抗骨形成蛋白（BMP）单链抗体的构建

从一株鼠抗ＢＭＰ单克隆抗体杂交瘤中扩增出其可变区基因片段，并将其分别克隆入ＰＵＣ１８、１９载体，利用双脱氧链终止法进行序列测定和计算机分析后，应用一段人工合成的含１５个氨基酸的连接肽，将重链基因的Ｃ端和轻链基因的Ｎ端连接起来，构建成单链抗体。将其克隆入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１，在大肠杆菌ＪＭ１０９中获得初步表达。     

抗重组人bFGF单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的：从分泌抗重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）单克隆抗体（mAb）杂交瘤细胞株B2F3中克隆抗体可变区（V）基因，构建bFGF单链抗体（scFv），并进行可溶性表达。方法：从分泌bFGF mAb杂交瘤细胞株B2F3提取总RNA，用RT-PCR方法扩增抗体重链可变区基因（VH）和轻链的可变区基因（VL）；再通过重叠延伸拼接（SOE）PCR方法，在VH和VL基因之间引入linker（Gly4Ser）3，构建bFGF scFv。将测序正确的scFv基因克隆到表达载体pCANTAB 5E中，选择非抑制型菌株E.coli HB2151进行可溶性表达；经SDS—PAGE检测抗体表达水平，ELISA鉴定其抗原结合活性。结果：测序分析结果显示，VH基因序列全长375碱基对，编码125个氨基酸，VL基因序列全长399碱基对，编码133个氨基酸，二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征，含有4个框架区（FR）、3个抗原互补决定区（CDR）及抗体特征性的2个半胱氨酸残基；构建的scFv全长789碱基对，编码263个氨基酸，连接结构为VH-linker-VL。SDS-PAGE分析表明scFv基因在大肠杆菌为可溶性表达，表达产物主要位于周质腔中，表达产物的Mr为27000，与理论预期值相符；间接ELISA检测结果显示原核表达的scFv具有与bFGF特异性结合的活性。结论：成功地克隆bFGF mAb可变区基因，并构建表达bFGF scFv，为下一步研究bFGF抗体人源化改造奠定实验基础。     

细胞内生成的抗整合酶单链抗体阻断HIV—1复制的实验研究

通通细胞内表达抗ＨＩＶ－１整合酶单链抗体（ＩＮ－ｓＦｖ）基因,阻断病毒基因组与缩主细胞基因组的整合,进而抑制病毒复制,探讨该基因载体在ＮＩＶ－１感染基因治疗中应用的意义。方法用带有ＩＮ－ｓＦｖ基因的逆转录病毒表达载体ｐＳＬＸＣＭＶ／ＩＮｓＦＶ转染ＰＡ３１７包装细胞,并用包装后含有目的基因的逆转录病毒转导ＳｕｐＴ１细胞及外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）。以ＨＩＶ－１ＮＬ４－３病毒株感染表达ＩＮ－ｓＦｖ的     

抗人C1抑制物单克隆抗体亲和层析柱分离的C1抑制物性质初探

我们用淋巴细胞杂交瘤技术获得了一株分泌抗人C_1抑制物(C_1 inhibitor)单克隆抗体(McAb)。用此McAb制备的亲和层析柱分离了具有强的溶血抑制活性的人C_1 INH,分子量为102000。重复分离的C_1 INH电泳图像提示C_1 INH存在抗原性相同,而分子量不同的两种成份。     

抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体基因的构建、初步筛选和鉴定

目的 :构建抗木瓜凝乳蛋白酶全套单链抗体 (scFv)噬菌体表面展示文库。方法 :从木瓜凝乳蛋白酶免疫小鼠的淋巴细胞中提取总RNA ,反转录成cDNA后 ,用抗体V区简并引物扩增全套VH 和VL 基因。经重叠延伸反应 ,装配成scFv基因 ,并将其克隆到噬粒载体pFAB5C中 ,构建scFv噬菌体抗体库。对抗体库进行亲和筛选后 ,用ELISA法鉴定抗木瓜凝乳蛋白酶的scFv。结果 :经 4轮“亲和 吸附 洗脱”的富集过程 ,得到ELISA活性较高可与木瓜凝乳蛋白酶结合的克隆。结论 :成功地构建了抗木瓜凝乳蛋白酶的scFv噬菌体展示文库 ,并筛选到与木瓜凝乳蛋白酶具有结合能力的scFv基因     

抗人血管生长素单链抗体可变区基因的定向克隆及序列分析

血管生长素（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ,ＡＮＧ）是一种存在于正常人血浆及实体肿瘤组织中的蛋白质,它具有很强的促血管生长作用。大量研究表明：ＡＮＧ与肿瘤的快速生长和转移有密切的关系＾〔１〕。ＡＮＧ单抗可以通过中和ＡＮＧ或阻断ＡＮＧ与血管内皮细胞受体的结合而实现其抑瘤作用＾〔１〕,但传统的杂交瘤技术制约了ＡＮＧ单抗的制备,而基因工程抗体技术具有克隆筛选简捷、抗体制备方便及易进行抗体基因修饰操作等优点。本文通过抗人ＡＮＧ单链抗体可变区基因的定向克隆和序列分析的研究,将为临床提供一种经济有效的新型抗体打下基础。     

单链抗体的改进—ScFv多聚体

ScFv多聚体是通过将单链抗体的连接肽缩短至12个氨基酸以下而构成的一种新型小分子抗体,由单链抗体聚合为二聚体、三聚体等形式,使抗原结合价增加、亲和力得到提高、功能多样,具有广阔的应用前景。本文对该新型小分子抗体连接肽的设计、性能、表达及应用作一综述。     

人补体C1—抑制物基因在COS—7细胞中的表达

利用全长人Ｃ１－ＩＮＨ ｃＤＮＡ片段构成建功可在ＣＯＳ－７细胞中瞬间表达重组人Ｃ１－ＩＮＨ的表达质粒ｐＳＶＬＣ１。通过ＤＥＡＥ－Ｅｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ－７细胞，经体外标记、免疫沉淀和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹后发现，转染细胞可分泌一条分子量约１１０ｋＤ的免疫活性蛋白带。     

抗人HBsAg单链抗体基因的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建抗人HBsAg单链抗体基因，并分析其在COS—7细胞中的表达。方法：以从噬菌体抗体库中筛选的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板，分别扩增其轻、重链可变区(VL、VH)基因，通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(C1y4Ser)3的编码序列连接，并引入前导肽编码序列，构建具有L—VH—Linker—Vl结构的单链抗体基因。将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体pEGFP—N3，并转染COS—7细胞进行表达。结果：经测序表明，前导肽、连接肽、VL及Vh的序列正确。酶切鉴定证实，成功地构建了GFP基因融合表达载体。瞬时转染COS—7细胞后，通过荧光显微镜观察证实有ScFv融合蛋白的表达。转染细胞的培养上清浓缩后，进行SDS—PAGE及westem blot分析，可检出ScFv融合蛋白的分泌性表达。培养上清的间接ELISA检测证实，所表达的单链抗体具有与HBsAg结合的特异性。结论：成功地构建了抗人HBsAg单链抗体基因，并可在COS—7细胞中分泌性表达。     

CLONING AND SEQUENCE CHARACTERIZATION OF THE RE-ARRANDED VH GENE FROM HYBRIDOMA CELLS SECRETING ANTI-HUMAN C1-INHIBITOR McAb

由分泌抗人Ｃ１－ＩＮＨＭｃＡｂ的杂交瘤Ｆ７细胞株提取总ＲＮＡ，合成与ＶＨ基因ＦＲ１和ＦＲ４互补的通用引物，以ＲＮＡ反转录合成的第一链ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ法克隆出Ｆ７ＶＨ基因的ＤＮＡ片段。将分离获得的目的ＤＮＡ片段亚克隆入ｐＵＣ１８／１９测序载体，从两头进行双脱氧核苷酸随机终止法的ＤＮＡ序列测定。结果显示：ＶＨ基因是由３３３个碱基组成，编码１１１个氨基酸残基。通过国际联机检索进行ＥＭＢＬ和Ｋａｂａｔ基因库扫描发现，Ｆ７ＶＨＤＮＡ仅与Ｉｇ同源，符合小鼠Ｉｇ的ＶＨ基因特征；同源性为６０％～８５％，应归属于Ｉｇ的ＶＨ基因。根据Ｋａｂａｔ分类方法，Ｆ７ＶＨ基因推导的氨基酸顺序属于小鼠Ｉｇ的ＶＨ基因的Ⅱ（Ａ）亚组，是由ＶＨ－Ｄ－ＪＨ３重排产生；其框架区的９和６７位点为脯氨酸（Ｐｒｏ）和赖氨酸（Ｌｙｓ）（非芳香族氨氨酸），符合Ⅱ（Ａ）亚组框架残基结构模式；其ＣＤＲ３区含有７个氨氨酸残基，表明Ｃ１－ＩＮＨ抗原表面结构并不复杂；ＦＲ２和ＦＲ３的２２和８９位点为半胱氨酸残基（Ｃｙｓ），与ＶＨ片段二硫键形成有关。成功获得Ｆ７ＶＨ基因为进一步构建和表达单链Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体打下良好的基础。     

抗人膀胱癌噬菌体单链抗体的初步制备

应用ＰＣＲ方法，从杂交瘤细胞中扩增鼠抗人膀胱癌抗体重、轻链可变区基因，经ＤＮＡ接头连接后与噬菌粒ｐＣＡＮＴＡＢ５重组，转化大肠杆菌后制备噬菌体抗体文库，通过亲和筛选、再转染、克隆化及鉴定，得到高亲和力抗人膀胱癌噬菌体单链抗体。     

抗人C1q McAb轻链可变区基因结构特点

运用计算机进行基因序列分析在分子生物学研究中起重要作用，已被越来越多地用于研究大量累积的序列数据，获得许多重要发现。对抗人Ｃ１ｑ轻链可变基因（Ｃ１ｑＶ_Ｌ）的分析结果表明：Ｃ１ｑＶＬ属鼠ＩｇＶＫ基因家族，但与其它种属的Ｉｇ基因也显示较高同源性。它的另─个显著特点是与自身抗体编码基因高度同源。研究结果对我们进─步认识抗－Ｃ１ｑ抗体生理、病理作用具有─定价值。     

两株人单抗重链可变区基因特征分析

对采用PCR方法克隆获得的两株抗出血热病毒人单抗重链可变区基因(V_H87—2,V_HC8)进行了基因特征分析。同源性比较显示:两基因来源于不同的人抗体重链可变区家族。V_H87-2与人免疫球蛋白重链可变区第三亚组同源性最高,达87％,而V_HC8与人免疫球蛋白重链可变区第一亚组同源性最高,达71％。空间结构分析表明两个可变区具有不同空间构象:V_H87—2属人抗体重链可变区1—1类空间结构,V_HC8属人抗体重链可变区1—2类空间结构。上述分析证明,此两株人单抗重链可变区存在着基因特征及蛋白空间构象的差异。通过基因分析掌握人单抗分子特征,对指导人源性基因工程抗体的研究具有重要意义。     

抗人C1q杂交瘤细胞中一未知DNA片段的克隆与分析

使用一对ＩｇＶＨ通用引物，应用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从分泌抗人Ｃ１ｑＭｃＡｂ的Ｂ６杂交瘤细胞株总ＲＮＡ扩增出－３８７ｂｐ的ＤＮＡ片段。通过计算机网络系统对其进行序列的类似性检索，未发现与之一致或显著相似的序列。     

C1 INH concentrate in the therapy of hereditary angioedema

Ten acute attacks were managed in nine patients with hereditary angioedema by means of the infusion of a C1 INH concentrate produced on large scale. No side effects were observed.     

抗人肝癌单克隆抗体重链可变区基因克隆和序列测定

应用反转录ＰＣＲ方法从分泌抗人肝癌单克隆抗体鼠杂交瘤细胞系ＨＢｂ２７中成功地克隆了单抗重链可变区基因，将此基因重组入Ｍ１３噬菌体中，双脱氧链终止法测定了核苷酸序列。经计算机分析，基因全长４０８ｂｐ，编码１３６个氨基酸，并进行了基因同湖泊性分析，结果表明获得的重链可变区基因是具有功能性的，两端引物自带起始码和终止码，可直接插入原核载体中进行表达。     

HBV Pre S2 3B9单抗轻、重链可变区基因的分离,序列分析及单链可变区抗体基因的构建

3B9(杂交瘤细胞)是一株分泌HBV Pre S2抗原的单抗细胞,为从分子水平分析、了解3B9株进而为制备新一代基因工程抗体奠定基础,用分子生物学技术,提取3B9杂交瘤细胞总RNA,经反转录、PCR分离获得了3B9单抗的轻、重链可变区基因,并利用PCR及双脱氧核苷酸链末端终止法对3B9单抗的可变区基因的核苷酸序列进行了分析。结果表明,3B9单抗轻链隶属小鼠Ig Kappa轻链第Ⅱ亚组,JK_1基因重排;而3B9单抗重链隶属小鼠Ⅰg重链第Ⅱc亚组。在此基础上,作者用一编码疏水性多肽接头的DNA片断将3B9单抗轻、重链可变区基因连接,成功地构建了3B9单抗单链可变区抗体基因。为下一步克隆、表达有抗原结合活性的单链抗体打下了良好的物质基础。     

抗HSV糖蛋白单克隆抗体重链可变区DNA的克隆及序列分析

作者从分泌具有高中和活性和高保护作用的抗ＨＳＶ型共同性糖蛋白Ｃ的鼠源性单抗的杂交瘤细胞１Ａ１２／４Ｄ５中提取ＲＮＡ，逆转录成ｃＤＮＡ。用合成的寡核苷酸引物从中扩增了抗体的重链可变区基因，并克隆入质粒，随机挑取两个阳性克隆进行核苷酸序列分析，见所克隆基因确可编码小鼠抗体的重链可变区。