槲皮素对转化生长因子β1介导的视网膜色素上皮细胞上皮-间质转化过程的影响

目的　探讨槲皮素对转化生长因子β1（TGF-β1）介导的视网膜色素上皮(RPE)细胞增殖、迁移、I型胶原蛋白含量、上皮-间质转化相关标志物表达以及Smad信号通路的影响。方法　取人RPE细胞系（ARPE-19细胞）进行培养,依据干预药物浓度筛选结果设置4个组:对照组、10.0 mg·L^-1TGF-β1组、10.0 mg·L^-1TGF-β1+25 μmol·L^-1槲皮素组、10.0 mg·L^-1TGF-β1+50 μmol·L^-1槲皮素组,ARPE-19细胞在4种不同的条件下培养24 h和48 h。采用CCK-8法测定各组细胞活性,Transwell实验检测细胞迁移情况,ELISA检测细胞中I型胶原蛋白含量,Western blot 检测各组细胞上皮-间质转化标志物表达情况及Smad2/3磷酸化情况。结果　处理细胞24 h或48 h,10.0 mg·L^-1TGF-β1组细胞存活率均高于其他各组（均为P<0.05）;10.0 mg·L^-1TGF-β1+25 μmol·L^-1槲皮素组细胞存活率高于10.0 mg·L^-1TGF-β1+50 μmol·L^-1槲皮素组（P<0.05）。处理细胞24 h或48 h,10.0 mg·L^-1TGF-β1组细胞迁移数均多于其他各组（均为P<0.05）;10.0 mg·L^-1TGF-β1+25 μmol·L^-1槲皮素组细胞迁移数多于10.0 mg·L^-1TGF-β1+50 μmol·L^-1槲皮素组（P<0.05）。10 mg·L^-1 TGF-β1处理细胞48 h后,培养基上清液I型胶原蛋白含量升高（P<0.05）,而加入不同浓度槲皮素均能够有效抑制I型胶原蛋白含量的升高（均为P<0.05）。槲皮素以浓度依赖的方式显著降低了TGF-β1所引起的N-钙黏合素和α平滑肌肌动蛋白的表达增高作用;槲皮素可以使紧密连接蛋白ZO-1和E-钙黏合素的表达增高。10 mg·L^-1 TGF-β1处理细胞48 h后,Smad2/3磷酸化显著增加,而槲皮素可以抑制Smad2/3磷酸化。结论　槲皮素能够显著抑制TGF-β1介导的RPE细胞增殖、迁移和胶原分泌,通过调节Smad2/3磷酸化来抑制TGF-β1介导的RPE细胞的上皮-间质转化过程。     

ALK5抑制剂对转化生长因子-β1（TGF-β1）致视网膜色素上皮细胞纤维化的干预作用

目的　探讨转化生长因子-β1（transforming growth factor-beta1，TGF-β1）对人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞向成纤维细胞转化的影响，及活化素受体样激酶5（activated receptor kinase 5，ALK5）抑制剂（SB-431542）对这一影响的干预作用。方法　体外培养人RPE细胞，随机分为对照组、TGF-β1处理组、TGF-β1+SB-431542处理组、SB-431542处理组。对照组不做任何处理，其余三组分别用10 μg·L^-1 TGF-β1、10 μg·L^-1 TGF-β1+30 μmol·L^-1 SB-431542、30 μmol·L^-1 SB-431542处理细胞24 h。MTT法检测各组RPE细胞增殖率；划痕实验观察各组处理后0 h、12 h、24 h RPE细胞迁移情况；免疫荧光法检测各组细胞ALK5蛋白的分布和表达；Western blot法检测各组ALK5、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型胶原（collagen typeⅠ，ColⅠ）以及纤维粘连素（fibronectin，FN）蛋白的表达。结果　与对照组相比，TGF-β1作用于RPE细胞24 h后，可改变RPE细胞表型，使其呈成纤维细胞样外观，并明显促进RPE细胞增殖和迁移。10.0 g·L^-1 TGF-β1作用24 h后RPE细胞增殖率为对照组的（1.33±0.08）倍，30 μmol·L^-1 SB-431542作用24 h后RPE细胞增殖率为10.0 g·L^-1 TGF-β1处理组的（67.77±6.78）%。经TGF-β1作用24 h后RPE细胞内ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白的表达显著上调，分别是对照组的（3.69±0.37）倍、（1.76±0.05）倍、（2.58±0.18）倍、（1.86±0.11）倍、（1.74±0.08）倍；SB-431542可逆转TGF-β1诱导的ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白表达上调，分别是TGF-β1处理组的（67.73±5.15）%、（71.71±3.50）%、（79.87±0.05）%、（63.59±3.16）%、（83.07±2.31）%，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　TGF-β1可促进RPE细胞增殖、迁移，向成纤维细胞转化，并能显著上调RPE细胞内ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白的表达；SB-431542可通过抑制TGF-β1的作用而抑制RPE细胞的纤维化。     

miR-34a-5p对ARPE-19细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白表达及细胞增殖、迁移和上皮-间质转化的影响北大核心

目的探讨miR-34a-5p对ARPE-19细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白表达及细胞增殖、迁移和上皮-间质转化(EMT)的影响。方法将ARPE-19细胞分为4组:对照组、转化生长因子(TGF)-β1组、miR-34a-5p过表达组与复合干预组,对照组与TGF-β1组采用Lipofectamine 2000转染试剂转染对照模拟物,miR-34a-5p过表达组与复合干预组转染miR-34a-5p模拟物,培养24 h后采用无血清培养基饥饿培养12 h,TGF-β1组与miR-34a-5p过表达组均添加10 mg·L^(-1)的TGF-β1,复合干预组添加10 mg·L^(-1)的TGF-β1与10μmol·L^(-1)的TGF-β通路激活剂SRI-011381,各组细胞继续培养24 h,测定细胞增殖、迁移与EMT。采用Western blot检测细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白的表达水平,Ki67荧光染色检测细胞增殖情况,免疫荧光染色测定细胞EMT相关蛋白表达情况,划痕实验和Transwell实验测定细胞的迁移和侵袭能力。结果与对照组相比,TGF-β1组细胞内TGF-β受体(TGF-βR)1、TGF-βR2、磷酸化Smad2(p-Smad2)和p-Smad3的表达水平均增高(均为P<0.05)。与TGF-β1组相比,过表达miR-34a-5p能够明显逆转TGF-β1对TGF-β/Smad信号通路的激活作用。与miR-34a-5p过表达组相比,复合干预组细胞内TGF-β/Smad信号通路明显被激活。与TGF-β1组相比,miR-34a-5p过表达组细胞Ki67阳性率为(6.67±1.52)%,明显降低(P<0.05)。与miR-34a-5p过表达组相比,复合干预组细胞Ki67阳性率为(16.67±1.53)%,显著升高(P<0.05)。划痕实验和Transwell实验结果显示:与对照组相比,TGF-β1能够促进ARPE-19细胞迁移和侵袭。过表达miR-34a-5p能够明显抑制TGF-β1组ARPE-19细胞的迁移和侵袭能力。在复合干预组内,TGF-β通路激活剂SRI-011381能够明显逆转过表达miR-34a-5p对ARPE-19细胞迁移能力的抑制作用。免疫荧光染色结果显示:与对照组相比,TGF-β1能够明显提高ARPE-19细胞内α-SMA和纤维连接蛋白表达水平,并抑制钙黏蛋白E的表达。与TGF-β1组相比,过表达miR-34a-5p能够明显抑制ARPE-19细胞发生EMT。在复合干预组内,TGF-β通路激活剂SRI-011381能够缓解过表达miR-34a-5p对ARPE-19细胞EMT的抑制作用。结论miR-34a-5p通过靶向失活TGF-β/Smad信号通路抑制ARPE-19细胞的增殖、迁移与EMT。     

视网膜色素上皮细胞 LncRNA MEG3在不同葡萄糖浓度下的表达情况及对VEGF和 TGF-β1表达的影响

目的　探讨长链非编码RNA母系表达基因3（LncRNA MEG3）在不同浓度葡萄糖下表达情况及对血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响。 方法　按照不同浓度d-葡萄糖培养ARPE-19细胞,随机分为5 mmol·L^-1 d-葡萄糖组、15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组、30 mmol·L^-1d-葡萄糖组。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测各组ARPE-19细胞LncRNA MEG3、VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平。ARPE-19细胞转染PCDNA-MEG3及PCDNA-NC质粒,建立LncRNA MEG3过表达ARPE-19细胞及转染空质粒的ARPE-19细胞。以含30 mmol·L^-1d-葡萄糖的DMEM分别培养以下各组ARPE-19细胞:LncRNA MEG3过表达ARPE-19细胞(O组);转染空质粒的ARPE-19细胞（NC组）;加入PBS的正常ARPE-19细胞(G组);同时以含5 mmol·L^-1d-葡萄糖的DMEM培养正常ARPE-19细胞（C组）;以上各组细胞培养24 h后,采用RT-qPCR法及Western blot法检测各组ARPE-19细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白、TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白的相对表达水平。 结果　与5 mmol·L^-1 d-葡萄糖组比较,15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组和30 mmol·L^-1 d-葡萄糖组ARPE-19细胞LncRNA MEG3相对表达水平降低,VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组比较,30 mmol·L^-1 d-葡萄糖组ARPE-19细胞LncRNA MEG3相对表达水平降低,VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与G组和NC组比较,O组ARPE-19细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白、TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白相对表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论　高糖下调ARPE-19细胞LncRNA MEG3的表达,上调VEGF和 TGF-β1的表达。LncRNA MEG3过表达降低高糖诱导的VEGF和 TGF-β1表达的升高。LncRNA MEG3可能通过抑制VEGF和 TGF-β1的表达调节糖尿病视网膜病变的发展。     

藤黄酸通过CYLD/NF-κB信号通路抑制高糖环境下RPE细胞上皮-间充质转化的作用

目的　基于去泛素化酶圆柱瘤蛋白/核因子κB（CYLD/NF-κB）通路,研究藤黄酸（GA）对高糖环境下视网膜色素上皮(RPE)细胞上皮-间充质转化(EMT)的作用。方法　体外培养ARPE-19 细胞,高糖诱导,实验分为NC组（含5.5 mmol·L^-1葡萄糖）,HG组(含30 mmol·L^-1葡萄糖),HG+不同剂量GA组(2 μmol·L^-1、4 μmol·L^-1、8 μmol·L^-1 GA分别预处理RPE细胞1 h,加30 mmol·L^-1葡萄糖)。CCK-8检测各组RPE细胞增殖活力,免疫荧光染色检测RPE细胞中α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、去泛素化酶圆柱瘤蛋白(CYLD)表达;Western blot检测RPE细胞中α-SMA、CYLD、磷酸化核转录因子κB（p-NF-κB）蛋白表达。结果　与NC组相比,HG组RPE细胞出现明显增殖,RPE细胞中α-SMA、p-NF-κB蛋白表达均增加,CYLD蛋白表达减少（均为P<0.01）;与HG组相比,HG+不同剂量GA组RPE细胞增殖均明显受到抑制,RPE细胞中α-SMA、p-NF-κB蛋白表达均减少,CYLD表达均增加（均为P<0.01）,且均呈剂量依赖性。结论　GA可抑制高糖环境下RPE细胞EMT,其抑制作用与上调CYLD,抑制NF-κB活化有关。     

活性氧在贝伐单抗诱导视网膜色素上皮细胞上皮间质转化中的作用

目的　观察贝伐单抗（BEV）对人视网膜色素上皮（RPE）细胞氧化应激损伤和上皮间质转化（EMT）的影响,进一步探讨抑制活性氧（ROS）在EMT中的作用。方法　选取人ARPE-19细胞株,根据实验需要将ARPE-19细胞分为4组:空白对照组、BEV组、BEV+NAC组和BEV+DPI组,其中空白对照组细胞不进行任何干预,BEV组用0.25 g?L^-1 BEV处理细胞72 h,另外两组在 BEV处理细胞24 h后分别再用ROS抑制剂NAC和NADPH氧化酶抑制剂DPI处理细胞48 h。采用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色观察各组ARPE-19细胞内ROS和H₂O₂的生成堆积情况;细胞免疫荧光观察各组ARPE-19细胞中EMT标志物［紧密连接相关蛋白闭锁带蛋白-1（ZO-1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和纤维连接蛋白（FN）］的表达情况;再通过RT-PCR和Western blot检测各组细胞中EMT标志物的mRNA和蛋白的表达水平。结果　DCFH-DA染色观察发现,ARPE-19细胞加入BEV继续培养后,ROS和H₂O₂表达均明显上调（均为P＜0.05）。与空白对照组相比,BEV组EMT指标变化显著:上皮标志物ZO-1的表达降低,间质标志物α-SMA和FN的表达升高,两组间各指标相比差异均有统计学意义（均为P＜0.05）;与BEV组相比,BEV+NAC组和BEV+DPI组中各项指标mRNA表达变化显著,ZO-1上升至0.955±0.048、1.056±0.017,而α-SMA下降至0.982±0.165、1.058±0.165,此外FN表达（0.666±0.063、0.983±0.125）也显著降低,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。各种因子的蛋白表达变化趋势与其相应mRNA表达相一致,与单纯BEV组相比,ROS抑制剂NAC和NADPH氧化酶抑制剂DPI都显著改变了EMT标志物的表达,ZO-1蛋白相对表达量升高了0.195±0.010、0.770±0.175,而α-SMA下降了0.353±0.098、0.482±0.037,FN下降了0.528±0.161、0.612±0.134,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　ROS参与了BEV诱导的RPE细胞EMT,抑制ROS可减轻BEV诱导的人RPE细胞的 EMT程度。     

转化生长因子-β诱导视网膜色素上皮细胞增殖中NLRP3炎症小体的表达及意义

目的　探讨转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）刺激下Nod样受体蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体在视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）增殖中的表达变化及意义。方法　利用TGF-β刺激RPE细胞增殖模拟增生性玻璃体视网膜病变模型，随机分为空白对照组（Sham组）和TGF-β诱导RPE细胞增殖组（TGF-β组），TGF-β组再根据浓度（0.5 μg·L^-1、2.5 μg·L^-1、10.0 μg·L^-1、12.5 μg·L^-1）分组。利用MTT 微量酶比色法检测RPE细胞增殖情况；Western blot观察NLRP3蛋白的表达变化；利用标准ELISA试剂盒检测白细胞介素（interleukin，IL)-1β和 IL-18表达情况。结果　与Sham组比较，0.5 μg·L^-1 TGF-β组RPE细胞增殖不明显，差异无统计学意义（P>0.05），但NLRP3、IL-1β和 IL-18表达明显提高（均为P<0.01）；2.5 μg·L^-1、10.0 μg·L^-1和12.5 μg·L^-1TGF-β组RPE细胞增殖明显，NLRP3、IL-1β和 IL-18表达均提高（均为P<0.05）；与0.5 μg·L^-1 TGF-β组相比，2.5 μg·L^-1、10.0 μg·L^-1和12.5 μg·L^-1TGF-β组RPE细胞增殖显著增加，NLRP3、IL-1β和 IL-18表达均下降，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　不同浓度TGF-β诱导RPE细胞增殖中NLRP3炎症小体表达变化不同，两者可能相互调控影响RPE细胞增殖，在增生性玻璃体视网膜疾病发生发展中具有重要的作用。     

PDGF和TGF-β1对兔RPE细胞α-SMA表达及收缩功能的影响

目的 研究血小板源性生长因子(PDGF-AB)和转化生长因子(TGF-β1)对兔视网膜色素上皮(RPE)细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达和RPE细胞诱导的胶原收缩的影响。方法免疫荧光染色法分析PDGF-AB和TGF-β1对α-SMA表达的影响。体外胶原凝胶收缩实验用于证实两种生长因子对兔RP细胞收缩的刺激作用。结果 PDGF-AB和TGF-β1均可显著诱导兔RPE细胞α-SMA的表达，TGF-β1的作用显著强于PDGF-AB；两种生长因子对RPE细胞诱导的胶原收缩有着相同显著的刺激作用。结论 PDGF-AB和TGF-β1均可增强RPE细胞的收缩力量．但二者可能是通过不同的途径达到这一效果，还需要更多的研究来分析α-S1MA在纤维增殖疾病中的作用。     

阻断Rac1对转化生长因子-β诱导视网膜色素上皮细胞行为改变的作用研究

目的 观察转化生长因子β1(TGF-β1)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞间质样转分化(EMT)过程中Rac1在其细胞学行为改变中的作用.方法 人RPE-19细胞分为空白组、TGF-β1组、TGF-β1+NSC23766组、NSC23766组.所有实验于加入TGF-β1前2h给予NSC23766以封闭Rac1受体.免疫荧光、蛋白免疫印迹法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;细胞划痕、侵袭及凝胶收缩实验,观察NSC23766对细胞迁徙、侵袭、凝胶收缩作用.结果 TGF-β1组细胞中α-SMA荧光表达较空白组、TGF-β1+ NSC23766增强,差异有统计学意义(F=825.314,P=0.003);细胞划痕实验结果显示,TGF-β1组细胞间距小于TGF-β1+ NSC23766组,差异有统计学意义(P24h=0.04,P48h =0.001);与空白组细胞间距比较,差异无统计学差异(P=0.278).细胞侵袭实验结果显示,TGF-β1组穿过纤维膜的细胞数与空白组、TGF-β1+ NSC23766组、NSC23766组穿过纤维膜的细胞数比较,差异无统计学意义(F=0.371,P=0.055).凝胶收缩实验结果显示,TGF-β1组能明显增加细胞的促凝胶收缩能力,组间差异有统计学意义(F=40.473,P=0.014),TGF-β1组相对TGF-β1+ NSC23766组,差异有统计学意义(P=0.022).结论 Rac1在TGF-β1诱导RPE细胞凝胶收缩改变中发挥作用;NSC23766可通过调控Rac1活化抑制RPE细胞学行为的改变.     

自噬调节高浓度葡萄糖诱导的人晶状体上皮细胞上皮间质转化

目的:探究自噬水平变化对高糖诱导人晶状体上皮细胞上皮间质转化(EMT)的影响及其机制。方法:人晶状体上皮细胞(HLE-B3)分为正常对照组(NC组)和高糖处理组(HG组),分别用含5.5mmol/L葡萄糖的DMEM和添加了30mmol/L葡萄糖的上述DMEM培养12、24、48h,用Western blot检测上皮间质转化标志蛋白(E-cadherin、α-SMA)和自噬标志蛋白(LC3、Beclin 1和SQSTM1/p62)的表达变化,用划痕实验观察细胞的移行能力以明确高糖对晶状体上皮细胞自噬和EMT的影响。利用雷帕霉素调节自噬水平,将细胞分为正常对照组(NC组)、高糖处理组(HG组),高糖处理细胞的同时添加DMSO溶剂组(DMSO组)和添加200nmol/L雷帕霉素的雷帕霉素组(RAPA组),处理细胞24h,用Transwell实验观察细胞的移行能力,用Western blot检测EMT、自噬标志蛋白和TGF-β信号通路蛋白(TGF-β2、Smad2/3、p-Smad2/3、Snail)的表达。用细胞免疫荧光染色观察SQSTM1/p62与Smad2/3在细胞内的表达,免疫共沉淀方法检测细胞中SQSTM1/p62与Smad2/3之间的相互结合。结果:在高糖刺激后12、24、48h,HG组细胞E-cadherin、LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1蛋白表达逐渐降低(F=67.52、163、206,均P<0.0001),而α-SMA、SQSTM1/p62蛋白表达增加(F=53.37、302.1,均P<0.0001),细胞移行也较NC组增加(均P<0.001),提示高糖刺激后细胞发生EMT,而自噬水平降低;雷帕霉素处理后,与HG组和DMSO组相比,RAPA组LC3Ⅱ/Ⅰ和E-cadherin蛋白表达水平增加,α-SMA、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3及Snail蛋白表达降低(均P<0.05),TGF-β2表达无明显改变(均P>0.05),细胞移行被抑制(均P<0.001),提示雷帕霉素在提高自噬水平的同时下调了TGF-β信号通路分子的表达进而抑制了EMT。细胞免疫荧光染色结果显示SQSTM1/p62与Smad2/3在胞浆内存在共定位,免疫共沉淀实验证实了SQSTM1/p62与Smad2/3蛋白相互结合。结论:高糖可刺激HLE-B3细胞发生EMT,下调细胞的自噬水平;自噬通过SQSTM1/p62与Smad2/3相互作用,改变了TGF-β信号通路中Smad2/3的表达,实现对EMT的调节。     

丹参酮ⅡA对人角膜基质细胞纤维化的抑制作用

目的　研究丹参酮ⅡA （tanshinoneⅡA,TSN） 对转化生长因子β1 （transforming growth factor-β1,TGF-β1） 诱导的人角膜基质细胞 （human keratocyte,HK） 纤维化的作用,探索该药物是否具有防治角膜瘢痕的潜能。方法　采用胰蛋白酶消化培养HK,并传代至4-7代用于实验。通过TGF-β1诱导建立HK纤维化模型,并分别用5.0 μg·L^-1 TGF-β1和不同浓度的TSN联合给药方法对HK进行处理。采用Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）与Vimentin的表达,qPCR检测纤连蛋白 （fibronectin,FN） 和I型胶原（collgen I,COL I） mRNA的表达;利用细胞免疫荧光染色观察HK细胞形态的改变。结果　5.0 μg·L^-1 TGF-β1可以显著上调α-SMA与Vimentin蛋白的表达和胞外基质成分FN mRNA（2.238±0.227）、COL I mRNA（3.554±0.526）的表达。2.5 μmol·L^-1和5.0 μmol·L^-1 TSN均能抑制α-SMA蛋白的表达和FN mRNA（0.619±0.017、0.263±0.006）、COL I mRNA（0.631±0.011、0.275±0.081）的表达。5.0 μg·L^-1 TGF-β1诱导组HK形态呈长梭形,具有两极,细胞呈极性分布;5.0 μmol·L^-1 TSN联合5.0 μg·L^-1 TGF-β1培养HK形态同原始细胞形态,细胞呈三角形或星形。结论　TSN可抑制TGF-β1诱导的HK纤维化,具有抗角膜瘢痕的潜力。     

增生性玻璃体视网膜病变中细胞因子的作用

细胞因子与PVR形成密切相关。HGF通过自分泌或旁分泌方式作用于RPE和神经胶质细胞，导致RPE活化和胶质细胞迁移；通过活化磷脂酰肌醇3激酶促使神经胶质细胞产生血管内皮生长因子（VEGF）。PDGF-AA通过与含有口亚基PDGFR作用促进PVR形成，但表达PDGFβ受体的细胞不能诱导PVR发生。肌样成纤维细胞聚集是PVR中导致牵拉性视网膜脱离的重要因素，其α平滑肌肌动蛋白的表达依赖于TGF-β2RⅡ及TGF-β1在增生膜中的表达。IL-6是PVR形成的危险因素，是视网膜脱离术后PVR复发的重要预测指标。TNF-α可与RPE表面TNF受体作用并通过MAPK通路诱导RPE细胞高表达α1与α5型整合素，进而促进RPE在PDGF介导下的细胞转移。MCP-1可能在PVR早期起重要作用。     

TGF-β1对RPE细胞bcl-2/Fas mRNA和Caspase-3表达的影响

目的观察转化生长因子-β1（transforming grawthfactor-β1，TGF-β1）诱导人视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）凋亡的作用机制。方法使用逆转录多聚酶链反应检测不同浓度TGF-β1作用下的人RPE细胞中凋亡相关基因bel-2和Fas mRNA的表达。使用Western-Blot蛋白印迹法检测不同浓度TGF-β1处理过的PRE细胞中Caspase-3蛋白的表达。结果逆转录多聚酶链反应正示，随着TGF-β1岛浓度的增高，人RPE细胞中bcl-2mRNA表达降低，Fas mRNA的表达逐渐增高；Western-Blot结果显示。随着TGF-β1浓度的增高，Caspase-3蛋白表达逐渐增高。结论TGF-β1可上调RPE细胞表面Fas基因的表达，从而激活Caspase-3的活性而诱导RPE细胞凋亡，Caspase-3在RPE细胞凋亡过程中起着非常重要的作用。[眼科新进展2006；26（3）：194-197]     

Artesunate inhibits proliferation and migration of RPE cells and TGF-β2 mediated epithelial mesenchymal transition by suppressing PI3K/AKT pathway

AIM:To study the braking effectiveness of artesunate on transforming growth factor(TGF)-β2 mediated epithelial-mesenchymal transition(EMT)in retinal pigment epithelium(RPE)in vitro.METHODS:The fostered ARPE-19 cells were processed with artesunate alone or combined with the TGF-β2.The CCK-8 examination was utilized to test the cell propagation.Cell migration was detected by scratch as well as the Transwell examination.The EMT characters and activation of PI3K/Akt signal channel were estimated by Western blotting and immunofluorescence.The Western blotting was utilized in order to confirm the vitreous of controls as well as patients with proliferative vitreoretinopathy(PVR)were collected and the levels of PI3K,phospho-PI3K,Akt.RESULTS:Disposal of ARPE-19 cells with artesunate(50-150μmol/L)obviously suppressed their propagation and immigration,which dependent on the concentration and time.Artesunate suppressed the EMT which was induced by TGF-β2 in ARPE-19 cells through sustaining the expression of vimentin andα-SMA through the suppression of PI3K,phospho-PI3K,phospho-Akt and Akt.Levels of PI3K,phospho-PI3K,AKT and phospho-Akt was increased in the vitreous in PVR(P<0.05).CONCLUSION:Such findings indicate that PI3K/Akt signal channel is highly activated in vitreous of PVR.Artesuante is an operative depressor of the propagation,immigration and TGF-β2-mediated EMT of ARPE-19 cells by reduced the expression of PI3K/Akt channel.     

转化生长因子-β2诱导人Tenon囊成纤维细胞转化及其在瘢痕形成中的作用

背景 研究表明转化生长因子-β2(TGF-β2)能够促进瘢痕形成,但其在青光眼滤过术后局部瘢痕形成中的作用机制值得研究. 目的 探讨TGF-β2对人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)转化以及在滤过术后瘢痕形成中的作用.方法 在斜视手术中获取3例患者的Tenon囊组织,并用组织块培养法在含质量分数10％胎牛血清的DMEM中培养,培养的细胞贴壁后达到70％ ～ 80％亚融合状态时更换为无血清培养基饥饿培养24 h,然后分别加入质量浓度1、2、5、10、20 μg/L TGF-β2诱导HTFs 24 h,另用2μg/L或5μg/L TGF-β2诱导HTFs 6、24、48、72 h,阴性对照组培养基中不加TGF-β2.用Western blot法检测HTFs中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和pSmad2蛋白的表达,采用细胞免疫荧光技术检测α-SMA及纤维状肌动蛋白(F-actin)表达的定位,采用凝胶收缩实验检测培养细胞收缩力的变化.结果 不同质量浓度TGF-β2组HTFs中α-SMA表达的强度均明显强于阴性对照组,2μg/L、5μg/L TGF-β2作用24～48 h后HTFs中α-SMA表达强度达峰值,10 μg/L、20 μg/L TGF-β2组较2μg/L、5μg/L TGF-β2组α-SMA蛋白表达强度减弱.对照组HTFs中有少量α-SMA及F-actin表达,1、2、5μg/L TGF-β2组α-SMA及F-actin荧光表达明显增强,阳性细胞数明显增加,10 μg/L TGF-β2组α-SMA及F-actin荧光表达较低质量浓度组减弱.2μg/L TGF-β2作用后pSmad2表达强度明显强于PBS组和FBS组,在作用后30 min ～2 h表达较强,2h后开始出现下降.对照组HTFs收缩凝胶面积所占原面积的百分数为(78.00±3.13)％,1、2、5、10 μg/L TGF-β2组分别为(63.88±1.78)％、(20.69±0.65)％、(19.49±0.54)％、(16.24±0.84)％,HTFs收缩凝胶面积占原面积的百分数随着TGF-β2质量浓度的增加而明显增加(F组别=859.400,P=0.000).结论 TGF-β2可诱导成纤维细胞转分化,一定程度上其作用呈质量浓度依赖性和时间依赖性,且细胞收缩力随质量浓度的增加而增强,可能是青光眼滤过术后滤过通道建立失败的重要机制.     

增生性玻璃体视网膜病变中细胞因子的作用

细胞因子与PVR形成密切相关。HGF通过自分泌或旁分泌方式作用于RPE和神经胶质细胞,导致RPE活化和胶质细胞迁移;通过活化磷脂酰肌醇3激酶促使神经胶质细胞产生血管内皮生长因子(VEGF)。PDGF-AA通过与含有α亚基PDGFR作用促进PVR形成,但表达PDGFβ受体的细胞不能诱导PVR发生。肌样成纤维细胞聚集是PVR中导致牵拉性视网膜脱离的重要因素,其α平滑肌肌动蛋白的表达依赖于TGF-β2RⅡ及TGF-β1在增生膜中的表达。IL-6是PVR形成的危险因素,是视网膜脱离术后PVR复发的重要预测指标。TNF-α可与RPE表面TNF受体作用并通过MAPK通路诱导RPE细胞高表达α1与α5型整合素,进而促进RPE在PDGF介导下的细胞转移。MCP-1可能在PVR早期起重要作用。     

胰岛素对人RPE细胞增殖及转化生长因子-β2分泌的影响

目的:探讨胰岛素对RPE细胞增殖和分泌转化生长因子-β2(TGF-β2)的影响。方法:将不同浓度的胰岛素(0.1～10×103U/mL)加入培养基刺激ARPE-19细胞不同时间(0～48h)。采用MTS法检测RPE细胞的增殖情况;采用ELISA法检测各种处理情况下RPE细胞分泌TGF-β2的情况,Real-time PCR法检测TGF-β2mRNA的表达情况。结果:MTS结果显示,作用12h后,各实验组与对照组比较RPE细胞明显增殖(P<0.05)。ELISA结果表明胰岛素可明显促进RPE细胞分泌TGF-β2,并呈时间及剂量依赖性。Real-time PCR结果显示,胰岛素作用24h后,TGF-β2mRNA表达上调(P<0.01),且10×103U/mL胰岛素组TGF-β2mRNA表达明显高于0.1×103U/mL胰岛素组(P<0.01)。结论:RPE细胞是眼内近视信号因子TGF-β2的重要来源,胰岛素可以通过促进RPE细胞增殖并分泌TGF-β2进行信号传递,促进近视发生。     

N-乙酰半胱氨酸对TGF-β1诱导的ARPE-19细胞向肌成纤维细胞转分化的影响

背景 视网膜色素上皮(RPE)细胞转分化为肌成纤维细胞是增生性玻璃体视网膜病变发生和发展中的一个核心事件.N-乙酰半胱氨酸(NAC)能够通过抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的细胞内活性氧(ROS)的产生和MAPK蛋白的磷酸化来抑制多种细胞向肌成纤维细胞的转分化,但是NAC对TGF-β1诱导的人RPE细胞系ARPE-19细胞向肌成纤维细胞转分化的影响及其潜在的分子机制尚不清楚. 目的 研究NAC对TGF-β1诱导的ARPE-19细胞向肌成纤维细胞转分化的影响及其潜在的分子机制.方法 体外培养人ARPE-19细胞并分为对照组、TGF-β1处理组、NAC干预组和NAC单独处理组,对照组不做处理,其他3个组分别使用10 ng/ml TGF-β1、10 ng/ml TGF-β1 +5 mmol/L NAC和5 mmol/L NAC处理细胞48 h,相差显微镜下观察细胞的形态学改变.采用实时荧光定量PCR、Western blot、免疫荧光及ELISA法检测转分化标志基因α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维结合蛋白及Ⅰ型胶原的表达情况.使用非荧光探针DCFH-DA通过流式细胞仪检测在TGF-β1处理后1h,细胞内ROS的产生情况及NAC对细胞内ROS产生的影响.采用Western blot法检测各组细胞内p38MAPK、ERK1/2及SAPK/JNK蛋白磷酸化的影响.采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测不同浓度NAC对ARPE-19细胞生存的影响. 结果 实时荧光定量PCR、Western blot及ELISA实验结果表明,与对照组相比,TGF-β1处理组α-SMA、纤维结合蛋白和Ⅰ型胶原mRNA表达水平均上调,分别是对照组的(2.15±0.29)、(9.54±1.08)和(25.78±0.66)倍,蛋白表达水平分别是对照组的(8.49±0.32)、(2.53±0.69)和(4.45±1.05)倍,差异均有统计学意义(均P＜0.05).NAC干预组α-SMA、纤维结合蛋白和Ⅰ型胶原mRNA的表达水平分别是TGF-β1处理组的(66.70±12.57)％、(66.11±8.35)％和(33.19±6.90)％,蛋白表达水平分别是TGF-β1处理组的(52.30±4.83)％、(55.03±2.58)％和(56.08±3.65)％,差异均有统计学意义(均P＜0.05).流式细胞仪分析结果显示,TGF-β1处理组细胞内ROS的产生水平较对照组增加,是对照组的(2.12±0.20)倍,NAC干预组细胞内ROS水平是TGF-β1处理组的(57.41±9.45)％,差异均有统计学意义(均P＜0.01).Western blot结果显示,与对照组相比,TGF-β1处理组p38MAPK、SAPK/JNK及ERK1/2蛋白磷酸化水平均上调,分别是对照组的(9.18±1.00)、(4.87±0.81)和(4.20±0.69)倍,差异均有统计学意义(均P＜0.05).使用NAC干预处理后,p38MAPK、SAPK/JNK及ERK1/2蛋白磷酸化水平分别是TGF-β1处理组的(48.16±14.82)％、(67.90±2.90)％和(74.52±4.00)％,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 NAC可能通过抑制TGF-β1诱导的ROS的产生及p38MAPK、SAPK/JNK及ERK1/2蛋白的磷酸化进而抑制ARPE-19细胞向肌成纤维细胞转分化.     

LRG1 promotes epithelial-mesenchymal transition of retinal pigment epithelium cells by activating NOX4

AIM:To investigate the effect of leucine-rich-alpha-2-glycoprotein 1(LRG1)on epithelial-mesenchymal transition(EMT)in retinal pigment epithelium(RPE)cells,and to explore the role of NADPH oxidase 4(NOX4).METHODS:RPE cells(ARPE-19 cell line)were treated with transforming growth factor-β1(TGF-β1)to induce EMT.Changes of the m RNA and protein expression levels of LRG1 were tested in the TGF-β1 treated cells.The recombinant human LRG1 protein(r LRG1)and si RNA of LRG1 were used to establish accumulation of exogenous LRG1 model and the down-regulation of LRG1 model in ARPE-19 cells respectively,and to detect EMT-related markers including fibronectin,α-smooth muscle actin(α-SMA)and zonula occludens-1(ZO-1).The m RNA and protein expression level of NOX4 were measured according to the above treatments.VAS2870 was used as a NOX4 inhibitor in r LRG1-treated cells.EMT-related markers were detected to verify the effect of NOX4 in the process of EMT.RESULTS:TGF-β1 promoted the expression of LRG1 at both the m RNA and protein levels during the process of EMT which showed the up-regulation of fibronectin andα-SMA,as well as the down-regulation of ZO-1.Furthermore,the r LRG1 promoted EMT of ARPE-19 cells,which manifested high levels of fibronectin andα-SMA and low level of ZO-1,whereas knockdown of LRG1 prevented EMT by decreasing the expressions of fibronectin andα-SMA and increasing the expression of ZO-1 in ARPE-19 cells.Besides,the r LRG1 activated and LRG1 si RNA suppressed NOX4 expression.EMT was inhibited when VAS2870 was used in the r LRG1-treated cells.CONCLUSION:These results for the first time demonstrate that LRG1 promotes EMT of RPE cells by activating NOX4,which may provide a novel direction to explore the mechanisms of subretinal fibrosis.     

K115对TGF-β1诱导的人Tenon 囊成纤维细胞增殖和迁移的影响及其机制

目的　探讨K115对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人Tenon 囊成纤维细胞增殖和迁移的影响及其机制。方法　人Tenon 囊成纤维细胞取自于河北省人民医院眼科行青光眼手术的患者。采用CCK-8实验检测K115对人Tenon 囊成纤维细胞增殖的影响,筛选出TGF-β1对细胞增殖最佳作用浓度为5.0 μg·L^-1,最佳作用时间为24 h;K115对细胞增殖起始作用浓度为5.0 μmol·L^-1,最佳作用浓度为10.0 μmol·L^-1。依据这两个浓度进行分组,分别是对照组（不加TGF-β1与K115）,TGF-β1组（加5.0 μg·L^-1 TGF-β1）,TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组（加5.0 μg·L^-1TGF-β1和5.0 μmol·L^-1的K115）,TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组（加5.0 μg·L^-1 TGF-β1和10.0 μmol·L^-1 的K115）。采用Transwell 实验检测K115对人Tenon 囊成纤维细胞迁移的影响;免疫荧光法测定人Tenon 囊成纤维细胞中α-SMA蛋白的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡情况。对实验所得各指标进行统计学分析。结果　本研究细胞培养状态良好,6～8周可见人Tenon 囊成纤维细胞铺满培养瓶瓶底。用CCK-8 试剂盒检测各组细胞增殖情况结果显示,对照组、TGF-β1组、TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组、TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组光密度值分别为0.977±0.042、1.306±0.059、0.862±0.035、0.558±0.042,TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组、TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组光密度值均小于TGF-β1组 (均为P<0.05),并且呈现浓度依赖性减小,K115浓度越大细胞增殖减少幅度越大。Transwell 实验结果显示,对照组、TGF-β1组、TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组、TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组迁移细胞数分别为（38.67±3.06）个、（81.00±4.00）个、（44.33±3.21）个、（23.67±2.52）个;TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组与TGF-β1组比较,迁移细胞数降低,差异有统计学意义（P<0.05）;TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组与对照组及TGF-β1组比较,迁移细胞数均明显降低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。各组细胞内α-SMA蛋白免疫荧光染色结果显示,对照组人Tenon 囊成纤维细胞胞浆内可见散在分布的绿色荧光物质,TGF-β1处理后24 h（TGF-β1组）,胞浆内绿色丝状荧光物质明显增加,荧光强度差异有统计学意义（P<0.05）;与TGF-β1组比较,TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组和 TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组细胞胞浆内的荧光强度呈浓度依赖性减弱,K115浓度越高荧光强度减弱越明显(均为P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,对照组细胞凋亡率为（2.400±0.346）%,TGF-β1组为（0.900±0.173）%,TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组为（1.333±0.252）%,TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组为（1.067±0.058）%;TGF-β1组的细胞凋亡率较对照组降低（P<0.05）; TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组和TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组的细胞凋亡率均较对照组降低（均为P<0.05）,而与TGF-β1组比较,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　K115对TGF-β1诱导的人Tenon 囊成纤维细胞增殖和迁移有明确的抑制作用,其作用机制可能与K115抑制了TGF-β1诱导的细胞内α-SMA的表达进而调控了细胞活化有关。