氨甲酰胆碱对多巴胺诱导的小脑颗粒细胞凋亡的保护机制

[目的]研究多巴胺诱导小脑颗粒神经元凋亡的分子机制,以及胆碱受体激动剂氨甲酰胆碱对多巴胺诱导凋亡的作用。[方法]在培养的小脑颗粒神经元建立多巴胺凋亡模型。用相差显微镜观察形态学,NDA凝胶电 Hoechst 33258核染色分析神经元凋亡。细胞的存活率用二乙酸荧光素（FDA）染色法检测。采用Western blot分析细胞外信号调控的蛋白激酶（ERK）激活情况。[结果]多巴胺可诱导小脑颗粒神经元调亡,并可持续激活ERK,二者均可被氨甲酰胆碱和PD98059抑制。氨甲酰胆碱对神经元的保护作用及对ERK激活的抑制作用可被阿托品阻断。[结论]多巴胺在小脑颗粒神经元诱导凋亡可能是通过持续激活ERK介导的,氨甲酰胆碱通过激活M胆碱受体,继而抑制了ERK的激活,从而起到对神经元的保护作用。     

多巴胺诱导PC12细胞凋亡的机制

目的　探讨多巴胺 (DA)诱导大鼠嗜铬细胞瘤细胞株 (PC12 )细胞凋亡的机制。　方法　采用 PC12细胞为模型 ,以 0 .45 mmol/ L的 DA来诱导细胞凋亡的发生 ,用流式细胞仪检测 PC12细胞的亚二倍体峰 ,按 Griess法测定 NO代谢产物 NO2 -的浓度 ,用 Ac- DEVD- AMC为酶作用底物 ,在荧光分光光度计下检测 CPP32活力。　结果　 DA处理组的凋亡率为 5 4.49%± 1.6 0 % ,与阴性对照组 (1.6 1%± 0 .18% )比较差异有显著性 (P<0 .0 1) ;NO2 -浓度的升高和 CPP32活化程度与阴性对照组比较差异亦有显著性 (P<0 .0 1)。　结论　 CPP32的激活是 DA诱导 PC12细胞凋亡的重要通路 ,而合成增多的 NO可能是 DA激活 CPP32的信号传递分子。     

多巴胺对PC12细胞凋亡的诱导作用

目的 研究外源性多巴胺对多巴胺能神经元的毒性作用,方法 采用体外培养的PC12细胞为模型,以终浓度0.45mmol/L的多巴胺对细胞进行诱导。结果 在透射电镜下可见培养的PC12细胞核染色质明显固缩、断裂,原位末端标记技术显示胞核内散在分布断裂DNA片段,流式细胞仪检测到DNA周期中G0-G1期前出现明显的亚二倍体峰,琼脂糖凝胶电泳呈现典型的“梯状”带等细胞凋亡的特征性改变。结论 外源性DA可诱导PC12细胞凋亡。     

卵巢早衰的颗粒细胞凋亡机制研究进展

卵巢早衰发病率日益增高,已经成为严重危害女性身心健康的疾病,近年来对其病因的研究很多,目前认为,造成这种疾病的原因是多方面的,主要有基因缺陷、激素及其受体缺陷、代谢紊乱以及自身免疫失常。此外,一些人为的机械性损伤,也可以诱发卵巢早衰,但其确切机制仍未可知。众多研究显示无论是何原因引起卵巢早衰,都伴有颗粒细胞的凋亡,这也说明了颗粒细胞的凋亡与卵巢早衰有着直接的关系。因此,本文就当前关于卵巢早衰中颗粒细胞凋亡的研究进展加以综述,提出卵巢早衰的细胞凋亡机制,旨在为后续研究提供参考。     

Ghrelin拮抗鱼藤酮诱导的多巴胺能细胞凋亡的机制研究

【目的】 帕金森病(PD)是常见的神经退行性疾病之一,遗传和环境因素均可导致PD的发生,但90%的PD为散发性。由于病因不明,临床上的治疗多为对症治疗,且药物治疗的副作用大,因此,寻找新的预防和治疗PD的生物活性物质具有重要的临床意义。Ghrelin是1999年发现的由28个氨基酸残基组成的脑肠肽,对其研究集中在摄食和能量代谢的调控上,近年来发现Ghrelin对下丘脑神经元具有保护作用,为了探讨Ghrelin对多巴胺(DA)能神经元的作用,本实验拟在环境毒素鱼藤酮制备的PD细胞模型上,观察其对DA能细胞损伤的保护作用,并深入探讨其机制。 【方法】 本实验选用的DA能细胞是MES23.5细胞,具有DA能神经元的主要特点。实验分为三组:对照组,鱼藤酮处理组(500 nmol/L鱼藤酮孵育24 h),Ghrelin+鱼藤酮处理组(10^-9 mol/L的Ghrelin预孵育20 min后,加入500 nmol/L鱼藤酮共同孵育24 h)。应用MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测线粒体跨膜电位差和caspase-3活性,酶活性检测技术测定线粒体呼吸链复合物I的活性,蛋白质印迹法检测线粒体细胞色素C的释放,Hoechst染色观察细胞凋亡的形态学变化。 【结果】 鱼藤酮处理24 h后,细胞存活率降低39%(P<0.01)。而Ghrelin预孵育20 min,能显著拮抗鱼藤酮所致的细胞存活率的降低(P<0.01)。Ghrelin能够拮抗鱼藤酮导致的线粒体呼吸链复合物I活性的降低和跨膜电位差的降低,并进一步抑制鱼藤酮诱发的细胞色素 C由线粒体的释放。我们还观察了凋亡效应酶caspase-3活性的变化,在鱼藤酮处理组,细胞caspase-3的活性较对照组显著增加(P<0.01),而Ghrelin预孵育后,细胞caspase-3的活性较鱼藤酮组明显降低(P<0.05)。鱼藤酮孵育后,细胞出现明显的核碎裂与核固缩现象,而Ghrelin预处理后上述现象明显减轻。 【结论】 环境毒素鱼藤酮能够通过抑制DA能细胞线粒体呼吸链复合物I的活性,从而导致其功能的损伤,引起线粒体跨膜电位差的降低和细胞色素C的释放,并进一步诱发细胞的凋亡,而Ghrelin能够通过作用于线粒体呼吸链复合物I,从而恢复线粒体功能,抑制细胞凋亡,发挥其保护作用,但其细胞内的信号转导过程尚需进一步探讨。     

谷胱甘肽对多巴胺诱导的GH4细胞凋亡的保护作用

目的 探讨多巴胺(DA)诱导垂体瘤GH4细胞凋亡及谷胱甘肽(GSH)对DA诱导细胞凋亡的保护作用机制。方法 本实验通过3部分探讨DA的凋亡作用及GSH的保护作用： ① 实验分空白对照组及DA用药组,体外观察不同浓度、时间DA对GH4细胞生长的影响;② 实验分空白对照组、DA组、DA联合DA D2受体拮抗剂组,观察D2受体在细胞凋亡中的作用;③ 实验设空白对照组、DA组、GSH用药组,PI染色分别观察3组细胞的凋亡情况,Western blot 检测Bcl-2及PARP-1的表达。结果 DA诱导的GH4细胞凋亡呈浓度-时间依赖性,选择性D2受体拮抗剂不能阻断细胞凋亡,经GSH处理GH4细胞后,PI染色显示凋亡细胞数明显低于DA组,Western blot示Bcl 2表达增加,PARP-1表达下降。结论 DA通过细胞内作用诱导GH4细胞凋亡,选择性D2受体拮抗剂不能阻断细胞凋亡,GSH对DA诱导的GH4细胞凋亡有明显的保护作用,可能与Bcl-2上调、PARP-1下降有关。     

多巴胺诱导PC12细胞凋亡的免疫组织化学及超微结构分析

目的 研究帕金森病（PD）多巴胺能神经元的死亡机制,方法在免疫组织化学基础上,采用流式细胞仪,电泳及电镜技术观察不同浓度多巴胺（DA）诱导大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡的超微结构及生化改变。结果 适当浓度DA可诱导PC12细胞凋亡,早期表现为线粒体结构及功能的改变并有抗凋亡蛋白bcl-2的达,后期电镜下可见亡特征性核结构改变及典型的DNA阶梯状电泳带,结论 细胞凋亡参与了PD的病变过程,线粒体在早期细胞凋亡中起着重要的调节作用。     

CGRP对葡萄糖诱导血管内皮细胞凋亡保护作用的研究

目的观察降钙素基因相关肽(calcitonin-gene-related peptide;CGRP)对高浓度葡萄糖(高糖)诱导的脐静脉内皮细胞凋亡的作用,初步探讨CGRP抑制高糖诱导细胞凋亡的机制。方法用MTT法检测细胞活力;Cell Death Detection ELISA评价细胞凋亡;半定量RT-PCR检测细胞内细胞外信号调节激酶2(ERK2)mRNA的表达水平。结果当CGRP浓度为10^-8mol／L时,高糖对细胞的损伤已明显得到保护。高糖组细胞活力为印％,而CGRP处理组细胞活力为80％。ELISA结果显示,CGRP处理组细胞凋亡率明显下降。CGRP明显上调ERK2 mRNA表达水平。结论CGRP通过激活ERK2的表达拮抗高糖诱导的内皮细胞凋亡。     

硫辛酸抑制AIF 介导的非Caspase 凋亡通路对多巴胺能神经元的保护机制

目的：帕金森病（Parkinson’s disease,PD）最主要的病理变化是中脑黑质多巴胺（dopamine,DA）能神经元的变性死亡,但其病理机制仍然不清楚。硫辛酸是丙酮酸脱氢酶的辅助因子,具有抗氧化性和线粒体保护功能,对PD 具有一定的治疗效果。本研究旨在探索硫辛酸是否通过抑制致凋亡因子（apoptosis inducing factor,AIF）介导的非Caspase 凋亡通路对多巴胺能神经元发挥神经保护功能。方法：6-OHDA 诱导建立单侧损毁的PD 大鼠模型后,给予硫辛酸干预;通过行为学、NueN 和TH 免疫染色观察硫辛酸的保护作用;通过Western Blot、免疫组化、激光共聚焦检测硫辛酸是否可以抑制AIF 介导非Caspase 依赖性凋亡通路对DA 能神经元具有保护作用。6-OHDA 诱导PC-12 细胞损伤建立PD 细胞模型,给予LA 干预;通过CCK-8、流式和线粒体膜电位检测硫辛酸的保护作用;通过Western Blot 和激光共聚焦检测硫辛酸是否可以抑制AIF 介导非Caspase 依赖性凋亡通路对多巴胺能神经元具有保护作用。结果：在PD 模型大鼠上,硫辛酸能够显著缓解
PD 模型大鼠行为学的改变,显著减缓PD 模型大鼠黑质区神经元的丢失;同时,硫辛酸也显著抑制PD模型大鼠黑质区AIF 的线粒体释放和细胞核转移。在PD细胞模型上,硫辛酸能够抑制6-OHDA诱导的PC12 细胞凋亡,显著抑制6-OHDA 诱导的PC12 线粒体通透性转变;同时,硫辛酸也显著抑制PC12 细胞模型AIF 的线粒体释放和细胞核转移。结论：硫辛酸能够通过抑制AIF 介导的非Caspase 凋亡通路对多巴胺能神经元发挥神经保护功能。     

多巴胺诱导白血病细胞系K562凋亡的实验研究

目的:观察多巴胺对白血病细胞系K562的诱导凋亡作用.方法:采用液体培养实验、MTT实验、集落培养实验观察多巴胺对K562细胞增殖的影响,采用瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学变化和流式细胞术检测多巴胺作用后K562细胞凋亡峰的出现,三方面评价多巴胺对K562细胞的诱导凋亡作用.结果:液体培养结果,MTT及集落培养结果显示多巴胺能抑制K562细胞增殖;瑞氏-吉姆萨染色显示的形态学结果及流式细胞术结果显示多巴胺诱导K562细胞亚二倍峰的出现,表明多巴胺有诱导K562细胞凋亡的改变.结论:多巴胺有诱导K562细胞凋亡的作用.     

JNK抑制剂SP600125对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用

[目的]研究特异性c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂SP600125对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用。[方法]把体外培养的小脑颗粒神经元从含去极化浓度钾离子(KCl 25mmol/L)的培养基中转移至低钾培养基(KCl 5mmol/L)中诱导神经元凋亡。以Western blot法检测JNK和c-Jun的磷酸化水平。[结果]低钾(KCl 5 mmol/L)磷酸化并激活JNK,诱导c-Jun磷酸化和小脑颗粒神经元凋亡。SP600125通过抑制c-Jun磷酸化而浓度依赖性地促进低钾环境中培养的小脑颗粒神经元的存活。其保护作用的半数有效量(ED_(50))为1.01μmol/L。[结论]SP600125通过特异性地抑制JNK活性而对低钾培养的小脑颗粒神经元具有保护作用;提示JNK是介导低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的关键激酶,它可能可以作为干扰神经元凋亡的药物的作用靶点。     

热刺激预处理对复极化诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用

【目的】热刺激预处理诱导热休克蛋白表达 ,观察它对复极化诱导的小脑颗粒神经元凋亡是否具有保护作用。【方法】热刺激处理诱导热休克蛋白产生 ,复极化诱导体外培养的小脑颗粒神经元凋亡 ,FDA荧光染色计算细胞存活率 ,相差显微镜分析细胞形态 ,Hoechst332 5 8染色分析核形态 ,琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段 ,Westernblotting检测HSP70 表达。【结果】小脑颗粒神经元在去极化条件 (2 5mmol/LKCl)下生长良好 ,复极化 (5mmol/LKCl )后 2 0h ,相差显微镜下神经元胞体缩小 ,突起断裂。Hoechst 332 5 8染色见核固缩和凋亡小体。琼脂糖凝胶电泳出现细胞凋亡的典型生化特征—DNA梯状条带。预先对小脑颗粒神经元进行热刺激处理 (4 4℃ )不同时间 (6 0min ,90min)再复极化 ,神经元凋亡数明显减少 ,且随热处理时间延长 ,保护作用增强。Westernblotting结果 :随热刺激 (4 4℃ )处理时间延长 ,HSP70 表达量逐渐增加。【结论】热刺激预处理对复极化诱导的小脑颗粒神经元凋亡具有保护作用。这一保护作用可能涉及HSP70 。     

舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽的分离及其对M胆碱受体的激动效应

目的 从舟山眼镜蛇Naja atra蛇毒中分离毒蕈碱样多肽,探讨其与M胆碱受体的关系.方法 应用分子筛凝胶Sephadex G-50、Sephadex G-100、离子交换凝胶CM-Sepharose F.F.分离纯化目的组分;SDS-PAGE鉴定目的蛋白的纯度并测定其相对分子质量;放射受体分析法测定该物质与大鼠脑组织M胆碱受体的亲和力;选用离体豚鼠回肠纵行肌观察其对M胆碱受体的效应.结果 从舟山眼镜蛇蛇毒中获得一种与大鼠脑组织M胆碱受体具有高亲和力的多肽(Ki为10.12 nmol/L),其相对分子质量约14 kD.该多肽可引起离体豚鼠回肠纵行肌收缩,此效应可被阿托品阻断.结论 舟山眼镜蛇蛇毒中获得与M胆碱受体具有高亲和力的多肽,该多肽对M胆碱受体具有激动效应.     

p38 MAPK抑制剂通过抑制JNK活性抑制培养的小脑颗粒神经元凋亡

【目的】研究特异性p38分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）抑制剂SB203580对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的作用。【方法】把体外培养的小脑颗粒神经元从含去极化浓度钾离子（KCl25mmol*L-1）的培养基中转移至低钾培养基（KCl5mmol*L-1）中诱导神经元凋亡。凝胶电泳分析DNA片段,SAPK/JNK分析盒测定c-JunN-末端蛋白激酶(JNK)活性。【结果】低钾诱导小脑颗粒神经元的具有典型形态学和生化特征的凋亡。特异性的p38MAPK抑制剂SB203580通过抑制细胞凋亡,促进低钾环境中培养的小脑颗粒神经元存活。这种保护作用具有浓度依赖性。培养于低钾环境中的颗粒神经元,c-Jun表达和磷酸化水平升高了,且激活了JNK活性。当小脑颗粒神经元生长在含SB20358025μmol*L-1的低钾培养基中,c-Jun表达、磷酸化水平和JNK活性都明显降低。【结论】SB203580抑制JNK活性,降低c-Jun的磷酸化而对低钾培养的小脑颗粒神经元具有保护作用。     

大鼠背根神经节ERK5/CREB信号通路在神经病理性疼痛中的作用

目的:探讨脊髓与背根神经节(DRG)细胞外信号调节蛋白激酶5(ERK5)信号通路在神经病理性疼痛中的作用。方法:SD大鼠坐骨神经结扎(CCI)建立神经病理性模型。应用免疫组化方法检测CCI大鼠DRG磷酸化ERK5(p-ERK5)表达的变化;鞘内注射ERK5反义寡核苷酸对CCI大鼠DRG p-CREB表达以及机械缩足反射阈值(MWT)和热缩足反射潜伏期(TWL)的影响。结果:CCI大鼠同侧DRG p-ERK5标记的神经元数量明显增加;鞘内注ERK5反义寡核苷酸有效抑制DRG ERK5表达的同时,CCI所致的p-CREB表达上调(P<0.05)、机械与热痛觉过敏也明显减轻(P<0.05)。结论:DRG ERK5参与了神经病理性疼痛的信号转导过程,其部分作用是通过激活转录因子CREB实现的。     

小脑颗粒神经元撤钾凋亡中JNK/c-Jun通路对促凋亡基因Hrk的转录调控

目的研究小脑颗粒神经元(CGNs)撤钾凋亡模型中,BH3-only促凋亡基因Hrk的转录,及JNK/c-Jun通路对Hrk基因转录的调控。方法新生7 d Sprague-Dawley大鼠CGNs在含10%胎牛血清和25 mmol/L KCl培养液中培养。培养第7天,分别用不含胎牛血清的25或5 mmol/L KCl培养液处理2、4、8 h,或5 mmol/L KCl+JNK通路抑制剂处理细胞4 h;或在培养第5天用表达负显性c-Jun突变体的腺病毒载体(Ad-FLAGΔ169)感染CGNs 36 h后,用5mmol/L KCl处理细胞4 h。用RT-PCR方法检测各组CGNs促凋亡基因Hrk mRNA的表达。结果在CGNs撤钾凋亡模型中促凋亡基因Hrk mRNA转录上调;JNK通路抑制剂CEP-11004或SP600125均部分地下调了Hrk的转录;负显性c-Jun突变体抑制了Hrk mRNA的表达。结论在CGNs撤钾凋亡模型中促凋亡基因Hrk转录上调;JNK/c-Jun信号通路介导了Hrk的转录。     

肝纤维化逆转中MAPK/ERK信号转导通路的活化及其特征

目的探讨有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）／细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）信号转导通路与肝纤维化自发逆转的相关性。方法采用CC14注射SD大鼠8周，随后停药6周建立肝纤维化自发逆转的动物模型。采用cDNA微阵列杂交检测纤维化消退期间MAPK／ERK级联反应中有丝分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK）、MAPKK、MAPK等上下游激酶的表达变化。并通过Northern杂交加以验证。结果肝纤维化自发逆转过程中，H—raf、A—raf．MAPKK2、ERK1及核糖体S6蛋白激酶（S6 protein kinase，RSK1）等MAPK／ERK信号转导通路中的关键激酶表达水平均显著提高，并呈现顺序激活的时序关系，ras抑制物的转录则明显下调。结论MAPK／ERK信号通路在肝纤维化消退时明显活化，可能与纤维化的自发逆转密切相关。     

罗非昔布对大鼠结肠肿瘤细胞外信号调节蛋白激酶表达的影响

目的　研究选择性COX 2抑制剂罗非昔布对大鼠结肠肿瘤的防治作用及对肿瘤组织细胞外信号调节蛋白激酶(ERK/pERK)表达的影响。方法　利用二甲肼(DMH)诱导Wister大鼠结直肠肿瘤发生;用5mg/kg罗非昔布给大鼠灌胃,观察药物对大鼠结直肠肿瘤的预防和治疗作用及对肿瘤组织ERK/pERK表达的影响。结果　DMH能诱发大鼠结直肠腺瘤及腺癌,2 2周末,罗非昔布预防组腺瘤发生率为5 0 %,对照组腺瘤发生率为10 0 %;罗非昔布预防组及对照组大鼠平均每只腺瘤数分别为1 . 66±0 . 5 7与2 83±1 16,二者有显著差异(P <0 . 0 5 )。2 4周末,罗非昔布预防组腺癌发生率为5 0 %,对照组发生率为83 . 3 %;预防组及对照组腺癌分别为1 . 3 3±0 . 5 8与2 . 40±0 . 89,二者有显著差异(P <0 . 0 5 )。大鼠结直肠肿瘤组织pERK水平较正常结肠组织明显升高,腺瘤和腺癌组织pERK的表达无明显差异;罗非昔布作用组pERK表达明显下调。结论　罗非昔布不仅能预防化学致癌剂诱发大鼠结直肠腺瘤发生,还能减少腺癌发生;这种作用可能部分通过抑制结直肠肿瘤pERK表达实现。     

先兆子痫患者血清血管紧张素Ⅱ 1型受体自身抗体对血管平滑肌细胞ERK1/2信号途径的激动效应

目的探讨血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1受体)的自身激动性抗体(AT1-AAs)激动培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)AT1受体并激活细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号途径的能力。方法采用亲和层析法提取先兆子痫患者血清中的AT1-AAs。培养大鼠主动脉VSMCs。应用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)或AT1-AAs刺激培养的细胞。而后,采用免疫印迹法测定细胞中ERK1/2的表达;逆转录PCR检测细胞c-fos基因的表达;应用钙离子的荧光探针Fluo-3/AM负载培养VSMCs,应用共聚焦显微镜检测细胞荧光强度变化以反映细胞内游离钙水平的变化。结果 AT1-AAs能够发挥与血管紧张素Ⅱ类似的效应,能够激动AT1受体,促使ERK1/2的磷酸化并促进其下游的c-fos在VSMCs中的表达;并且ERK1/2的磷酸化一定程度依赖于钙离子信号。结论由于ERK1/2信号通过促进血管炎症、纤维化及血管收缩造成血管重塑,AT1-AAs可能通过该途径参与先兆子痫患者的循环障碍。     

Activation and subcellular distribution of ERK1/2 following cerebral ischemia/reperfusion in rat hippocampus

Objective： To investigate the activation （phosphorylation） and subcellular localization of extracellular signal-regulated kinase （ERK1/2）, as well as the possible mechanism, following cerebral ischemia and ischemia/reperfusion in rat hippocampus. Methods： Transient brain ischemia was induced by the four-vessel occlusion method in Sprague-Dawley rats. Western blot analysis. Results： During cerebral ischemia without reperfusion ERK1/2 activation immediately increased with a peak at 5 min and then decreased in the cytosol fraction, which was paralleled by the increase of ERK1/2 activation in the nucleus fraction. During reperfusion, ERK1/2 was activated with peaks occurring at 10 min in the cytosol and at 30 min in the nucleus, respectively. Under those conditions, the protein expressions had no significant change. In order to clarify the possible mechanism of ERK1/2 activation, the rats were intraperitoneally administrated with N-methyl-D-aspartate （NMDA） receptor antagonist dextromethorphan （DM）, L-type voltage-gated Ca^2＋ channel （L-VGCC） antagonist nifedipine （ND） 20 rain before ischemia, finding that DM and ND markedly prevented ERK1/2 activation of nucleus fraction induced by reperfusion, not by ischemia. Conclusion： These results suggested that the nuclear translocation mainly occurred during ischemia, while ischemia-reperfusion induced ERK1/2 activation both in the cytosol and the nucleus. Two type calcium channels contributed, at least partially, to the activation of ERK1/2.