞增殖及细胞周期

目的:探讨半胱氨酸双加氧酶1(CDO1)对胃癌细胞增殖、细胞周期的调控机制。方法:用脂质体法将si-NC组（转染si-NC）、si-CDO1组（转染si-CDO1）、pcDNA组（转染pcDNA）、pcDNA-CDO1组（转染pcDNA-CDO1）、pcDNA-CDO1+DMSO组（转染pcDNA-CDO1并用DMSO处理）、pcDNA-CDO1+IGF-1组（转染pcDNA-CDO1并用IGF-1处理）转染至AKG细胞。用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、免疫印迹（Western blot）、细胞计数试剂盒（CCK-8）、流式细胞术检测细胞CDO1、PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表达、细胞增殖、细胞周期。结果:与人胃黏膜上皮细胞GES-1相比，胃腺癌细胞AKG中CDO1的表达明显降低（P<0.05）；与si-NC组相比，si-CDO1组AKG细胞的增殖明显上调，细胞发生明显的S期、G2/M期阻滞，过表达CDO1则具有相反的作用。重要的是，敲减CDO1可上调PI3K/AKT信号通路关键基因PI3K、p-Akt的表达，而过表达CDO1具有相反的作用。激活PI3K/AKT信号通路后，过表达CDO1对胃癌细胞的增殖、细胞周期的调控作用可被部分逆转。结论:CDO1可抑制胃癌细胞的增殖，调控细胞周期，其机制与抑制PI3K/AKT信号通路的活性有关，将为胃癌的治疗提供参考。     

PRC1通过激活Wnt/β-catenin途径促进胶质母细胞瘤细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成

目的:探讨胞质分裂原蛋白调节因子-1（protein regulator of cytokinesis-1,PRC1）对胶质母细胞瘤的作用及其可能的机制。方法:RT-PCR和Western blot检测胶质母细胞瘤组织和正常脑组织中PRC1的表达;人胶质母细胞瘤细胞株U251转染siRNA-NC和siRNA-PRC1序列,RT-PCR检测细胞中PRC1 mRNA表达;Western blot检测细胞中PRC1、Wnt1、β-catenin和CyclinD1蛋白表达;CCK-8检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期分布;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭;血管生成实验检测血管生成。结果:与正常组织相比,癌组织中PRC1 mRNA和蛋白表达升高（P＜0.001）;与siRNA-NC组相比,siRNA-PRC1组细胞在24 h、48 h及72 h的细胞增殖能力降低（P＜0.01）,G0/G1期细胞含量升高（P＜0.05）,S和G2/M期细胞含量降低（P＜0.05）,细胞迁移数和侵袭数降低（P＜0.01）,内皮细胞管道形成数降低（P＜0.001）,Wnt1、β-catenin和CyclinD1蛋白表达降低（P＜0.01）。结论:PRC1在胶质母细胞瘤组织中表达上调,PRC1可能通过促进Wnt/β-catenin途径活化,促进胶质母细胞瘤细胞增殖、细胞周期进程、迁移、侵袭和血管生成。     

EGFR表达抑制对胃癌AGS细胞生物学行为及化疗敏感性的影响

目的:观察表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor,EGFR）表达抑制对胃癌AGS细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、细胞周期及化疗药物敏感性的影响。方法:设计3条EGFR-siRNA,转染胃癌AGS细胞,CCK-8方法测定细胞增殖,Transwell方法检测细胞侵袭和转移能力,流式细胞术测定细胞凋亡与周期,RT-PCR方法检测EGFR mRNA表达,Western blot方法检测EGFR、ERK、p-ERK、AKT和p-AKT蛋白表达。结果:EGFR干扰能有效抑制胃癌AGS细胞中EGFR的基因和蛋白表达水平（P＜0.05）。与对照组、阴性siRNA转染组相比,EGFR-siRNA转染组AGS细胞增殖抑制显著增加,迁移、侵袭能力显著下降,细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）,对顺铂、多柔比星、紫杉醇的化疗敏感性显著增加（P＜0.05）。EGFR表达抑制后,处于S期的细胞比例明显减少,G2/M期细胞比例明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05）。EGFR表达抑制后,AKT和p-AKT表达下调。结论:抑制EGFR表达可抑制胃癌AGS细胞增殖,降低细胞迁移和侵袭能力,增加细胞对顺铂、多柔比星、紫杉醇的化疗敏感性,其机制可能与AKT、p-AKT的表达下降有关。     

节拍化疗模式下卡培他滨强化依西美坦抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖的实验研究

目的:研究节拍化疗模式下卡培他滨联合依西美坦对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用及信号通路机制。方法:实验分为7组,CCK-8法检测单药与联合用药组对MCF-7细胞增殖的抑制率。流式细胞仪检测分析药物作用对MCF-7细胞周期与细胞凋亡的影响。Western blot法检测各用药组MCF-7细胞p27、Bcl-2、PI3K和AKT蛋白的表达情况。结果:卡培他滨的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50)为282.7 μmol/L、依西美坦IC50为103.5 μmol/L;联合用药组对MCF-7细胞增殖的抑制率高于单药组（P=0.003）;联合用药组中减小卡培他滨剂量不会显著降低细胞增殖抑制率（P=0.916）;与单药组影响细胞周期不同,联合用药会使MCF-7细胞停滞于S期或G1期;Western blot检测显示,联合用药会促进p27表达,抑制PI3K表达,促使细胞凋亡;低剂量卡培他滨会显著抑制Bcl-2表达（P=0.006）,使细胞停滞于S期。结论:小剂量卡培他滨节拍化疗联合依西美坦通过不同模式多方位影响MCF-7细胞周期及信号因子表达,显著抑制MCF-7细胞增殖。     

白藜芦醇上调BTG2表达抑制肝癌HepG2细胞增殖

目的:初步探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)对肝癌HepG2细胞增殖及BTG2表达的影响。方法:不同浓度Res(终浓度分别为20、40、80 μmol/L)处理HepG2细胞,CCK-8法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测各组细胞周期分布变化,RT-PCR、Western blot技术检测BTG2 mRNA和蛋白水平表达的变化。结果:Res可以显著抑制HepG2细胞的增殖,且呈浓度和时间依赖性(P＜0.01),药物作用48 h后IC50为34.58 μmol/L。Res可使HepG2细胞周期阻滞在G2/M期;随着Res作用浓度的升高,抗增殖基因BTG2 mRNA和蛋白的表达逐渐增加(P＜0.01)。结论:Res能够抑制肝癌HepG2细胞的增殖,对细胞周期具有阻滞效应且有浓度依赖性,其机制可能与其上调抗增殖基因BTG2表达相关。     

Gαs在乳腺癌他莫昔芬耐药中的作用

目的:研究Gαs在乳腺癌他莫昔芬耐药中的作用,寻求逆转乳腺癌他莫西芬耐药的分子靶点.方法:通过RNA干涉技术沉默乳腺癌他莫昔芬耐药(TAM-R)细胞中Gαs的表达,QPCR及Western blot检测其沉默效果,给予细胞4-羟他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen,OHT)处理,通过MTT检测Gαs表达改变对耐药细胞增殖的影响,并检测细胞中AKT磷酸化水平.结果:Gαs-RNAi可以有效沉默Gαs在mRNA及蛋白水平的表达,而沉默Gαs的他莫昔芬耐药细胞给予4-羟他莫昔芬10 nmol/L处理后,细胞增殖明显受到阻滞,AKT磷酸化水平明显降低.结论:Gαs通过诱导AKT磷酸化在乳腺癌他莫昔芬耐药中发挥着重要作用.     

膀胱癌组织中TIPE通过调节VEGFR2表达促进膀胱癌细胞增殖、迁移和血管生成

目的:探究膀胱癌组织中TIPE通过调节血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）表达促进膀胱癌细胞增殖、迁移和血管生成的机制。方法:收集膀胱癌组织及其对应的癌旁组织各34例,以人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1、人膀胱癌细胞株UMUC3和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为体外研究对象,免疫组织化学（IHC）检测组织中TIPE表达;RT-PCR检测细胞中TIPE mRNA表达;Western blot检测组织和细胞中TIPE、PDK1、p-PDK1和VEGFR2蛋白表达;CCK-8检测UMUC3细胞增殖能力;Transwell实验检测UMUC3细胞迁移能力;血管形成实验检测HUVECs血管形成能力。结果:与癌旁组织相比,膀胱癌组织中TIPE IHC评分和蛋白表达明显上调（P＜0.05）。与SV-HUC-1组相比,UMUC3组中TIPE mRNA和蛋白表达水平明显上调（P＜0.05）。与siRNA-NC组相比,siRNA-TIPE组UMUC3细胞增殖、迁移能力、HUVECs的管道交叉数明显降低（P＜0.05）,TIPE、p-PDK1和VEGFR2蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。PDK1抑制剂GSK2334470（简称GSK）的使用浓度为4 μmol/L。与Vector组相比,TIPE组UMUC3细胞TIPE、p-PDK1和VEGFR2蛋白表达水平及细胞增殖、迁移能力和HUVECs的管道交叉数明显升高（P＜0.05）,Vector+GSK组UMUC3细胞p-PDK1和VEGFR2蛋白表达水平及细胞增殖、迁移能力和HUVECs的管道交叉数明显降低（P＜0.05）,GSK可逆转TIPE对UMUC3和HUVECs细胞的作用。结论:TIPE通过磷酸化PDK1上调VEGFR2表达促进膀胱癌细胞增殖、迁移和血管生成。