催乳素保护人B淋巴细胞免其凋亡的实验研究

目的:研究人催乳素(PRL)在B淋巴母细胞系IM-9细胞凋亡中的保护作用。方法:在地塞米松诱导IM-9细胞凋亡的实验体系中加入PRL(10ng/ml),DNA琼脂糖凝胶电泳观察PRL对地塞米松诱导IM-9细胞凋亡的保护。结果:地塞米松组诱导的IM-9细胞在48h后出现细胞凋亡,DNA琼脂糖凝胶电泳显示有大量小分子DNA片段形成,呈典型的细胞凋亡DNA梯形带,地塞米松-PRL组的IM-9细胞的DNA经电泳后未出现凋亡的DNA条带。结论:地塞米松能诱导IM-9细胞的凋亡,PRL能保护IM-9细胞,免其凋亡。     

催乳素对人B淋巴细胞增殖功能的影响

目的探讨催乳素(PRL)对B淋巴细胞生长的调节作用。方法将生理浓度(10 ng.ml-1)的PRL加到IM-9细胞中培养72 h,以MTT比色分析法检测细胞增殖情况。结果空白对照组、脂多糖(LPS)组、PRL组、LPS+PRL组、LPS+溴隐停(Br)组、LPS+PRL+Br组A值分别为1.00±0.09、1.11±0.14、1.21±0.23、1.38±0.44、0.95±0.14、0.89±0.11。与空白对照组比较,PRL(t=2.689,P<0.01)、LPS(t=2.292,P<0.05)均能促进IM-9细胞的增殖;与LPS组相比,加入Br后对IM-9细胞的增殖有抑制作用(t=2.556,P<0.05);与LPS-PRL组相比,加入Br后对IM-9细胞的增殖亦有抑制作用(t=3.417,P<0.01)。结论人PRL能明显地促进IM-9细胞的增殖,Br对IM-9细胞的增殖有抑制作用。     

雌激素对IM-9细胞增殖及功能的调节作用

目的探讨17-β-雌二醇(E2)在体外对人B淋巴细胞系IM-9细胞的调节作用。方法四甲基偶氮唑兰(MTT)法检测不同浓度E2对IM-9细胞增殖时间和剂量依赖性的影响;逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测免疫球蛋白G(IgG)的分泌。结果48 h后低浓度E2(≤10-7mol.L-1)能明显地促进IM-9细胞的增殖(P<0.05),并呈时间-剂量依赖性,而高浓度E2(>10-7mol.L-1)对IM-9细胞有明显的抑制作用(P<0.05),也呈时间-剂量依赖性;RT-PCR扩增IgG显示低浓度的E2(10-10mol.L-1)明显促进IgG分泌(P<0.05),高浓度的E2(10-6mol.L-1,10-4mol.L-1)明显抑制IgG的分泌(P<0.05)。结论E2能调节IM-9淋巴细胞增殖,同时影响免疫球蛋白的分泌。     

泌乳素对人B淋巴细胞HLA-DR表达的影响

目的探讨泌乳素(PRL)与B淋巴细胞功能的关系。方法以生理浓度(10 ng.ml-1)的人PRL刺激培养IM-9细胞系,并设置未刺激组、脂多糖(LPS)刺激组、PRL刺激组、LPS+PRL刺激组、LPS+溴隐停(Brc)刺激组和LPS+PRL+Brc刺激组;采用免疫细胞化学S-P染色法检测不同刺激组B淋巴细胞HLA-DR的表达情况。结果LPS刺激组和PRL刺激组HLA-DR的平均光密度(MOD)与未刺激组相比有明显增加(P<0.05);LPS+PRL刺激组HLA-DR的MOD与LPS、PRL刺激组相比明显增加(P<0.01);LPS+Brc刺激组HLA-DR的MOD与LPS刺激组与LPS+PRL+Brc刺激组相比均明显降低(P<0.05)。结论PRL对B淋巴细胞有活化作用。     

肌动蛋白重构蛋白对瘢痕成纤维细胞增殖和分化的影响

目的 观察肌动蛋白重构蛋白(flightless Ⅰ,FliⅠ)对人瘢痕成纤维细胞增殖和分化的影响,探讨瘢痕组织形成的部分机制.方法 将实验分为空白组、Lipo2000组、Fli Ⅰ siRNA组、Fli Ⅰ cDNA组,采用WST-1法检测细胞增殖,RT-PCR法、Western blot法分别检测Fli Ⅰ、COL-1 mRNA及其蛋白的表达水平.结果 转染48 h后,各组成纤维细胞平均吸光度(A)值分别为:空白组0.934±0.153,Lipo2000组0.910±0.084,Fli Ⅰ siRNA组1.330±0.216,Fli Ⅰ cDNA组0.607±0.042,Fli Ⅰ siRNA组细胞增殖水平明显高于其他3组(P＜0.05);FliⅠ cDNA组细胞增殖水平明显低于其他3组(P＜0.05);RT-PCR法检测FliⅠ、COL-1 mRNA的表达:与空白组比较,FLi Ⅰ siRNA组扩增条带亮度减弱,FLi Ⅰ cDNA组扩增条带亮度明显增强,FLi ⅠsiRNA组的Fli Ⅰ与COL-1扩增产物条带相对灰度值较空白组分别降低至0.194±0.023和0.316±0.176,均显著低于其他3组(P＜0.01),而FLi Ⅰ cDNA组的Fli Ⅰ与COL-1扩增产物条带相对灰度值较空白组分别升高至7.846±1.075和9.842±1.659,均显著高于其他3组(P＜0.01);与空白组及Lipo2000组比较,FLiⅠ siRNA组的成纤维细胞中FliⅠ、COL-1蛋白表达显著减弱(P＜0.05,P＜0.01),FLi Ⅰ cDNA组细胞中Fli Ⅰ、COL-1蛋白表达显著增强(P＜0.05,P＜0.01).结论 FLi Ⅰ缺失能增强瘢痕成纤维细胞的增殖,并能在转录和翻译水平下调FLiⅠ与COL-1的表达,可能是瘢痕增生的机制之一.     

人癌胚抗原基因的克隆及基因疫苗的构建

目的:克隆人癌胚抗原(CEA)基因cDNA,构建CEA基因疫苗.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人结肠癌细胞组织克隆出细胞中CEA基因片段,通过基因重组技术将该基因片段重组于pcDNA3.1真核表达载体上,构建成pcDNA3.1/CEA疫苗,分别用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对pcDNA3.1/CEA疫苗进行鉴定.结果:经PCR扩增发现2.1 kb的目的基因条带、酶切电泳分析可见2.1 kb的目的基因条带和5.4 kb的载体条带、DNA测序证实载体中的目的基因序列与CEA的cDNA序列完全相同.结论:本实验成功地克隆了CEA 基因并构建了其基因疫苗,为进一步研究CEA基因疫苗抗肿瘤的实验打下基础.     

定量实时RT-PCR检测非霍奇金淋巴瘤端粒结合因子2 mRNA的表达

目的:建立定量实时RT-PCR,研究非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者肿瘤组织端粒结合因子2(TRF2)mRNA表达.方法:用RT-PCR扩增目标基因cDNA,电泳后切胶、纯化作为标准品,建立待测基因标准曲线;用实时RT-PCR测定32例NHL和8例反应性淋巴结炎患者淋巴组织TRF2的表达.结果:实时RT-PCR标准曲线中,模板cDNA含量和扩增时产生的荧光信号相关系数为0.996.实时RT-PCR终点产物凝胶电泳的基因条带灰度值和模板cDNA含量的相关系数为0.779(P＜0.05).在NHL患者中,滤泡型淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤TRF2 mRNA表达量分别为(22.943±9.424)amol、(23.181±5.983)amol和(18.339±7.910)amol,与良性反应性淋巴结炎组织[(21.796±4.800 )amol]相比无显著性差异(P>0.05).但Burkitt淋巴瘤TRF2 mRNA表达量为(33.170±12.841)amol,显著高于良性反应性淋巴结炎组织和其他类型恶性淋巴瘤(P＜0.05).结论:定量实时RT-PCR能精确测定目标基因mRNA表达.在NHL中,Burkitt淋巴瘤TRF2 mRNA表达量明显高于滤泡型淋巴瘤、套细胞性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤.     

稳定表达人survivin基因的B16细胞系的建立与鉴定

目的构建人survivin真核表达载体,稳定转染入小鼠黑素瘤B16细胞,建立稳定表达人survivin的小鼠黑素瘤细胞系。方法采用PCR方法扩增出人survivin全长基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,得到重组表达质粒pIRES-neo-SUR-(his)6。利用阳离子脂质体介导法将其稳定转染入小鼠黑素瘤B16细胞,经G418加压筛选出阳性克隆。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹及免疫荧光等检测方法验证人survivin基因在稳定转染B16细胞株中的表达。结果经限制性内切酶鉴定及序列分析,pIRES-neo-SUR-(his)6重组体构建正确。RT-PCR结果表明:从稳定转染pIRES-neo-SUR-(his)6的B16细胞所抽提的总RNA中能够扩增出survivin基因(约530bp);蛋白免疫印迹结果表明:利用特异抗体能够从稳定转染pIRES-neo-SUR-(his)6的B16细胞中检测到survivin蛋白条带,而对照空质粒转染后的细胞则没有相应的条带;流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果显示,稳定转染pIRES-neo-SUR-(his)6的B16细胞用特异性抗体检测到高效的荧光表达,其中5号单克隆的荧光表达率为91.38%,而对照空质粒转染后的细胞则没有相应的荧光表达。结论成功构建了真核表达载体pIRES-neo-SUR-(his)6,建立了稳定转染高效表达人survivin的小鼠黑素瘤细胞系。     

泼尼松、环磷酰胺联合川芎嗪注射液对系统性红斑狼疮患者免疫功能及其他相关因子水平的影响

目的:探讨在泼尼松和环磷酰胺的基础上加用川芎嗪注射液对系统性红斑狼疮(SLE)患者免疫功能及其他相关因子水平的影响。方法:选取我院诊治的70例SLE患者,随机分为对照组和观察组各35例。对照组应用泼尼松联合环磷酰胺进行治疗,观察组在对照组用药的基础上加用川芎嗪注射液静脉滴注。于治疗前后检测并比较两组免疫指标(IgG、C3、ANA)、基质金属蛋白酶(MMP-3、MMP-9、TIMP1)、趋化因子(CXCL9,CXCL10、CXCL11)以及血清IL-10、PRL、S100p、EET水平。结果:治疗前,两组免疫指标(IgG、C3、ANA)、基质金属蛋白酶(MMP-3、MMP-9、TIMP1)、趋化因子(CXCL9,CXCL10、CXCL11)以及血清IL-10、PRL、S100p、EET水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,两组免疫指标(IgG、C3、ANA)、基质金属蛋白酶(MMP-3、MMP-9)、趋化因子(CXCL9,CXCL10、CXCL11)以及血清IL-10、PRL、S100p、EET水平比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:对系统性红斑狼疮患者在泼尼松和环磷酰胺联合治疗的基础上加用川芎嗪注射液,不仅能够改善患者的免疫功能指标,而且能够改善基质金属蛋白酶、趋化因子以及相关血清因子水平,值得临床上研究应用。     

中枢神经系统病毒性感染脑脊液脑样淋巴细胞与免疫球蛋白的关系

目的 :对中枢神经系统 (CNS)病毒性感染脑脊液 (CSF)脑样淋巴细胞 (CFL)与免疫球蛋白 (Ig)的关系进行研究。方法 :采用粟秀初CSF细胞玻片离心沉淀法检出CFL ,Beckman免疫化学测试系统自动检测IgA、IgG、IgM。结果 :CFL阳性组与CFL阴性组比较 ,IgM增高 (P <0 .0 5 ) ,IgG增高 (P <0 .0 5 ) ,IgA无明显变化(P >0 .0 5 )。结论 :CNS病毒性感染时 ,CSF中CFL不仅可辅助B细胞产生IgM ,还可能经辅助B细胞途径产生IgG ,发挥其抗病毒感染作用。     

实验性轴索型格林巴利综合征兔血清抗空肠弯曲菌脂多糖抗体研究

目的 :探讨轴索型格林巴利综合征 (GBS)兔模型血清中抗空肠弯曲菌脂多糖 (LPS) Ig G抗体的改变。方法 :采用酶联免疫吸附试验 (ELISA)方法检测注射 LPS后发病兔 3只 ,未发病兔 2 3只及对照组兔 1 0只血清中抗 LPS Ig G抗体滴度。结果 :发病兔血清中抗 LPS Ig G滴度最高 ,A值明显高于未发病兔组及对照组 ,P<0 .0 1。未发病兔组血清中抗 LPS Ig G抗体滴度也有升高 ,明显高于对照组 ,P<0 .0 1。结论 :注射 LPS后可使兔体内产生抗 LPS Ig G抗体 ,而且产生抗 LPS Ig G抗体滴度越高者患轴索型 GBS可能性越大。     

槐定碱预处理对LPS诱导RAW264.7细胞表达NF-κB的影响

目的观察槐定碱预处理对LPS诱导RAW264.7细胞NF-κB p65、TNF-α表达的影响,探讨槐定碱抗内毒素机制。方法培养RAW264.7细胞,分为空白对照组、槐定碱预处理对照组、LPS模型组、槐定碱预处理＋LPS组。各组处理完毕后5、30、60、120min,分别获取细胞与细胞培养液。Western Blot和RT-PCR分别检测细胞NF-κB p65蛋白与mRNA表达,放免法检测细胞培养液TNF-α含量。结果单独槐定碱对NF-κB p65以及TNF-α表达无影响;LPS模型组各时间点NF-κB p65 mRNA与蛋白以及TNF-α表达均显著高于空白对照组（P〈0.01）,且随LPS刺激时间延长而持续升高,至120min未见下降;槐定碱预处理＋LPS组NF-κB p65mRNA与蛋白及其下游TNF-α表达均较同时间点LPS模型组降低,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论槐定碱预处理可通过抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的NF-κB p65表达及TNF-α分泌发挥抗炎作用。     

康宁克通A对大鼠肾小球系膜细胞增生及单核细胞趋化蛋白—1表达的作用

目的：探讨康宁克通A（TA）抑制大鼠肾小球系膜细胞（GMCs)增生及单核细胞趋化蛋白－1（MCP－1）的表达影响及机制。方法：在体外培养的大鼠GCMs株中加入脂多糖（LPS）后,再分别加入不同浓度的TA,共设3组：①GMC组,②LPS组,即GMCs LPS,③TA组,即GMCs LPS TA。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）掺入法,于24h,48h观察3组中GMCs增生水平,选择药物的最佳GMCs增生抑制浓度及时间段。采用免疫组织化学方法观察3组GMCs涂片中MCP－1及核转录因子－κB(NF-κB)的表达,采用ELISA方法观察其培养的上清液中MCP－1的浓度。结果：①TA组GMCs增生水平明显低于LPS组及GMC组（均P＜0.01)。②TA组GMCs中MCP－1的表达明显低于LPS组和GMC组（均P＜0.01)。③TA组GMCs中NF－κB表达明显低于LPS组（P＜0.01),与GMC组差异无显著性（P＞0.05)。④TA组GMCs培养上清中MCP－1浓度明显低于LPS组（P＜0.01),与GMC组差异无显著性（P＞0.05)。结论：TA可能系通过抑制GMCs中NF－κB的激活而抑制大鼠GMCs增生,下调GMCs中MCP－1的异常表达及分泌。     

血必净对急性肺损伤兔模型中NF-κB信号通路的影响及其临床意义

目的观察血必净对急性肺损伤（ALI）兔模型核因子-κB（NF-κB）信号通路的影响及其对ALI的治疗作用。方法选择新西兰兔80只,按随机方法分为四组：空白对照组、单纯急性肺损伤（LPS）组、单纯血必净（XBJ）组、血必净治疗组（LPS＋XBJ）,并给予相应的治疗,于12、24、36、48 h分批处死后分离肺组织后,采用凝胶电泳迁延率法（EMSA）加计算机辅助图像分析技术检测白细胞NF-κB活性。结果与空白对照组相比较,LPS组各时间点肺组织NF-κB表达量均明显增高（P〈0.01）;与LPS组相同时间点比较,LPS＋XBJ组24、36、48 h肺组织NF-κB表达量明显减少（P〈0.01）;与空白对照组比较,XBJ组各时间点肺组织NF-κB表达量有一定减少,但差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 NF-κB参与了急性肺损伤过程,血必净能抑制NF-κB的表达,从而对肺组织起到保护作用。     

康宁克通A对大鼠肾小球系膜细胞增生及单核细胞趋化蛋白-1表达的作用

目的 :探讨康宁克通A(TA)抑制大鼠肾小球系膜细胞 (GMCs)增生及单核细胞趋化蛋白 1(MCP 1)的表达影响及机制。方法 :在体外培养的大鼠GMCs株中加入脂多糖 (LPS)后 ,再分别加入不同浓度的TA ,共设 3组 :①GMC组 ,②LPS组 ,即GMCs+LPS ,③TA组 ,即GMCs+LPS +TA。采用四甲基偶氮唑盐 (MTT)掺入法 ,于 2 4h ,4 8h观察3组中GMCs增生水平 ,选择药物的最佳GMCs增生抑制浓度及时间段。采用免疫组织化学方法观察 3组GMCs涂片中MCP 1及核转录因子 κB(NF κB)的表达 ,采用ELISA方法观察其培养的上清液中MCP 1的浓度。结果 :①TA组GMCs增生水平明显低于LPS组及GMC组 (均P <0 .0 1)。②TA组GMCs中MCP 1的表达明显低于LPS组和GMC组(均P <0 .0 1)。③TA组GMCs中NF κB表达明显低于LPS组 (P <0 .0 1) ,与GMC组差异无显著性 (P >0 .0 5 )。④TA组GMCs培养上清中MCP 1浓度明显低于LPS组 (P <0 .0 1) ,与GMC组差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论 :TA可能系通过抑制GMCs中NF κB的激活而抑制大鼠GMCs增生 ,下调GMCs中MCP 1的异常表达及分泌     

脂多糖对人单个核细胞白细胞介素-6基因表达的影响

目的：探讨脂多糖(LPS)对人单个核细胞表达白细胞介素-6(IL-6)mRNA的影响。方法：抽取人外周静脉血，经EDTA抗凝，LPS刺激培养，分离单个核细胞并提取总RNA，将总RNA逆转录为cDNA，然后用IL-6引物进行热启动PCR扩增。扩增产物热变性后与IL-6检测探针、捕获探针进行夹心杂交，最后加入亲和素-辣根过氧化物酶及其底物，显色检测杂交信号。IL-6引物及探针用Primer Premier 5．0软件设计。结果：LPS可在转录水平上诱导IL-6 mRNA表达，其作用强度与LPS剂量呈正相关；IL-6 mRNA表达丰度有时间效应，刺激4h后，IL-6 mRNA的表达最高。结论：LPS能显著增强人单个核细胞表达IL-6 mRNA。     

早期干预对脑损伤仔鼠脑组织中肝细胞生长因子表达的影响

目的:研究早期干预对脑损伤后仔鼠脑组织中肝细胞生长因子(HGF)表达的影响。方法:给予孕17天的30只大鼠连续2天腹腔注射脂多糖(LPS)420μg/kg,10只腹腔注射等剂量无菌生理盐水作为对照组。随机选取LPS组仔鼠40只,分为干预组(T)20只与非干预组(NT)20只,生理盐水组(NS)仔鼠20只。仔鼠出生后1日,随机选取各组仔鼠各3只进行脑组织HE染色,并观察脑组织病理改变情况。LPS组和NS组仔鼠出生后均进行早期干预,分别在生后7日、14日、21日、28日的4个时间点行脑组织免疫组织化学染色,观察仔鼠脑组织中HGF的表达及运动功能情况。结果:(1)LPS组仔鼠出生后7日、14日、21日、28日脑组织HGF的表达量较对照组升高(P<0.01);(2)生后7日、14日、21日、28日干预组仔鼠脑组织HGF表达量较非干预组升高(P<0.01)。结论:孕鼠腹腔注射LPS后HGF的表达升高,早期干预可进一步提高其表达量并有效改善脑损伤仔鼠的运动功能。     

脂多糖对小鼠巨噬细胞TREM-1表达的影响

目的:初步探讨脂多糖(LPS)应激下小鼠巨噬细胞TREM-1的表达。方法:以小鼠巨噬细胞为研究对象,分别加入不同浓度的LPS(0.04、0.2、1、5和25μg/mL)作用后,采用RT-PCR法检测不同时间点LPS应激的巨噬细胞TREM-1mRNA的表达。结果:LPS呈时间依赖性地上调巨噬细胞TREM-1mRNA的表达,且在LPS作用6h达到峰值;LPS呈剂量依赖性地上调巨噬细胞TREM-1mRNA的表达,且在1μg/mL达到峰值。结论:LPS可上调小鼠巨噬细胞TREM-1mRNA的表达。