携带人S100A1基因的重组腺相关病毒载体的构建及鉴定

目的:构建携带有人S100A1基因的重组腺相关病毒(Adeno-associated viru,AAV)载体,并对其进行鉴定.方法:用BamH I和EcoRI 将目的基因pUC57-Simple-S100A1和腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen1行双酶切,回收酶切质粒的目的片段进行连接,产物转化感受态DH5a,获得重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1.酶切及测序鉴定后,将pAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper三质粒共转染AAV-293,包装重组腺相关病毒rAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1.收获重组病毒后感染HEK293细胞,荧光计数法测定病毒滴度,病毒基因组外源基因扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.结果:重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1经双酶切和测序鉴定正确;荧光显微镜下观察转染AAV-293细胞72 h后,病毒包装效率达95％～100％,荧光计数法测定病毒感染滴度达(2～3)×107 TU/mL;提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因S100A1片段.结论:成功构建携带有人S100A1的重组腺相关病毒载体rAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1,收获的病毒具有较高滴度,为今后利用腺相关病毒载体进行S100A1基因转染治疗慢性心力衰竭的体外及体内研究提供了实验基础.     

诱导型一氧化氮合酶反义RNA重组腙相关病毒载体的构建

目的应用分子克隆技术构建携带诱导型一氧化氮合酶(iNOS)反义基因片断的重组腺病毒载体(rAAV-AsiNOS)。方法应用RT-PCR技术扩增iNOS目的基因片断,EcoRⅠ和XbaⅠ内切酶分别双酶切pAAV-MCS质粒和iNOS基因,经过胶回收和纯化后,住T4连接酶作用下,构建rAAV-AsiNOS重组质粒,并转化到感受态细菌XL-10中,进行鉴定和测序,293细胞病毒包装,重组腺相关病毒载体大量扩增,滴度和感染率的测定以及浓缩和纯化。结果从SD大鼠脑缺血区域中扩增的iNOS特异性片段大小分别为361bp;经双酶切和连接成重组质粒rAAV-AsiNOS;PCR鉴定结果显示重组质粒rAAV-AsnNOS目的基因产物特异性片段大小为593bp;基因测序结果显示iNOS基因片段分别反向克隆到pAAV的MCS,成功地构建携带反义iNOS基因的重组质粒rAAV-AsiNOS;经测算病毒原液的滴度为(6～12)×107个/ml,对PC12细胞的感染率约为70%;分离浓缩和纯化重组腺相关病毒载体,获得较高的病毒滴度,均约2×1010个病毒颗粒/ml,去除腺病毒等影响因素。结论成功构建携带iNOS反义基因的腺相关病毒载体,测序证实iNOS基因片断分别反向克隆到的腺相关病毒载体上;证实重组腺相关载体能够传染PC12细胞,转染率为70%。     

大鼠星状细胞激活相关蛋白基因的克隆及其重组腺相关病毒载体的构建

克隆大鼠星状细胞激活相关蛋白(Stellate Cell Activation-associated Protein,STAP)基因,构建其重组腺相关病毒载体(rAAV-STAP),为进一步研究STAP基因功能提供有效工具。用RT-PCR法从大鼠肝组织中扩增出大鼠STAP基因,将STAP cDNA插入腺相关病毒(AAV)表达质粒pAM/CAG中,构建重组质粒pAM/CAG-STAP。以磷酸钙共转染法将pAM/CAG-STAP及辅助质粒pAd/H22转染293细胞,经293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺相关病毒rAAV-STAP。ELISA法测定病毒滴度,Western blot法检测重组病毒感染293细胞后STAP的表达情况。实验结果表明,RT-PCR法从大鼠肝组织中扩增出573bp cDNA,测序证实为大鼠STAP基因。Western blot法证实rAAV-STAP感染293细胞后可在细胞内表达STAP。     

慢病毒载体介导apelin基因转染人脐带间充质干细胞的实验研究

【摘要】目的构建带有荧光标记基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和apelin基因的重组质粒pUbi-apelinFLAG-pSV40-EGFP并进行慢病毒包装,探讨其转染人脐带间充质干细胞的最佳感染复数（MOI）值及目的基因表达情况。方法化学合成目的基因片段并扩增。采用In-Fusion技术将酶切后的目的基因片段与线性质粒载体连接,转化入感受态DH5α细胞中后筛选阳性克隆并进行测序。重组质粒慢病毒载体转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度。将重组质粒慢病毒按不同MOI值转染人脐带间充质干细胞,根据转染效率得到最佳MOI值,并采用Real-timePCR及Western blot方法检测目的基因表达情况。结果通过PCR扩增获得酶切位点碱基修饰后的大小约284bp的目的基因片段,与慢病毒质粒载体连接后形成pUbi-apelin-FLAG-pSV40-EGFP重组质粒,测序结果与预期完全符合,并成功包装慢病毒颗粒。最佳MOI值为20,转染效率为（90.32±3.61）%。慢病毒载体能高效转染人脐带间充质干细胞且2周内持续稳定上调目的基因mRNA及蛋白的表达。结论重组质粒慢病毒载体pUbi-apelin-FLAGpSV40-EGFP可有效转染人脐带间充质干细胞,并可持续高表达apelin基因     

重组腺相关病毒介导红荧光蛋白在骨髓间充质干细胞的表达

目的构建表达红荧光(DsRed)重组腺相关病毒,研究腺相关病毒对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的转染效率。方法DsRed目的基因经酶切插入载体质粒pAAV-MCS,构建重组质粒pAAV-DsRed。磷酸钙法转染AAV-293细胞获取重组腺相关病毒。将AAV-DsRed体外转染原代培养的兔BMSCs,分析其转染效率。结果成功构建重组质粒pAAV-DsRed,获得腺相关病毒AAV-DsRed,并感染兔BMSCs。结论腺相关病毒能够转染BMSCs并表达外源基因,具有应用于临床治疗的潜力。     

大鼠 paralemmin-3基因重组慢病毒载体构建及其在肺泡巨噬细胞中的表达

目的 构建大鼠 paralemmin-3（PALM3）基因重组慢病毒载体,探讨转染大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383细胞的最佳感染复数（MOI）值及目的基因 PALM3的表达情况。方法 采用聚合酶链反应技术（PCR）扩增鼠 PALM3基因片段,并将其克隆到 pCV186-Cherry载体上;经 PCR及 DNA测序鉴定后,将重组质粒 pCV186-Cherry-PALM3、辅助包装质粒 pHelper 1.0与 pHelper 2.0共转染至 293T细胞进行重组慢病毒 lenti-CV186-Cherry-PALM3的包装,并用荧光标记法行滴度的测定。将不同 MOI值（0、1、10、20、50）的 lenti-CV186-Cherry-PALM3转染 NR8383细胞,依据转染效率得到最佳 MOI 值,以此 MOI 值感染 NR8383细胞,采用 Western blot 法检测目的基因的表达情况。结果 通过 PCR扩增获得了大小约 2 246 bp的目的基因片段,并成功连接到 pCV186-Cherry重组质粒上。PCR及 DNA测序结果证实重组质粒 pCV186-cherry-PALM3 携带正确的鼠 PALM3 基因并成功包装重组慢病毒颗粒。重组慢病毒 lentiCV186-Cherry-PALM3 的滴度测定为 3×108 TU/mL,感染 NR8383 的最佳 MOI 为 20,慢病毒 lenti-CV186-CherryPALM3 感染后 NR8383 细胞中 PALM3 的蛋白表达水平显著上调（P＜0.05）。结论 本实验成功构建了含大鼠PALM3基因的重组慢病毒载体 lenti-CV186-Cherry-PALM3,并能在 NR8383细胞中高效表达,为进一步研究 PALM3对肺泡巨噬细胞极化的影响奠定了基础。     

LR重组法构建重组腺病毒rAd5-Vpr

目的:构建携带HIV-1Vpr基因的重组腺病毒。方法:采用限制性内切酶消化和T4DNA连接酶连接的方法,将Vpr基因克隆至腺病毒穿梭质粒pTrack-C上,然后通过重组穿梭质粒pTrack-C-Vpr和腺病毒骨架质粒pAdeno体外LR位点特异性重组的方法,将Vpr基因转移至腺病毒骨架质粒pAdeno上,最后重组骨架质粒pAdeno-Vpr鉴定正确后经PacI酶切,转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒rAd5-Vpr。同时在HEK293细胞中进行病毒扩增,利用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用微量全细胞病变法检测病毒滴度。结果:PCR鉴定重组腺病毒rAd5-Vpr构建成功;扩增后检测病毒滴度约为5×108PFU/mL。结论:应用LR重组法能成功构建携带HIV-1 Vpr基因的重组腺病毒,扩增后滴度能满足实验需要,为进一步相关研究的开展奠定了基础。     

大鼠糖皮质激素受体基因腺病毒载体的构建及在肾系膜细胞中的表达

目的 利用AdEasy系统构建大鼠糖皮质激素受体(GR)基因重组腺病毒载体,转染大鼠肾小球系膜细胞(GMC),并通过Western Blot法检测GR蛋白的表达.方法 将质粒pcDNA1 Neo-Rat GR扩增、凝胶回收获得的Rat GR cDNA双酶切片段,插入腺病毒穿梭载体质粒pShuttle-CMV的巨细胞病毒(CMV)启动子下游,构建重组穿梭载体pShuttle-CMV-Rat GR,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内经同源重组得到腺病毒重组质粒pAd-Rat GR,经人胚肾293A细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒Ad-Rat GR;用包装后的病毒上清转染大鼠GMC,提取细胞中总蛋白,通过Western Blot方法 检测GR蛋白的表达.结果 连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAd-Rat GR重组质粒,经人胚肾293细胞包装,48 h后观察到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)明显表达,氯化铯梯度离心纯化最终获得1×109 PFU /ml 滴度的重组病毒;用该滴度的Ad-Rat GR,转染大鼠GMC 48 h后提取细胞总蛋白,Western Blot检测GR蛋白有明显表达.结论 构建的大鼠GR基因腺病毒载体能够在大鼠GMC 中表达GR蛋白,并有上调作用.     

腺相关病毒载体介导的VEGF121基因的构建及其在人脐静脉内皮细胞的表达

目的 研究腺相关病毒载体介导人血管内皮生长因子基因(AAV-VEGF121)的体外促血管内皮细胞生长作用.方法 RT-PCR法获取人VEGF121基因,克隆入pAAV-MCS载体中,构建成pAAV-VEGF121(处理组),以空白载体克隆入pAAV-MCS病毒(对照组);两组分别在AAV-293细胞中包装成pAAV-VEGF121病毒颗粒和空白病毒颗粒.相同条件下,两组分别感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC),半定量RT-PCR检测细胞内VEGF121基因mRNA的表达;CCK-8法测取OD450nm值,绘制细胞增殖曲线;电子显微镜观察细胞超微结构的改变.结果 成功构建AAV-VEGF121;半定量RT-PCR显示处理组细胞内VEGF121的mRNA表达水平高于对照组(P＜0.01);细胞增殖曲线显示处理组细胞增殖能力明显高于对照组;透射电镜显示处理组细胞内与蛋白质合成有关的细胞器增生明显活跃.结论 AAV-VEGF121基因对血管内皮细胞的生成具有促进作用.     

携带人CTLA4-Ig融合基因的非增殖腺病毒载体的构建及表达

目的 研究携带人细胞毒T淋巴细胞相关抗原(CTLA)4-Ig融合基因的非增殖腺病毒载体的生物学特性.方法 构建含人CTLA4-Ig的非增殖腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV-hCTLA4-Ig,与非增殖腺病毒骨架质粒pAdEasy共转化大肠杆菌DH5α,在细菌内同源重组,获得重组非增殖腺病毒载体质粒pAdTrack-hCTLA4-Ig,转染293细胞,经过包装、扩增、纯化后,获得携带人CTLA4-Ig融合基因的非增殖腺病毒.体外感染人近端肾小管上皮细胞株HK-2细胞,72 h后检测其外分泌性表达.结果 获得携带人CTLA4-Ig融合基因的非增殖腺病毒,滴度为6×1013空斑形成单位/毫升(pfu/ml);在其感染的人近端肾小管上皮细胞株HK-2细胞培养上清液中能检测到可溶性重组蛋白CTLA4-Ig的表达.结论 制备的重组非增殖腺病毒在体外能有效感染人近端肾小管上皮细胞株HK-2细胞,受感染细胞能表达、分泌可溶性蛋白CTLA4-Ig.     

基因重组hVEGF165腺相关病毒载体的包装和鉴定

目的:采用rAAV Helper free System构建hVEGF165腺相关病毒和增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒,并初步鉴定其感染情况。方法:采用AAV-Helper free system包装系,构建hVEGF165腺相关病毒和增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒载体质粒,应用电穿孔方法质粒共转染HEK293细胞,分离纯化后获得rAAV-hVEGF165和rAAV-EGFP,AVSachTMELISA法测定rAAV颗粒滴度,并鉴定其对HEK293细胞的感染情况。结果:包装纯化后获得病毒滴度可达到2×1011,电镜观察病毒颗粒均匀,病毒大小20～25nm,呈多面体形态。结论:成功包装hVEGF165腺相关病毒和增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒。     

肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体表达载体的制备

目的构建一种携带肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体（TRAIL）基因的重组腺相关病毒（rAAV）载体。方法首先构建携带可溶性肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体（sTRAIL）基因的穿梭质粒腺相关病毒穿梭质粒-可溶性肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体（pAAV-sTRAIL），将穿梭质粒转染入HEK293细胞（人胚肾细胞系）中，采用细胞内质粒DNA同源重组法构建重组腺相关病毒载体rAAV-sTRAIL。以噬斑分析法筛选单克隆rAAV-sTRAIL；PCR法鉴定阳性rAAV-sTRAIL；氯化铯密度梯度离心法纯化rAAV-sTRAIL；紫外分光光度仪测定rAAV-sTRAIL颗粒数及纯度，噬斑分析法测定rAAV-sTRAIL感染滴度；Western免疫印迹检测rAAV-sTRAIL在HEK293细胞中的表达情况。结果成功构建了rAAV-sTRAIL，制备的病毒纯度好、滴度高，且在HEK293转导细胞中能有效表达目的基因sTRAIL。结论构建的重组腺相关病毒载体rAAV-sTRAIL，为研究TRAIL抗肿瘤细胞效应及临床应用提供先进的载体系统。     

利用Gateway技术构建重组腺病毒pAd-NK4

目的利用Gateway技术构建含人肝细胞生长因子(HGF)NK4基因的重组腺病毒载体。方法以含有HGF/NK4基因的质粒为模板PCR扩增NK4基因,将回收的NK4PCR产物片段克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-6获得重组质粒pYr-adshuttle-6-NK4。从该重组质粒上,利用LR同源重组将NK4-IRES-EGPF表达框转移至腺病毒骨架质粒pAD/BL-DEST,获得重组腺病毒质粒pAd-NK4-IRES-EGFP。该质粒经pacI线性化后转染293包装细胞,获得重组腺病毒rAd-NK4-IRES-EGFP。采用TCID 50(tissue cell infectiousdosage 50,TCID 50)法测定重组腺病毒滴度。重组腺病毒分别经酶切和PCR等方法进行鉴定。荧光显微镜观察转染效果。结果证实腺病毒载体中含有NK4基因的目的片段;病毒滴度为6.3×1011 PFU.L-1;荧光显微镜发现该重组腺病毒能在HEK293细胞中高效的表达。结论利用Gateway技术可以快速地构建同时表达NK4蛋白和绿色荧光的重组腺病毒,为下一步开展关于NK4基因的肿瘤治疗提供了基础。     

ZNF24基因过表达慢病毒载体的构建及其在人结直肠癌HCT116细胞中的表达

目的 通过构建ZNF24基因过表达慢病毒载体,建立ZNF24基因过表达的人结直肠癌HCT116细胞株,为开展后续研究提供物质基础。方法 通过PCR扩增ZNF24基因序列片段和3FLAG标签序列片段,并将两产物通过同源重组克隆至慢病毒载体pMT406中,构建成重组表达ZNF24慢病毒质粒pMT-ZNF24。将重组质粒pMT-ZNF24与辅助包装载体质粒p CMV-dR8.9和pCMV-VSV-G一起共转染293T细胞并收集慢病毒。应用孔稀释法检测病毒滴度,用qRT-PCR和蛋白印迹法检测慢病毒转染HCT116细胞后ZNF24的表达水平。结果 成功构建了重组载体pMT-ZNF24,并获得相应的病毒,病毒滴度为3.25×10⁹ TU/ml。转染重组ZNF24慢病毒的HCT116细胞中ZNF24表达水平显著高于空白组和阴性对照组细胞。结论 构建了ZNF24基因过表达慢病毒载体,并获得相应的病毒和稳定表达ZNF24的HCT116细胞株。     

慢病毒介导稳定高表达Cx32的Huh7细胞系建立及其对细胞增殖的影响

目的构建LV5-h Cx32慢病毒表达载体,获得稳定高表达人缝隙连接蛋白32(connexin32,Cx32)的Huh7人肝癌细胞系,并研究Cx32对Huh7细胞增殖的影响。方法采用全基因合成法并经PCR扩增得到Cx32基因序列,将所得目的片段克隆到LV5-GFP载体上,获得重组慢病毒质粒LV5-GFP-h Cx32,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,与慢病毒包装质粒系统共转染293T细胞中,包装成重组慢病毒颗粒,经荧光显微镜测定重组慢病毒滴度。将慢病毒载体LV5-h Cx32和LV5-NC感染Huh7细胞,嘌呤霉素筛选出细胞阳性克隆并扩大培养。qRT-PCR、Western blot和免疫荧光法分析Cx32的表达及定位;细胞接种荧光示踪法检测细胞缝隙连接(gap junction,GJ)功能;MTT法及克隆形成实验观察细胞增殖能力的变化。结果双酶切及测序结果表明LV5-GFPh Cx32慢病毒载体构建成功,经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为3×10¹¹TU·L^-1的重组慢病毒LV5-GFP-h Cx32,慢病毒瞬时感染后的Huh7细胞中Cx32 mRNA和蛋白表达水平明显增多,筛选后建立的稳定转染细胞系中Cx32也稳定高表达,并且部分表达于细胞膜,形成有功能性的GJ。过表达Cx32的Huh7细胞增殖能力减弱(P<0.05)。结论成功构建Cx32基因过表达慢病毒载体,该载体能够稳定感染Huh7细胞,使外源基因Cx32过表达并抑制细胞的增殖能力。     

靶向大鼠血管紧张素转换酶基因的短发夹RNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的利用AdMax腺病毒载体系统构建大鼠血管紧张素转换酶-短发夹RNA(ACE-shRNA)腺病毒载体并在人胚胎肾-293细胞中扩增制备重组病毒。方法自先期构建的pGenesil-1-ACE-shRNA真核表达载体中用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增出ACE-shRNA片段,并克隆进入穿梭质粒pDC316中,将构建好的穿梭质粒pDC316-ACE-shRNA载体和骨架病毒pBHGlox-E1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶,聚合酶链反应(PCR)检测和绿色荧光蛋白(FGFP)表达证实成功地构建了携带ACE-shRNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带ACE-shRNA片段的重组腺病毒载体,为进一步利用基因沉默技术抗高血压的研究奠定了基础。     

Ad-VEGF121和Ad-VEGF165重组腺病毒的构建和制备

目的:以pAdEasy-1缺陷性腺病毒系统为载体构建用于实验动物模型基因治疗的Ad-VEGF121和Ad-VEGF165重组腺病毒。方法:采用RT-PCR方法从人心肌组织中扩增获得VEGF121、VEGF165cDNA片段,分别插入pUCm-T载体构成pUC-VEGFs;限制性内切酶SalⅠ、KpnⅠ切下目的基因片段,插入pAdTrack-CMV载体相应的多克隆位点构成pAdTrack-CMV-VEGFs。电转法将被PmeⅠ切成线性的pAdTrack-CMV-VEGFs转入E coli BJ5183,与其中的pAdEasy-1同源重组成pAdEasy-VEGFs。阳离子脂质体法将被PacⅠ线性化的重组子转染293T细胞进行腺病毒包装。转染后7～11d可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白(GFP)呈彗星状,收集细胞反复冻融获得含重组腺病毒的上清液。感染293T细胞3～4次,待细胞出现细胞病变效应(CPE)时收获腺病毒(Ad-VEGFs),并用CsCl密度梯度超速离心进行纯化。结果:重组腺病毒在电镜下呈多面体,形态完整;Ad-VEGF121和Ad-VEGF165病毒滴度分别达到1.155×1012和1.281 5×1012 V.P/mL。结论:利用pAdEasy-1缺陷性腺病毒系统构建携带目的基因的重组腺病毒方法较简便,易掌握。获得的重组腺病毒纯度高、滴度高,适用于实验动物模型和体外培养细胞的基因治疗。     

PI16重组腺病毒表达载体的构建及其在人主动脉瓣间质细胞中的表达

目的构建携带人肽酶抑制蛋白16(PI16)基因的重组腺病毒表达载体,并研究其在人主动脉瓣间质细胞(hAVICs)中的表达。方法合成带有EcoRⅠ酶切位点的PI16引物,PCR扩增PI16基因,将目的基因克隆到穿梭载体pAV-MCMV-GFP-3FLAG中,PCR及测序鉴定穿梭质粒pAV-MCMV-PI16-GFP-3FLAG。将穿梭质粒与辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK 293细胞,获取重组腺病毒Ad-MCMV-PI16-GFP-3FLAG。转染HEK 293细胞大量扩增后,采用CsCl梯度离心法纯化病毒,半数组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度。用Ad-MCMV-PI16-GFP-3FLAG感染hAVICs,Western blot检测PI16在hAVICs中的表达。结果成功构建了表达PI16蛋白的重组腺病毒,滴度达到5.01×1010 TCID50/ml,转染hAVICs后能高效地表达PI16蛋白。结论成功构建携带人PI16基因的重组腺病毒,为进一步研究PI16基因的作用提供了基础。     

Ad—VEGF121和Ad—VEGF165贷重组腺病毒的构建和制备

目的：以pAdEasy—1缺陷性腺病毒系统为载体构建用于实验动物模型基因治疗的Ad—VEGF121，和Ad—VEGF165重组腺病毒。方法：采用RT—PCR方法从人心肌组织中扩增获得VEGF121、VEGF165cDNA片段，分别插入pUCm—T载体构成pUC—VEGFs；限制性内切酶Sal Ⅰ、KpnⅠ切下目的基因片段，插入pAdTrack—CMV载体相应的多克隆位点构成pAdTrack—CMV—VEGFs。电转法将被Pme Ⅰ切成线性的pAdTrack—CMV—VEGFs转入Ecoli BJ5183，与其中的pAdEasy-1同源重组成pAdEasy—VEGFs。阳离子脂质体法将被PacⅠ线性化的重组子转染293T细胞进行腺病毒包装。转染后7-11d可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白（GFP）呈彗星状，收集细胞反复冻融获得含重组腺病毒的上清液。感染293T细胞3～4次，待细胞出现细胞病变效应（CPE）时收获腺病毒（Ad—VEGFs），并用CsCl密度梯度超速离心进行纯化。结果：重组腺病毒在电镜下呈多面体，形态完整；Ad—VEGF121和Ad—VEGF165病毒滴度分别达到1．155&#215;10^12和1．2815&#215;10^12V．P／mL。结论：利用pAdEasy-1缺陷性腺病毒系统构建携带目的基因的重组腺病毒方法较简便，易掌握。获得的重组腺病毒纯度高、滴度高，适用于实验动物模型和体外培养细胞的基因治疗。     

基于慢病毒载体系统构建重组JSRV－NM假病毒

【摘要】目的 采用慢病毒质粒结构重组JSRV-NM假病毒,克服JSRV-NM病毒只能通过绵羊支气管穿刺接种扩增,不能通过体外细胞培养扩增的问题。方法 采用慢病毒高效包装系统pMD.G、pCMV-HIV△8.2和pHIVeGFP,以JSRV-NM病毒的env包膜质粒pCMVJSRV-NM替代VSV-G病毒的包膜质粒pMD.G,转染293T细胞,复制、包装并产出重组的JSRV-NM假病毒。用real-time PCR检测WPRE表达来测定假病毒的滴度,用接种24孔板的293T细胞检测假病毒感染力。结果 成功重组了基于慢病毒质粒结构的JSRV-NM假病毒,可超速离心浓缩成高滴度（1×10⁸TU/mL）的病毒,Lv-JSRV-NM包膜与Lv-VSV-G包膜按感染复数（MOI）=3的比例感染Hela细胞具有相同的感染能力。结论 基于慢病毒质粒构建的JSRV-NM假病毒,能够在293T细胞中复制和扩增,产出的假病毒具有稳定性、感染力和安全性,符合二级生物实验室安全的要求。