供体细胞对猪体细胞克隆胚胎早期发育的影响

以中国农业大学实验用小型猪香猪胎儿成纤维细胞、成年耳成纤维细胞和颗粒细胞3种细胞系为供体细胞进行核移植。比较了血清饥饿法和接触抑制法处理胎儿成纤维细胞诱导进入G0／G1期的效率，发现二者差异不显著（P〉0．05），血清饥饿2d和4d差异不明显，同样接触抑制2d和4d差异也不显著（P〉0．05）。系统研究了影响克隆胚胎发育的供体因素：血清饥饿与否、细胞形态、细胞类型及个体差异等，结果表明：血清饥饿处理对克隆胚的早期发育没有明显的促进作用；圆形光滑细胞有利于细胞融合，对早期发育无显著影响（P〉0．05）；不同个体、不同类型的供体细胞对克隆胚囊胚发育率有一定的影响。     

不同体细胞类型和基因转染方式对绵羊克隆胚胎体外发育的影响

首先获得绵羊胎儿成纤维细胞、成年耳组织成纤维细胞及前脂肪细胞,用脂质体介导法、BTX电转法及Nucleofector核转法对上述细胞系转染绿色荧光蛋白(gfp)基因,并对转染效率进行比较,最后探讨3种转gfp基因细胞对绵羊转基克隆胚发育的影响。结果:核转法的转基因效率最高,3种细胞的转基因效率分别为86%,87%和90%,显著高于BTX电转法和脂质体法基因转染效率;脂质体转染效率显著低于BTX电转效率(P<0.05)。而对同一种转染方法而言,基因转染效率在3种细胞间差异均不显著(P>0.05)。在以上述3种转基因细胞为核供体的转基因克隆试验中,胚胎融合率、卵裂率均无显著性差异(P>0.05),胎儿成纤维细胞组的囊胚率显著高于前脂肪细胞组(P<0.05),但耳组织成纤维细胞组与胎儿成纤维细胞、前脂肪细胞间差异均不显著(P>0.05)。结果表明核转法基因转染效率最高,胎儿成纤维细胞最适合于胚胎克隆研究。     

猪体细胞克隆胚胎体外发育过程中的凋亡规律

本试验旨在研究比较猪体细胞克隆胚胎体外发育与凋亡变化规律,探讨其体外发育潜能与细胞凋亡间的关系。将体外成熟培养获得的猪MⅡ期卵母细胞随机分为2组,分别进行体细胞核移植(SNCT)与体外受精(IVF)处理,采用彗星试验(Comet assay)和Real-time RT-PCR技术对体外发育过程中各时期胚胎的细胞凋亡事件及抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达水平进行研究。结果表明,两组在卵裂率上无显著差异(77.6%vs 80.3%,P0.05),在囊胚发育率上,SCNT组胚胎明显低于IVF组,但无统计学差异(18.9%vs 24.5%,P0.05);随着胚胎发育,SCNT与IVF组胚胎的凋亡率均呈现不断增加的趋势,Bcl-2 mRNA表达量则逐渐下降;到16-细胞以后,SCNT组胚胎的凋亡率均显著高于IVF组,同时Bcl-2 mRNA表达量均显著低于IVF组(P0.05)。本试验结果表明,猪克隆胚胎生产效率低下可能与胚胎发育过程中的细胞凋亡有关。     

氨基酸和半胱胺对绵羊胚胎体外发育的影响

将从绵羊卵巢采集的卵母细胞成熟培养22~24h;成熟卵母细胞去除颗粒细胞,选择排出第一极体的卵母细胞,用5μmol/L A23187(5min)联合2mmol/L 6-DMAP(4h)进行孤雌激活;激活后的卵母细胞在培养液中进行培养。研究氨基酸和半胱胺对绵羊胚胎早期体外发育的影响。结果显示:(1)氨基酸能促进胚胎体外发育,0~24h培养添加抑制卵母细胞的卵裂,24h后培养添加比全过程培养添加更能促进胚胎体外发育;(2)24~72h培养添加必需氨基酸(EAA),能促进胚胎体外发育;(3)半胱胺添加量0~100μmol/L,随浓度增高各项发育指标呈增高趋势,添加100~200μmol/L,随浓度增高各项发育指标呈下降趋势。     

氨基酸和半胱胺对绵羊胚胎体外发育的影响

将从绵羊卵巢采集的卵母细胞成熟培养22-24h;成熟卵母细胞去除颗粒细胞,选择排出第一极体的卵母细胞,用5μmol／LA23187（5min）联合2mmol／L 6-DMAP（4h）进行孤雌激活;激活后的卵母细胞在培养液中进行培养。研究氨基酸和半胱胺对绵羊胚胎早期体外发育的影响。结果显示：（1）氨基酸能促进胚胎体外发育,0-24h培养添加抑制卵母细胞的卵裂,24h后培养添加比全过程培养添加更能促进胚胎体外发育;（2）24～72h培养添加必需氨基酸（EAA）,能促进胚胎体外发育;（3）半胱胺添加量0～100μmol／L,随浓度增高各项发育指标呈增高趋势,添加100～200μmol／L,随浓度增高各项发育指标呈下降趋势。     

胚胎培养液中能量底物对猪体细胞克隆胚胎体外培养的影响

如何根据猪胚胎发育的不同阶段合理使用不同成分的培养液,建立高效的体细胞克隆胚胎体外培养体系。本研究把所获得的猪体细胞克隆胚胎用不同的培养液培养,比较体外囊胚发育力和囊胚细胞数。结果表明:PZM-3比NCSU-23更适用于克隆胚胎的培养;培养前4d使用PZM-3,后2d更换含有葡萄糖的NCSU-23,可以提高胚胎的囊胚细胞数。说明胚胎在不同发育阶段对能量底物的需求不同,合理利用可以有效提高胚胎发育力。     

供体细胞和去核卵母细胞的不同预激活对体细胞核移植胚胎体外发育的影响

研究用细胞质内注射法构建重组胚，比较了离子霉素和乙醇预激活供体细胞和去核卵母细胞对重组胚卵裂和体外发育的影响。结果表明：与未经处理的对照组相比，离子霉素预激活供体细胞对重组胚的卵裂率和囊胚发育率有所提高；而供体细胞和去核卵母细胞同时用离子霉素预激活，重组胚的卵裂率无明显提高，囊胚发育率下降；用离子霉素或乙醇预激活去核卵母细胞，对重组胚的卵裂和发育无明显影响。     

PLCγ1基因对绵羊早期胚胎体外发育的影响

旨在探究磷脂酶Cγ1（phospholipase Cgamma 1,PLCγ1）基因对绵羊早期胚胎体外发育的影响,为揭示PLCγ1基因在早期胚胎发育过程中的作用机制奠定基础。本研究选取包裹3层以上颗粒细胞的绵羊卵母细胞为试验材料,体外培养成熟后将其分为两组,利用显微注射技术将PLCγ1基因导入MⅡ期（减数第二次分裂中期）卵母细胞（n=127）中为试验组,以显微注射空载体pcDNA3.1-EGFP作为对照组（n=120）,经48 h后统计其卵裂率;并利用Ca²⁺探针Rhod 2-AM监测MⅡ卵母细胞和显微注射后16、48、72、96、120 h时各时期卵母细胞以及早期胚胎内Ca²⁺波动。结果显示,PLCγ1基因显微注射后卵母细胞被激活,卵裂率为（（19.67±0.2）%,P<0.01）,桑椹胚发育率为（（9.00±0.17）%,P<0.05）;PLCγ1基因注射后,卵母细胞和早期胚胎不同发育时期有Ca²⁺浓度变化,可观察发现Ca²⁺主要分布在胞质中且注射48 h时可达到峰值（P<0.01）。结果表明,PLCγ1基因可以引起绵羊卵母细胞发育过程中发生Ca²⁺振荡,启动其卵裂,并促使早期胚胎的继续发育。     

白细胞介素和干扰素γ对绵羊体外受精胚胎体外发育影响的研究

利用SOFM+0.8%BSA+1mM谷氨酰胺作为绵羊胚胎的培养液,分别添加LIF、IL-1β、IL-2、IL-6及IFN-γ,以研究LIF、IL-1β、IL-2、IL-6及IFN-γ对绵羊早期胚胎发育的影响。结果说明,LIF促进2～8细胞胚胎发育至桑椹胚,同时也能够促进桑椹胚向扩大囊胚和孵化囊胚发育。但IL-1β、IL-2、IL-6及IFN-γ对绵羊早期胚胎的发育无显著影响。     

白细胞介素和干扰素γ对绵羊体外受精胚胎体外发育影响的研究

利用SOFM 0．8％BSA 1mM谷氨酰胺作为绵羊胚胎的培养液，分别添加LIF、IL—1β、IL—2、IL—6及IFN—γ，以研究LIF、IL—1β、IL—2、IL—6及IFN—γ对绵羊早期胚胎发育的影响。结果说明，LIF促进2—8细胞胚胎发育至桑椹胚，同时也能够促进桑椹胚向扩大囊胚和孵化囊胚发育。但IL—1β、IL—2、IL—6及IFN—γ对绵羊早期胚胎的发育无显著影响。     

SAHA处理对猪手工克隆胚胎体外发育潜能的影响

为了探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)对德保猪手工克隆胚胎(HMC)发育潜能的影响,试验摸索SAHA的适宜处理浓度[0(对照),1.0,2.5,5.0,7.5,10.0μmol/L]和时间(0,6,12,24 h);之后分为4组,SAHA组、体外受精(IVF)组、孤雌激活(PA)组、对照(HMCC)组,分别在体外发育的1细胞期、2细胞期、4细胞期、囊胚期收集胚胎,在相同时期下比较各组胚胎组蛋白H4K8乙酰化(Ac H4K8)水平差异和相关基因(HDAC1、HAT1、ASF1A、OCT-4)相对表达量。结果表明:7.5μmol/L SAHA处理囊胚率显著高于对照(P0.05),12 h囊胚率显著高于0 h(P0.05);所以适宜处理浓度为7.5μmol/L,适宜处理时间为12 h。在1细胞期、2细胞期、囊胚期,SAHA组Ac H4K8水平接近IVF组水平(P0.05)。在囊胚期,SAHA组HDAC1基因相对表达量接近IVF组(P0.05);在囊胚期,SAHA组OCT-4基因相对表达量接近IVF组(P0.05)。说明SAHA可以使HMC胚胎Ac H4K8水平接近IVF水平,并纠正克隆胚胎乙酰化的异常,从而提高克隆胚胎发育潜能。     

氨基酸对胚胎体外发育的影响

1 前言 氨基酸是胚胎培养液的重要成分,在培养液中添加氨基酸可促进胚胎发育[1],提高囊胚率、孵化率和胚胎质量,使胚胎的细胞数增加[2].但不同氨基酸对胚胎发育的作用不同,不同添加方式其效果也不一样.Bavister和他的同事对小鼠的研究工作,第一次揭示了氨基酸在体外胚胎培养中的作用.     

抽提物处理供体细胞对克隆胚胎发育的影响

本研究采用爪蟾卵母细胞抽提物处理和牛胎儿成纤维细胞(JBCFF),并以发生重编程的细胞为核供体进行体细胞核移植,研究其对克隆效率的影响.分别超排3只爪蟾,收集卵母细胞后提取其抽提物,用BCA蛋白浓度测定试剂盒确定其蛋白含量,SDS-PAGE分析其中所含蛋白的种类.应用细胞膜透化剂Digitonin对建立的JBCFF进行通透处理和PI染色,筛选最适浓度;并用获得的抽提物处理牛体细胞,获得重编程细胞.以发生重编程的体细胞为供体进行核移植,同时比较离子霉素+6-DMAP和A23187+6-DMAP两种组合激活后克隆胚的体外发育能力.结果,3个爪蟾卵母细胞抽提物样品的蛋白浓度分别为56.2255、64.6570和71.2158 μg/mL,其中所含蛋白种类一致,主要集中在40~55、70~100 ku之间.经过连续的筛选,透化剂Digitonin对JBCFF通透处理的最适浓度为7 μg/mL,PI染色显示透化效率为55.44%.爪蟾卵母细胞抽提物与体细胞共孵育后继续培养6~7 d,细胞聚集形成"克隆簇".分别以"克隆簇"细胞和未处理细胞为核供体,制备的重构胚在融合率(92.83%和96.04%)、卵裂率(89.64%和89.78%)和囊胚率(24.06%和23.12%)均无显著差异(P>0.05);离子霉素+6-DMAP和A23187+6-DMAP两种激活方式对克隆胚胎的分裂率(92.16%和92.28%)和囊胚率(23.21%和24.18%)均无显著影响(P>0.05).爪蟾卵母细胞抽提物诱导和牛体细胞发生重编程,并恢复到较低的分化状态,但没有显著促进克隆胚胎的体外发育,可见缺少对胚胎发育起重要作用的重编程过程,还需要继续深入研究.     

体细胞克隆的小鼠胚胎在附植前后发育的研究

采用成年小鼠的卵丘细胞核、胎儿成纤维细胞作核供体细胞来进行核移植,研究小鼠卵母细胞的去核程序和影响重构胚附植前发育的激活条件;随后将重构胚与供体细胞系共培养后获得囊胚阶段的小鼠重构胚,并将其移植到受体鼠体内后获得了24%克隆胚胎。结果表明,小鼠卵母细胞质能够进行重编程来支持早期的胚胎发育。     

PGI2对缺少内源性PGs的绵羊早期胚胎体外发育的影响

试验旨在探讨添加外源Iloprost（PGI₂的稳定类似物）对缺少内源性前列腺素（PGs）的绵羊早期胚胎体外发育的影响。常规体外受精,通过在体外培养液中单独或联合添加前列腺素合成限速酶COX-1和COX-2的特异性抑制剂SC560和NS398,观察COX-1和COX-2对绵羊早期受精胚胎体外发育的影响。添加抑制剂NS398后,再协同添加不同浓度Iloprost,观察PGI₂对绵羊早期体外胚胎发育的具体作用,并对孵化囊胚的细胞数进行分析。结果显示,在卵裂率和囊胚率方面,单独添加NS398与同时添加SC560和NS398组间差异不显著（P>0.05）,而与对照组间差异显著（P<0.05）。添加NS398后,再添加不同浓度的外源性Iloprost可代替胚胎内源性PGI₂的作用,基本消除COX-2抑制剂对绵羊早期胚胎体外发育的不利影响。Iloprost的浓度以1×10^-6 mol/L为宜,H33342染色结果差异不显著（P>0.05）。本试验结果表明,胚胎内源性COX-2对绵羊早期胚胎中PGI₂的合成起主要调控作用。外源添加Iloprost可补偿胚胎内源性PGI₂的缺失作用,解除NS398对COX-2的特异性抑制作用,最终促进绵羊早期胚胎的体外发育。     

PGI_2对缺少内源性PGs的绵羊早期胚胎体外发育的影响

试验旨在探讨添加外源Iloprost(PGI2的稳定类似物)对缺少内源性前列腺素(PGs)的绵羊早期胚胎体外发育的影响。常规体外受精,通过在体外培养液中单独或联合添加前列腺素合成限速酶COX-1和COX-2的特异性抑制剂SC560和NS398,观察COX-1和COX-2对绵羊早期受精胚胎体外发育的影响。添加抑制剂NS398后,再协同添加不同浓度Iloprost,观察PGI2对绵羊早期体外胚胎发育的具体作用,并对孵化囊胚的细胞数进行分析。结果显示,在卵裂率和囊胚率方面,单独添加NS398与同时添加SC560和NS398组间差异不显著(P0.05),而与对照组间差异显著(P0.05)。添加NS398后,再添加不同浓度的外源性Iloprost可代替胚胎内源性PGI2的作用,基本消除COX-2抑制剂对绵羊早期胚胎体外发育的不利影响。Iloprost的浓度以1×10-6 mol/L为宜,H33342染色结果差异不显著(P0.05)。本试验结果表明,胚胎内源性COX-2对绵羊早期胚胎中PGI2的合成起主要调控作用。外源添加Iloprost可补偿胚胎内源性PGI2的缺失作用,解除NS398对COX-2的特异性抑制作用,最终促进绵羊早期胚胎的体外发育。     

哺乳动物(小鼠和绵羊)早期胚胎体外培养的研究——Ⅱ.不同培养液对小鼠和绵羊胚胎体外发育的影响

869个2～4细胞小鼠胚胎分别在 TCM-199、SOF 和 PBS 液(Whittingh-am,1971)和经本试验改良的 TCM-199、SOF 及 PBS 液中进行培养。96小时以后,6种液中的胚胎发育以改良的 TCM-199最佳,其它依次为改良的 SOF和 PBS 以及未经改良的 PBS、SOF 和 TCM-199液。53个8～16细胞绵羊胚胎在改良的 TCM-199液和 SOF 液以及本试验未改良的原 PBS 液(Whittingham,1971)中进行培养。结果在改良的 TCM-199液和SOF 液之间未见显著差异,但这两种液与 PBS 液相比则差异均高度显著。     

活性氧对胚胎体外发育阻滞的影响

自由基是含有一个不成对电子的原子团.早在1931年,Michalis就提出某些酶促氧化还原反应的中间产物为自由基,其试验证据也表明,生物体内可能存在自由基,然而直到自由基生物学迅猛发展的最近30年,自由基在机体内的产生与清除才得以重视.现在,人们已经认识到自由基与许多疾病的发生和发展密切相关.自由基主要分为活性氧自由基和活性氮自由基.文章主要介绍活性氧自由基.     

氨基酸对哺乳动物胚胎体外发育的影响

在培养液中添加氨基酸可促进胚胎发育,提高囊胚率和孵化率,增加胚胎的细胞数。本文对氨基酸在胚胎体外发育中的作用进行了综述,并对生殖道液、胚胎体外培养液和胚胎内氨基酸浓度的差异进行了比较。     

转基因体细胞克隆奶山羊成功

青岛森淼实业有限公司与中国科学院遗传与发育生物学研究机构经过两年共同开展乳腺生物反应器项目研究。２００２年９月至１０月７日出生４只带有医用蛋白转基因体细胞的克隆奶山羊，目前仍有３只成活。经过DNA检测，证明已获得了预期的转β－干扰素基因和转抗凝血酶素Ⅲ基因克隆羊。这标志着功能基因转基因羊在国内的首次成功，其中该项目采用的基因打靶技术应用在山羊上为国际先例。（）□转基因体细胞克隆奶山羊成功$新华社