重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶包涵体蛋白的柱上复性

N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(NAO)具有广泛的底物选择性,可用于多种活性氨基酸的酶法拆分,具有广阔的工业应用前景。文中采用多种洗涤剂对重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶包涵体进行洗涤去杂,并用DEAE Sepharose Fast Flow层析柱和三缓冲体系作为复性系统对重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶包涵体进行复性实验。结果表明,4mol/L尿素与0.5%Triton X-100联合洗涤可以大量去除杂质;三缓冲体系能有效地实现重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶包涵体的柱上复性。在流速为0.5 mL/min,尿素梯度为21 mL,尿素终浓度为1.8mol/L,蛋白质上样量为0.99 mg的实验条件下,蛋白回收率和复性酶比活分别达到52%和10.27 U/mg。     

金属离子对重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶可溶部分酶活力的影响

重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶可在重组菌BL21-pET22b-argE中高效表达,大多以不可溶的包涵体形式存在。文中研究了金属离子浓度及添加时间对该菌生长及可溶表达部分酶活力的影响。结果表明,1.0g/L的Mg2+对生物量和酶活有明显促进作用。Co2+的浓度及添加时间不同,对菌的生长及酶活力的影响结果也不同。培养起始加入Co2+会抑制菌的生长及酶活,而在1.0%乳糖诱导2.5h后加入则可解除生长抑制并促进酶活。Ni2+,Cu2+会抑制菌体的生长及酶活。Mn2+、Mo2+和B3+不影响菌的生长,对酶活有促进作用。添加金属离子后,酶活从16.90U/mL提高到251.91U/mL。     

一株产几丁质脱乙酰酶诱变菌株的培养基配方及发酵条件优化

以一株海洋来源产几丁质脱乙酰酶（CDA）的丝状真菌（Penicilium janthinellum）1-5-2为出发菌株,经紫外线诱变后获得一高产CDA菌株UV-210S。通过单因素试验得出该诱变菌株的最佳培养基配方为麦芽糖1.3%,牛肉浸膏2.6%,NaH2PO4 0.3%,CaCl2 0.1%,胶体几丁质0.5%;最佳发酵工艺条件为NaCl 1.5%,初始pH值为9.0,发酵温度30 ℃,摇床转速180 r/min,CDA最佳收集时间为72 h。经培养基配方及发酵条件优化后该诱变菌株的最高CDA酶活为16.76 U/mL,相比优化前的酶活提高了52%。     

分散泛菌胞内脱乙酰酶在大肠杆菌中重组表达条件优化及酶学特性

目的 对分散泛菌的胞内脱乙酰酶(Pantoea dispersa N-acetylglucosamine deacetylase, Pd-nagA)进行表达条件优化及酶学性质分析。方法 本研究使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术对分散泛菌全基因组中Pd-nagA基因序列进行全长扩增,将含有Pd-nagA基因的质粒pET-28a(+)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,同时采用单因素实验,优化诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及乳糖类似物异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)的浓度,采用Ni2+-次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid,NTA)进行重组酶的纯化,再对其酶学特性进行测定。结果 以pET-28a(+)质粒作为表达载体,大肠杆菌BL21(DE3)成功表达了可溶形式的Pd-nagA蛋白,分子量约为40 kDa。当诱导温度为28℃,诱导前菌液OD600值为1.2,IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导时间为20 h时,Pd-nagA蛋白得到了大量表达。通过薄层层析法分析表明Pd-nagA重组蛋白能够在体外转化N-乙酰氨基葡萄糖生成氨基葡萄糖,Pd-nagA重组蛋白能够在高盐溶液中保持一半的相对酶活性,该酶储存10 d的相对活性仍然保持在90%以上,具有良好的储存稳定性,催化N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)生成氨基葡萄糖(glucosamine, GlcN)反应条件简单快捷。结论 本研究成功异源表达了具有催化活性的Pd-nagA酶,并对表达条件进行优化及酶学特性探究,可为工业上单酶催化制备氨基葡萄糖提供一定的理论参考。     

海洋细菌Microbacterium esteraromaticum MCDA02产几丁质脱乙酰酶发酵条件优化

从海洋样品中筛选几丁质脱乙酰酶产生菌,对产酶水平较高菌株进行鉴定,并对发酵条件进行优化。采用对硝基乙酰苯胺为指示剂,通过变色圈法筛选获得几丁质脱乙酰酶的海洋细菌菌株MCDA02。通过形态学特征、生理生化特性和16SrDNA序列分析,将其鉴定为Microbacterium esteraromaticum。通过单因素实验结合响应面设计对菌株MCDA02产几丁质脱乙酰酶的发酵条件进行优化,获得该菌株的最佳培养基配方为胰蛋白胨1%、木薯淀粉1.1%、ZnSO_4 0.05%。发酵条件为初始pH7.9,30℃、180r/min、发酵72h、接种量1%、装液量20%。在此条件下菌株MCDA02发酵产几丁质脱乙酰酶水平2.01U/mL,比优化前提高了1.41倍。     

产几丁质脱乙酰酶海洋细菌的筛选鉴定及产酶条件优化

从海洋样品中筛选产几丁质脱乙酰酶的细菌,对高产菌株进行鉴定,并利用响应面法优化其发酵条件。结果表明,利用添加硝基乙酰苯胺的平板,根据黄色变色圈从海州湾海域海泥样品中筛选获得一株产几丁质脱乙酰酶的细菌MCDA3-3。通过形态学、生理生化特征以及16S rDNA序列分析,将该菌株鉴定为海洋硝酸盐还原菌（Nitratireductor aquimarinus）。利用单因素和响应面法优化菌株MCDA3-3发酵产酶培养基和培养条件,获得最佳发酵培养基配方为木薯淀粉1.1%,玉米浆1.0%,FeCl3·6H2O 0.045%,陈海水配制,pH 5.7;最佳发酵条件为接种量4%,30 ℃、180 r/min发酵48 h。在此条件下酶活为4.07 U/mL,是优化前的2.3倍。     

一株产几丁质脱乙酰酶丝状真菌的发酵条件优化研究

针对已筛选出的一株能生产几丁质脱乙酰酶(CDA)的海洋丝状真菌,考察其最佳发酵培养基和发酵条件。通过单因素与正交实验得出该菌的最佳产酶条件为:初始p H为6.0,发酵温度为30℃,发酵时间为108 h,葡萄糖浓度7 g/L,酵母浸膏浓度7 g/L,氯化钙浓度0.75 g/L,几丁质浓度1.25 g/L,Na Cl浓度为1.4%。通过酶活的测定,发现该丝状真菌合成的几丁质脱乙酰酶主要是胞外酶。在最佳发酵条件下该丝状真菌的最高CDA胞外酶活为21.37 U/m L。是一株具有开发潜力的几丁质脱乙酰酶生产菌株。      

N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的异源表达及甘油糖苷的酶法合成

从杆菌状链霉菌中克隆了一个N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-glucosaminidase,NAGase）的编码基因sbnag2550,并将其在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了异源表达。利用镍离子亲和层析得到纯酶后对SbNag2550的酶学性质进行了研究。该酶的最适温度为50℃,在45～60℃均表现出90%以上的酶活力。SbNag2550还表现出优良的热稳定性,在55℃孵育60 h仍能保留将近90%的酶活力。利用SbNag2550催化N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-glucosamine,NAG）和甘油发生逆水解反应,合成了甘油-N-乙酰氨基葡萄糖苷（glyceryl N-acetyl-glucosamine,GNAG）。在最适条件下,反应24 h时转化率达到28.20%,反应72 h时转化率为34.82%。本研究中首次通过酶法合成了GNAG,为其功能研究和应用开发奠定了基础。     

蛋白质谷氨酰胺酶的重组表达与发酵条件优化

蛋白质谷氨酰胺酶(protein-glutaminase,PG)对植物蛋白具有高效的脱酰胺作用,可提高蛋白的溶解度,进而改善其起泡性、凝胶性等功能性质,在植物性食品中有巨大的应用前景.但由于原始菌株解脘金黄杆菌PG产量低,需异源重组表达以提高产量.将PG基因重组到质粒pHT43,采用强组成型启动子P43替换pHT43的...     

海洋Arthrobacter protophormiae CDA2-2-2产几丁质脱乙酰酶发酵条件优化

对海洋Arthrobacter protophormiae CDA2-2-2产几丁质脱乙酰酶发酵培养基和发酵条件进行优化,提高发酵产酶水平.在单因素实验优化的基础上,利用PB试验筛选显著影响菌株发酵产酶酶因素,进一步利用响应面法优化这些因素,获得最佳发酵培养基和培养条件.利用单因素实验优化获得碳源、氮源、金属离子、发酵...     

重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件的优化

目的：优化重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件,提高具有生物活性的重组蛋白LuxS的表达量,为体外合成自诱导物2（autoinducer-2,AI-2）奠定基础。方法：采用单因素试验,优化诱导培养基、诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）的浓度;采用Ni-NTAPurification System对重组蛋白进行纯化,比较Native Elution Buffer的咪唑浓度和pH值对重组蛋白纯化的影响,确定最佳的Native Elution Buffer;对比蛋白与树脂结合时不同缓冲液的纯化效果,选择最优的结合缓冲液。结果：重组蛋白的最佳诱导表达条件为：以LB培养基为诱导培养基,菌液OD600 nm为0.6～0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导温度为37 ℃,诱导时间为12 h。采用添加3 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液作为蛋白与树脂结合的缓冲液,含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）作为蛋白洗脱液。使用分离获得的LuxS蛋白合成的AI-2生物活性约为阳性对照的6 倍。结论：本研究成功优化了重组蛋白LuxS的诱导表达及纯化条件,获得了具有生物活性的重组蛋白,并成功合成了AI-2。     

单核细胞增多性李斯特菌p60蛋白表达条件的优化

在成功构建重组表达载体pET-28a-p60 和获得重组宿主菌E.coli BL21(DE3)的基础上,对重组宿主菌E.coliBL21(DE3)进行表达p60 蛋白条件的优化研究。结果表明：将重组大肠杆菌培养至OD600nm 达0.7～0.8 左右时,加入浓度为1mmol/L 的异丙基-β-D- 硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),在摇床温度为25℃,转速为150r/min 条件下诱导表达6h,可得到重组表达的p60 蛋白占总蛋白的比例为42.32%,其中可溶性蛋白占总p60 蛋白的比例为85.36% 左右,为p60 蛋白诱导表达的最优条件。     

杂合抗菌肽MgJ基因在毕赤酵母中表达条件的优化

为确定杂合抗菌肽MgJ基因的最佳诱导表达条件,将构建好的重组表达载体pPICZαA-MgJ经SacⅠ线性化处理,电转入巴斯德毕赤酵母GS115,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,聚合酶链式反应（polymerase chainreaction,PCR）扩增验证,甲醇诱导表达。优化杂合抗菌肽MgJ诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度、初始菌体浓度表达条件。结果表明杂合抗菌肽MgJ的最佳表达条件为：28 ℃、250 r/min诱导培养,每24 h添加体积分数0.5%的甲醇,诱导时间120 h,MgJ表达量可达11.9 mg/L。纯化后获得的表达产物MgJ对S. aureus ATCC 29213有较好的抑菌活性,最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）为10 μg/mL。     

TAT-SOD在长期保藏的重组毕赤酵母中表达的条件优化

TAT-SOD是TAT蛋白转导结构域与SOD的融合蛋白质。作者以2007年构建的产TAT-SOD重组毕赤酵母菌为出发菌株,通过摇瓶实验研究不同温度、初始pH、诱导剂浓度等因素对蛋白质表达的影响。通过比色分析法测定菌体浓度、超氧阴离子自由基清除法测定酶活、SDS-PAGE分析目的蛋白质TAT-SOD的浓度;并采用定量PCR法分析表达菌株的目的基因的mRNA变化规律,从而研究长期保藏重组毕赤酵母菌株表达TAT-SOD的适合性及其条件优化。研究结果表明,摇瓶发酵的最佳条件下（YPDM培养基,体积分数1.0%诱导剂浓度,诱导温度30.0 ℃,初始pH值7.0）,发酵液上清酶活水平为753 U/mL,是未优化初始酶活水平的5.1倍,其中pH值优化使TAT-SOD表达水平提高到原始值的3.4倍。7.0的初始诱导pH值的mRNA水平是对照组pH 4.0的3.5倍。这些结果说明,长期保藏的重组毕赤酵母菌株仍然适合表达TAT-SOD,发酵条件会对毕赤酵母的TAT-SOD表达造成显著影响,影响表达水平的最主要因素是目的蛋白质的mRNA水平变化。     

乳源性免疫活性肽在E.coli BL21中分泌表达的诱导条件优化

设计4个乳源性免疫活性肽的目的基因后,利用基因重组技术成功构建原核表达载体pTYB11,并将重组质粒转化到E.coli BL21中,通过改变异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)的浓度、培养时间和培养温度,设计正交试验来优化乳源活性小肽的IPTG诱导表达条件,使目的蛋白可在E.coli BL21中高效表达。依据15% SDS-PAGE电泳分析得到融合蛋白的表达量,选出最适诱导条件为IPTG终浓度0.1～0.2mmol/L,在12～15℃条件下培养20h,得到大小为59.2kD左右的融合目的蛋白,其表达量可占总蛋白表达量的40%,经Western Blotting鉴定正确。     

软枣猕猴桃多聚半乳糖醛酸酶提取条件的优化

以软枣猕猴桃为实验材料,确定多聚半乳糖醛酸酶最优提取条件和最适活性分析条件。在提取过程中,以酶比活力为指标确定缓冲液的最适pH值、离子浓度、DTT添加量对PG提取效果的影响,通过正交试验确定最佳提取条件。结果表明：最优提取条件为pH5.5、0.05mol/L 乙酸缓冲液为提取液,加入0.1mol/L NaCl、1mmol/L DTT;最适活性分析条件为反应温度40℃、反应时间90min。     

降解玉米赤霉烯酮菌株的鉴定及其发酵条件优化

从土壤样品中得到一株能降解玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)的菌株ZENL09,对该菌株的形态特征、生化理化特性和16r sRNA进行分析鉴定,并通过单因素实验得出ZENL09的较优的发酵条件。结果表明:ZENL09为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其较优的发酵条件为:发酵时间24 h,发酵温度33℃,摇床转速200 r/min,装液量25 mL/250 mL,接种量3%,在此条件下,ZENL09发酵上清液对ZEN的降解率达到了96%。     

L-丙氨酸转化菌发酵条件的优化

产L-天冬氨酸-β-脱羧酶(L-aspartate-β-decarboxylase,Asd)菌株以L-天冬氨酸(L-aspartic acid,L-Asp)为底物转化生产L-丙氨酸,通过单因素及正交设计试验对睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D培养基组成及发酵条件进行优化.结果表明,最佳培养基组成:富马酸1.0％、L-Asp ...     

人乙醛脱氢酶2与NusA的融合表达

通过将乙醛脱氢酶2（acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2）与NusA-tag融合表达,以获得能够在大肠杆菌中可溶性表达并且具有较好活性的重组蛋白。首先,根据Aldh2的基因序列设计引物,引入EcoRI和XhoI的酶切位点,聚合酶链式反应扩增出Aldh2基因片段,连接到pMD19-T-simple载体,并转化到大肠杆菌DH5α菌株。测序正确后,双酶切处理,将Aldh2基因片段克隆到表达载体pET44b（＋）上NusA-tag下游的EcoRI和XhoI酶切位点之间,得到pET44b（＋）-NusA-Aldh2重组载体,转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导,表达的融合蛋白具有良好的溶解性,主要存在于上清液中。融合蛋白的最优表达条件为IPTG浓度0.25 mmol/L、诱导温度37 ℃、诱导时间3 h。重组蛋白的最适反应温度为37 ℃,在pH 7.0时达到最好的催化效果。不同金属离子如Ca2＋、K＋、Na＋、Mg2＋、Mn2＋都对酶有激活作用,且Mg2＋效果最好,最佳的酶活性为1.64 U/mL。而野生型ALDH2在大肠杆菌中表达时完全以无活性的包涵体形式存在,复性后得到的酶活性为1.43 U/mL。本研究通过引入NusA进行融合表达,实现了ALDH2在大肠杆菌中的可溶性表达,且重组蛋白的活性优于包涵体复性蛋白。这些结果表明利用NusA进行融合表达是制备重组ALDH2的一个良好方法。     

植物乳杆菌YM-2菌株胞外多糖生物合成工艺优化

对从云南传统发酵豆豉分离得到的植物乳杆菌YM-2(Lactobacillus plantarum YM-2)菌株胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)生物合成条件进行优化。首先对培养基成分中的碳源、氮源种类进行筛选;然后利用单因素试验分析碳源含量、氮源含量、培养时间以及培养温度对EPS产量的影响;最后采用Box-Behnken法进行四因素三水平响应面分析以确定其最优工艺条件。结果表明,植物乳杆菌YM-2菌株生物合成EPS最佳条件为碳源(葡萄糖)含量30 g/L、氮源(酵母粉)含量30 g/L、培养时间30.05 h、培养温度36.36℃,在此工艺条件下,植物乳杆菌YM-2 EPS产量为257.362 mg/L。