酸性普鲁兰酶显著提升淀粉酶法制备葡萄糖的效率

长野芽胞杆菌普鲁兰酶(PulA)是我国实现规模化生产的淀粉脱支酶,但因其酶学属性与现有葡糖淀粉酶的淀粉糖化pH的不一致性,影响到淀粉制葡萄糖的转化率。该文研究了PulA酸性突变体LoPulA的酶学性质和其在淀粉制葡萄糖中的应用价值,结果显示,LoPulA在pH 4.5和60℃下表现出最高酶活力,在pH 4.3下的酶活力是其最高酶活力的96.40%,此酶活性特征与葡糖淀粉酶的最适作用条件十分吻合。使用突变体LoPulA与葡糖淀粉酶一起进行淀粉制糖试验,结果显示,经LoPulA与葡糖淀粉酶协同作用后,淀粉糖液的葡萄糖当量(dextrose equivalent, DE值)最高可达到96.66%,较PulA和葡糖淀粉酶协同作用后的糖液DX值提高了1.40%,显示普鲁兰酶突变体LoPulA在淀粉制葡萄糖中具有重大应用潜力。     

多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了使新普鲁兰酶基因在大肠杆菌中表达并实现高密度发酵生产,采用PCR方法从多粘类芽孢杆菌基因组DNA中扩增出新普鲁兰酶基因Npu,测序结果表明Npu基因全长2106 bp,编码515个氨基酸,与其他多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因序相似性高达99%。将Npu基因连接到质粒PMD18T上,构建了PMD18T-Npu vecter重组载体。将该重组载体转化到大肠杆菌BL21中,该酶基因在大肠杆菌细胞中获得活性表达,并能将酶蛋白分泌到胞外。重组菌株BL21 PGEX 4T-1-Npu具有较好的遗传稳定性,连续传代培养10代,菌株所产酶总酶活性仍保持在715 U;纯化后的酶液于25 ℃保存6个月酶活性仍保持在5427 U,于4 ℃保存12个月酶活性仍保持在5390.5 U。这是首次对来源于类芽孢杆菌属(paenibacillus)的普鲁兰酶进行报道,由于Npu具有较好的水解淀粉支链的能力,因此其在淀粉加工业以及洗涤业上应用前景良好。     

嗜冷普鲁兰酶产生菌NX-1的筛选及产酶条件优化

从南极海泥样品中分离得到一株产嗜冷普鲁兰酶的假交替单胞菌菌株（Pseudoalteromonas sp.）NX-1。以菌株NX-1为研究对象,对菌株NX-1产嗜冷普鲁兰酶的酶学性质进行了初步研究,并通过单因素试验和正交试验对其产嗜冷普鲁兰酶的最佳培养条件进行研究。结果显示,菌株NX-1所产嗜冷普鲁兰酶的最适作用温度为20 ℃,最适作用pH值为7.0,在最适条件下,酶的半衰期约为120 min;菌株NX-1的最适产酶条件为：培养温度20 ℃、接种量1%、培养基各组分含量分别为蔗糖15 g/L、蛋白胨15 g/L、CaCl2 0.5 g/L、Na2HPO4 6 g/L。优化后菌株产酶可达25.172 U/mL,相比优化前提高25.1%。     

用普鲁兰酶改进淀粉膜质量的研究

普鲁兰酶可使淀粉中的支链淀粉脱支而形成直链淀粉,从而提高淀粉膜的成膜性能及强度。本文通过正交试验L16(45)研究了普鲁兰酶对玉米淀粉脱支时pH、时间、温度及酶浓度等参数对淀粉膜抗张强度的影响,得到了实验范围内的最佳工艺条件。      

耐热普鲁兰酶CBM68结构域中关键位点对其酶学性质的影响

通过对Anoxybacillus sp.LM18-11来源的耐热普鲁兰酶(Pul A)与麦芽三糖共结晶的晶体结构分析,在新命名的底物结合域CBM68中预测出4个与底物结合有关的氨基酸位点(Y14、D16、K62和R96),分别将4个氨基酸位点突变为丙氨酸,得到突变体Pul A~(Y14A)、Pul A~(D16A)、Pul A~(K62A)和Pul A~(R96A)。其中,突变酶Pul A~(Y14A)和Pul A~(R96A)的底物结合力及催化效率与野生酶Pul A相比均有明显降低,其K_m值分别比Pul A提高了4.2倍和2.5倍,k_(cat)/K_m分别为Pul A的29%和37%。同时,Pul A~(Y14A)和Pul A~(R96A)的最适作用温度均降低了10℃,Pul A~(R96A)的最适作用p H也降低了0.5个单位。说明Y14和R96是CBM68结构域中的关键氨基酸位点,这两个位点的发现为进一步探究CBM68结构域的作用机制奠定了基础。     

嗜热脂肪土芽孢杆菌普鲁兰酶基因的异源表达及重组酶性质

用PCR方法扩增得到嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)XQ3506的普鲁兰酶编码基因Gs P,在大肠杆菌中进行异源表达。在没有外源信号肽的条件下,重组酶部分分泌到周质中,少量分泌到培养液中。重组酶表观分子量约为81 k Da,纯酶比活力为38.2 U/mg。重组酶最适温度为60℃,能短时耐受70℃高温;重组酶最适pH6.5,在pH5.5~7.5的范围内具有较好的稳定性;重组酶Km值为0.086μmol/L,Vmax为0.083μmol/min;K+和Mg~(2+)对重组酶有激活作用,而Ca~(2+)则有抑制作用。重组酶水解普鲁兰糖产物为单一麦芽三糖,对直链淀粉未发现降解作用,是一种I型普鲁兰酶。重组酶Gs P在直链淀粉、抗性淀粉生产和粉丝酶法生产工艺中有一定的应用前景。     

板粟深加工中淀粉的酶水解研究

试验对比了BAA中温α-淀粉酶和耐高温α-(Termamyl 120L,S型)对板栗浆液中淀粉的液化效果，选择使用耐高温α-淀粉酶(Termamyl 1120L，S型)为液化板栗淀粉的作用酶，单因素研究确定了液化工艺参数为：料水比1：5，液化温度90℃，pH6．0，酶用量7U／g果肉，液化时间60min。然后采用Novozym^TMAG糖化酶对液化后的板粟淀粉进行糖化，以淀粉水解度(DE值)和糖化液中还原糖的含量(g／100m1)为指标，正交试验表明，在糖化温度60℃，pH4．5，Novozym^TMAG使用量为80U／g果肉的条件下糖化90min，可使水解度(DE值)和糖化液中还原糖含量(g／100m1)分别达到48．9％和4．52g／100ml。     

嗜冷普鲁兰酶制备玉米抗性淀粉工艺优化及其表征

以玉米淀粉为原料,采用嗜冷普鲁兰酶脱支处理和压热处理相结合的方式制备玉米抗性淀粉,考察了玉米淀粉乳质量分数、耐高温α-淀粉酶添加量、嗜冷普鲁兰酶添加量、嗜冷普鲁兰酶作用时间对抗性淀粉得率的影响,采用正交试验对压热-酶解法制备玉米抗性淀粉的工艺参数进行了优化。采用扫描电子显微镜、X-射线衍射和差示扫描量热仪对玉米抗性淀粉形貌、晶体结构、热特性进行了观察与分析。结果表明,制备玉米抗性淀粉的最佳工艺条件为：玉米淀粉乳质量分数18%、耐高温α-淀粉酶添加量7 U/g、嗜冷普鲁兰酶添加量10 U/g、嗜冷普鲁兰酶作用时间9 h。在最佳条件下,玉米抗性淀粉得率为16.84%。玉米淀粉经复合酶法处理后,抗性淀粉形成了致密的层状晶体结构,表面形态结构呈现出不同于玉米原淀粉A型晶体结构的V型晶体结构;玉米抗性淀粉的起始温度、峰值温度、终止温度和相变焓值分别为117.07、140.69、153.03 ℃和1 858.12 J/g,均高于玉米原淀粉。     

用普鲁兰酶改进玉米淀粉基复合膜性能的研究

以玉米淀粉为原料,选用甘油为增塑剂,羧甲基纤维素钠与海藻酸钠复合为增强剂,采用延流法制备玉米淀粉基复合膜。研究增塑剂的种类、用量,增强剂的种类、用量,烘干温度,延流体积等对复合膜性能的影响。普鲁兰酶可使淀粉中的支链淀粉脱支而形成直链淀粉,从而提高淀粉膜的性能。利用正交实验法,以玉米淀粉基复合膜的抗拉强度为指标,研究得出普鲁兰酶对复合玉米淀粉脱支作用时的最佳工艺条件为:酶用量0.8ASPU/g,pH4.5,时间4h,温度60℃。     

用普鲁兰酶改进玉米淀粉基复合膜性能的研究

以玉米淀粉为原料,选用甘油为增塑剂,羧甲基纤维素钠与海藻酸钠复合为增强剂,采用延流法制备玉米淀粉基复合膜。研究增塑剂的种类、用量,增强剂的种类、用量,烘干温度,延流体积等对复合膜性能的影响。普鲁兰酶可使淀粉中的支链淀粉脱支而形成直链淀粉,从而提高淀粉膜的性能。利用正交实验法,以玉米淀粉基复合膜的抗拉强度为指标,研究得出普鲁兰酶对复合玉米淀粉脱支作用时的最佳工艺条件为:酶用量0.8ASPU/g,pH4.5,时间4h,温度60℃。      

解淀粉芽孢杆菌I型耐热普鲁兰酶的纯化及酶特性分析

对来源于菌株解淀粉芽孢杆菌HxP-21的普鲁兰酶（命名为PulBa）分离纯化,研究其酶学特性,为普鲁兰酶在淀粉加工中的应用提供理论基础。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和葡聚糖凝胶过滤层析从菌株HxP-21发酵液中分离纯化出一种新型的普鲁兰酶。酶的纯化倍数20.8,回收率53.2%,比活力176.5 U/mg。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得PulBa达到电泳纯,分子质量51.2 kDa。PulBa在45～70 ℃和pH 3～6范围内具有较高酶活力,最适反应温度55 ℃、pH 4.5。PulBa有良好的pH值稳定性和热稳定性,40～70 ℃孵育120 min保留最初活性的80%以上;pH 3～7范围内具有很高的稳定性,孵育6 h后仍保留60 U/mL以上活性。PulBa对各种金属离子和化学试剂表现出不同的敏感性,Mg2＋和Ca2＋能够显著增强酶活力。PulBa最适作用底物为普鲁兰糖,对马铃薯支链淀粉、玉米支链淀粉、可溶性淀粉和糖原也有一定水解活性,但对α-环糊精和β-环糊精和直链淀粉无活性。以普鲁兰糖为底物PulBa的Km和Vmax值分别为1.34 mg/mL和24.6 μmol/（min·mg）。研究表明PulBa是典型的I型普鲁兰酶。薄层层析进一步证明,PulBa专一性水解支链淀粉α-1,6-糖苷键,产生麦芽三糖。本研究确定了一种新型的普鲁兰酶,该酶在高热稳定性和酸性环境下具有高活性,在淀粉加工等生物技术产业中有较好的应用潜力。     

电场处理对普鲁兰酶水解糯米淀粉的影响

目的：探明电场处理对普鲁兰酶水解糯米淀粉的强化作用机理。方法：测定不同强度电场作用下普鲁兰酶水解糯米淀粉的效率,并利用扫描电子显微镜、X射线衍射仪、差示扫描量热仪和快速黏度分析仪表征酶解产物的结构和热性质变化。结果：强度≤2.5 V/cm的电场处理可提高普鲁兰酶活力、促进糯米淀粉的水解,并且水解产物表面出现裂痕和孔洞、相对结晶度增加、起始糊化温度(To)增加、淀粉糊黏度降低;强度≥5 V/cm的电场处理可引起普鲁兰酶的部分失活、糯米淀粉水解效率降低、相对结晶度和淀粉糊黏度等降低。结论：在当前试验条件下,电场处理对普鲁兰酶水解糯米淀粉的强化作用主要影响普鲁兰酶活性,而对糯米淀粉结构无显著影响。     

一种密码子优化的酸性普鲁兰酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母密码子偏好性对来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶基因进行优化并构建在细胞内表达普鲁兰酶的重组毕赤酵母。优化后普鲁兰酶编码基因Bd P4在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达水平平均比优化前的普鲁兰酶基因Bd P提高4倍以上。筛选到1株表达水平较高的重组菌Pichia pastoris GS115/p PIC9K-Bd P4 WB54。在5 L发酵罐获得了初步优化的发酵条件:发酵液p H 4.5,在菌体量达到87 g/L时开始甲醇流加,采用溶氧(DO)恒定策略控制甲醇流加,DO控制在25%的水平,甲醇流加速率为9.9 m L/(L·h),搅拌转速控制在最大值800 r/min,通风量2 V/(v·m)。在优化条件下重组菌发酵酶活在2 000 U/m L以上。重组酶最适p H为4.0,最适作用温度50℃,在50和55℃下酶活半衰期分别为32和18 h。     

测定烟叶糖苷配基香味成分的酶水解条件优化研究

采用SDE/GC-MS法对源于杏仁的糖苷酶水解烟叶糖苷配基进行了分离和测定.确定测定烟叶糖苷配基香味成分的酶最佳水解条件为:温度38℃,时间48 h,料液比400 mL/30g烟叶,pH=5.0,酶添加量40 mg.在此条件下,烟叶香味成分萃取量可达179.06×10-4%.     

嵌合突变嗜酸普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶结构域B对酶学性质及功能的影响

为考察嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)普鲁兰酶结构域B对热稳定性及其他酶学特性和功能的影响,采用嵌合蛋白技术将B.acidopullulyticus普鲁兰酶的结构域B置换为Geobacillus thermoleovorans普鲁兰酶结构域B。嵌合突变体在60℃下的半衰期由34.9 min提高至168.4 min,解折叠一半时的温度由65℃提高至72℃,嵌合突变体较野生型具有更加优良的动力学稳定性和热动力学稳定性。结构域B置换后,最适pH碱向偏移至pH6.5,最适温度提高至70℃。比酶活及底物特异性实验结果显示,嵌合突变削弱了酶分子与普鲁兰多糖的结合,转而有利于与糊精及可溶性淀粉的结合。淀粉糖化结果显示,嵌合突变不影响突变体的实际应用性能。上述结果表明,B.acidopullulyticus普鲁兰酶结构域B对酶蛋白酶学性质影响显著,可通过同源置换构建适合于不同淀粉糖化工艺的突变体。     

红曲黄酒来源芽孢杆菌普鲁兰酶基因克隆和生物信息学分析

红曲黄酒酿造原料为大米,淀粉质量分数在70%以上,微生物来源淀粉酶系对淀粉的水解至关重要,影响甚至决定红曲黄酒酿造的原料转化过程和产品品质。从酒曲中分离具有淀粉水解能力的芽孢杆菌2?株,编号BHQ03和BHQ06,进行分子生物学鉴定并分别从2?株菌中克隆获得pulL1和pulL2,pulL3和pulL4共4?个I型普鲁兰酶基因,其中基因pulL1和pulL3均编码713?个氨基酸,序列相似度96.31%,基因pulL2和pulL4均编码852?个氨基酸,序列相似度99.77%。对基因pulL1和pulL2编码蛋白PulL1和PulL2进一步分析发现,二者均属于G13家族,具有4?段特征性保守区域。PulL2的N-端含有32 个氨基酸残基的信号肽序列,且催化活性位点存在突变（D407G）。结合文献研究和三维结构模拟,分析普鲁兰酶的具体催化过程。上述研究为科学解析红曲黄酒酿造的淀粉水解过程提供参考。     

酶水解-连续流动法测定烟草中的淀粉含量

建立了一种酶水解-连续流动法测定烟草中淀粉含量的方法,将样品先用85%乙醇去除水溶性糖,沸水浴加热使淀粉糊化,加入强碱破坏淀粉的结构,然后在淀粉葡萄糖苷酶(AGS)的作用下,淀粉将在pH=4.6的条件下水解生成葡萄糖,生成的葡萄糖使用连续流动法测定含量,推算出淀粉含量。方法回收率为96.6%,变异系数为1.52%~4.08%,说明该方法较为稳定、准确。比较了酶水解-连续流动法、酶水解法(ISO方法)、酸水解法和碘显色法测定烟草中淀粉含量的差异,并使用酶水解-连续流动法测定了国内外18个烟草样品中淀粉的含量。      

酶水解-连续流动法测定烟草中的淀粉含量

建立了酶水解-连续流动法测定淀粉含量的方法,即先用5%乙酸水溶液除去烟草样品中的可溶性糖后,再经淀粉酶酶水解,然后用连续流动法测定样品中的淀粉含量。该法的回收率大于93%,RSD=4.37%,并用该法测定了22种烤烟烟叶和8种国产烤烟型卷烟的淀粉含量。      

小米淀粉水解和改性技术的研究进展

综述了蛋白质、多酚、脂质、纤维以及淀粉特性对小米淀粉水解影响的研究进展,并概括了醚化、酯化、交联、酸水解、氧化、酶解、热湿化、超高压等改性技术的研究现状,以期为小米淀粉在食品工业中的应用提供参考依据。