显微注射法和精原干细胞介导法制备乙肝病毒X基因转基因小鼠的方法学比较

目的 探讨经济简便有效的制备转基因小鼠的方法。方法 分别将线形和环状乙肝病毒X基因表达载体pcDNA3-X按常规显微注射入小鼠受精卵。导入假孕雌鼠，同时应用微量注射针将脂质体包裹的pcDNA3-X表达麓体直接注入C57BL／6N小鼠雄性小鼠睾丸的曲细精管内，运用PCR法和免疫组化法对所有转基因仔鼠进行鉴定．比较这两种方法的优缺点．结果 显微注射法繁琐，技术要求高，阳性率相对较高，达16．6％。精原干细胞介导法技术简便．阳性率为6．25％。结论 初步证明用精原干细胞介导法是一种经济简便有效的制备X基因转基因小鼠的方法。     

乙型肝炎病毒X基因转基因小鼠的初步建立

HBx基因为HBV基因组上的一个开放读框,可编码具有转录反式激活作用的蛋白(HBxAg).已证实在体外HBxAg可使哺乳细胞株发生恶性转化[1].为了探索在体内HBxAg转化细胞的作用,国外数个实验室已相继建立了HBx转基因鼠模型[2,3].为研究HBx基因在肝细胞癌变过程中的确切作用提供有效的动物模型,我们初步建立了携带乙型肝炎病毒X基因的转基因小鼠,现报道如下.     

乙肝病毒X基因转基因树鼩模型的建立和病理学研究

目的:探索以精原细胞作为载体建立带乙肝病毒X基因的树鼩转基因动物模型的可行性.方法:首先构建带乙肝病毒pcDNA3.1- HBx基因的表达载体;然后以脂质体2000包被之.将此复合物以微量注射器注入8只雄性树鼩之睾丸组织中,1周后重复注射1次.注射后6周,使处理过的雄树鼩与雌性树鼩交配.在仔树鼩出生后1个月,取其肝组织作活检,并以多聚酶链式反应(PCR)对其DNA表达进行鉴定,观察其内是否存在乙肝病毒X基因.结果:处理的8只雄性树鼩中,6只具有生育能力,产仔树鼩11只.其中,1只仔树鼩乙肝病毒X基因阳性(阳性率9.09%).基因测序结果证实为乙肝病毒X基因.病理检查结果显示仔树鼩肝组织的改变包括:肝细胞坏死、慢性炎细胞在汇管区的浸润.结论:以精原干细胞作为载体,建立带乙肝病毒X基因的树鼩转基因动物模型是可行的.     

乙肝病毒转基因小鼠品系的建立和饲养管理

采用受精卵原核显微注射的方法，成功获得稳定整合乙肝病毒基因组ＤＮＡ的转基因小鼠。经ＰＣＲ、Ｄｏｔ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ或Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ等方法检测确认后的阳性鼠通过近交或回交的方式现已繁育到第７代，有望育成乙肝病毒转基因小鼠品系。     

乙肝病毒X基因与人肝细胞癌关系的研究

目的 探讨乙肝病毒（ＨＢＶ）Ｘ基因与肝癌发病的关系，为从分子水平上研究肝癌病因提供有关信息。方法 采用ＰＣＲ技术对ＨＢＶ不同状态的１０２例原发性肝细胞癌（ＰＨＣ）、３６例肝硬化（ＬＣ）及２８例慢性肝炎（ＣＨ）血清中ＨＢＶＸ基因进行了检测。结果 在ＨＢＶ５项标志均阴性的５３例ＰＨＣ检出Ｘ基因２０例（３７．７％），３１例ＬＣ中检出５例（１６．１％），１１例ＣＨ中检出２例（１８．２％）。所有ＨＢＶ Ｘ基     

乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立及培育

目的：建立可表达乙型肝炎病毒X蛋白的HBx基因（adr亚型）转基因小鼠模型，以研究x基因的功能。方法：采用基因重组技术构建含有CMV启动子和HBx基因（adr亚型）开放阅读框（ORF）的真核表达载体pcDNA3-HBx。该载体经Sal I限制性内切酶线性化后，琼脂糖电泳回收目的的片段，用原核显微注射法将其注射入雄原核，制备转基因小鼠。复合PCR法在基因组水平筛选HBx基因转基因小鼠founder；免疫组织化学法在蛋白水平检测X蛋白在这些小鼠中的表达情况。结果：成功构建了HBx基因真核表达载体pcDNA3-HBx。经原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后，出生并存活了11只新生鼠，经PCR检测后获得5只founder转基因小鼠，命名为C57－TgN(HBx)SMMU。免疫组织化学检测发现5只PCR阳性小鼠的肝细胞质中均有X蛋白的表达。将这5只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配，进行传代培育，复合PCR法筛选阳性转基因小鼠，目前已传至F4代。结论：本研究成功地产生了稳定遗传HBx基因并表达X蛋白的转基因小鼠C57－TgN（HBx)SMMU，它将有利于体内研究HBx基因在肝细胞癌发生中的作用。     

新生小鼠精原细胞分离和纯化的实验研究

目的：分离和纯化7～8d新生雄性小鼠精原细胞,为深入研究生精机理及其影响因素提供细胞来源和技术支持。方法：采用组合酶消化法制备7～8d雄性小鼠的生精细胞悬液：Percoll密度梯度离心法分离精原细胞,贴壁培养法进一步纯化精原细胞：滴片进行碱性磷酸酶染色：取同时间段雄性小鼠睾丸组织冰冻切片进行碱性磷酸酶染色。结果：精原细胞主要分布于45％～55％梯度间的Percoll中,经贴壁培养后纯度达75．2％。结论：用上述方法成功地分离和纯化了小鼠精原细胞。     

巢式PCR在乙肝病毒X基因检测中的应用

目的:探讨巢式PCR方法在乙肝病毒X基因(HBV X)检测中的意义.方法:随机抽取中国医学科学院肿瘤医院1998年1月至2000年12月的8例HCC标本石蜡切片,提取组织DNA,应用巢式PCR法进行HBV X基因检测.结果:在8例标本中,7例在200 bp～300 bp处出现条带,大小符合引物设计HBV X基因,检出率为87.5%.结论:应用巢式PCR法进行HBV X基因检测具有方法简单、敏感性高等特点,可用于石蜡切片等少量标本的检测.     

巢式PCR在乙肝病毒X基因检测中的应用

目的 :探讨巢式PCR方法在乙肝病毒X基因 (HBVX)检测中的意义。方法 :随机抽取中国医学科学院肿瘤医院 1 998年 1月至 2 0 0 0年 1 2月的 8例HCC标本石蜡切片 ,提取组织DNA ,应用巢式PCR法进行HBVX基因检测。结果 :在 8例标本中 ,7例在 2 0 0bp～ 30 0bp处出现条带 ,大小符合引物设计HBVX基因 ,检出率为 87.5 %。结论 :应用巢式PCR法进行HBVX基因检测具有方法简单、敏感性高等特点 ,可用于石蜡切片等少量标本的检测。     

血清乙肝病毒X基因的检测方法及意义

目的 探讨血清乙肝病毒（ＨＢＶ）Ｘ基因的检测方法及肝病患者Ｘ基因检测的意义。方法 通过ＰＣＲ扩增法探讨ＨＢＶ Ｘ基因的检测方法,对扩增产物的序列进行测序分析,并对３０例肝癌及３２例肝硬化患者血清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ与Ｘ基因进行检测。结果经琼脂糖电泳与序列分析表明,扩增产物与Ｘ基因序列一致。血清学检测显示,２例肝癌与２例肝硬化患者血清中Ｘ基因检测阳性,但ＨＢｓＡｇ检测阴性。结论 应用ＰＣＲ法能在血清中扩增出完整Ｘ基因片段,为研究Ｘ基因的序列变化与肝癌发生的关系提供了一个有效途径。部分肝病患者血清ＨＢｓＡｇ阴性,但在血清中能检出Ｘ基因,提示肝组织中存在Ｘ基因整合。     

乙肝病毒X基因对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响

目的 探讨乙肝病毒X基因(hepatitis B virus,HBX)对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响.方法 采用脂质体转染法将HBX真核表达载体pcDNA3.1-X转人人肝癌细胞HepG2中,建立表达HBX的HepG2/HBX细胞模型;以转染空载体pcDNA3.1的HepG2/pcDNA3.1细胞为对照,于转染后24、48、72、96 h收集细胞标本,行流式细胞术分析肝细胞凋亡率变化情况,RT-PCR、Western blot分别检测肝癌细胞内HBX和凋亡相关基因Fas、FasL表达以及JNK、c-Jun蛋白磷酸化水平情况.结果 转染24 h后HepG2/HBX细胞中即检测出HBX表达,且其表达量随时间延长而逐渐增高(P＜0.05);对照组细胞中各时间点均无HBX的表达.转染后各时间点,HepG2/HBX细胞与对照组细胞相比,细胞凋亡率均升高(P＜0.05),Fas、FasL表达量和JNK、c-Jan蛋白磷酸化水平亦均增高(P＜0.05);且HBX mRNA表达量与细胞凋亡率、Fas和FasL表达量以及JNK、c-Jun的磷酸化水平均呈正相关(P＜0.05).结论 HBx可通过上调JNK、c-Jun蛋白磷酸化水平而促进FasL蛋白的表达,从而诱导HepG2细胞凋亡.     

乙型肝炎病毒基因型别及X基因变异的研究进展

乙型肝炎病毒是一个以RNA为中间体的反转录复制病毒,由于RNA聚合酶缺乏校正功能,这使其突变率明显高于一般的DNA病毒,随着分子生物学研究技术的进展,不断有新的HBV基因型和亚型被发现。对和疾病进程、治疗相关的HBV基因型和X基因变异进行研究,有助于对疾病的控制和治疗提供更好的理论依据,在控制HBV感染上具有重要的意义。     

p21~(HBsAg/HBsAg)转基因小鼠肝脏病理学研究

Aworldtrendsuchasthefreetrade agreement(FTA)promoted bythe worldtrade organization(WTO)resultsinexpan-sion of bothimportation and exportation of industrial materials,grains,food products and domestic animals,as well aspets and wild animals.Nowadays,not onlyfoods but also various kinds of animals are arrivedfromall over the worldtoJapan,and anincrease inrisk of the invasion of zoonoses fromabroadto Japan was pointed out for many years.Thus,the Ministryof Health,Labor and Welfare(MHLW)of J…     

乙型肝炎病毒X基因蛋白诱导人类白细胞抗原DR表达

乙型肝炎病毒(HBV)所致的肝细胞坏死,被认为是与人类白细胞抗原(HLA)有关的MHC限制的T细胞为主的免疫应答的结果。本研究证实,转染HBV基因组或X基因后的人肝癌细胞系可诱导HLAⅡ(即HLA DR)表达。核转录及RNA杂交分析提示表达X基因的细胞其HLA DR mRNA水平增加,X蛋白增加该基因的转录。氯霉索乙酰基转移酶(CAT)基因分析进一步提示,X蛋白通过作用于HLA DR基因上游的调节序列诱导HLA DR表达。结果表明:X蛋白可能通过调节HLA DR表达参与HBV感染的免疫发病机理。     

深圳地区慢性HBV感染者血清中HBx基因多态性分析

目的:研究HBV感染者血清学模式与HBx基因多态性的关系。方法:采用聚合酶链反应、单链构象多态性和异源双链分析的方法对HBV感染者血清中HBx基因进行多态性分析。结果:在HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)、HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)和HBsAg(+)/HBcAb(+)血清学模式中,HBx基因双链区(nt1595-1881)多态性不明显(P(0.05),带形基本一致;HBx基因单链区(nt1365-1625)多态性明显,HBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+)模式PCR扩增产物条带数与HBsAg(+)/HBcAb(+)模式相比,差异显著(P(0.05)。结论:慢性HBV感染者不同血清学模式HBx基因存在多态性,其多态性主要表现在HBx基因单链区。     

精原干细胞移植受体鼠模型的建立

目的通过对4周龄昆明白小鼠腹腔内单次注射白消安来制作精原干细胞移植受体鼠模型。方法将实验动物分为4组,A、B、C组注射白消安的剂量分别是30 mg/kg4、0 mg/kg5、0 mg/kg体重,D组为对照组。注射后每天记录小鼠的存活情况,注射白消安后的20 d3、0 d4、0 d称量睾丸重量、测定血常规、制作并观察睾丸组织学切片、统计曲细精管的中空率。结果A、B、C、D组的死亡率分别是25.00%3、1.58%、80.00%、0.00%,注射白消安后30 d各组小鼠曲细精管中空率分别是45.25%、75.25%、1.50%、0.00%,白细胞、红细胞、血小板数量等血常规指标均恢复正常。结论腹腔内单次注射30 mg/kg或40 mg/kg剂量的白消安,死亡率较低(25.00%、31.58%),30 d后曲细精管中空率较高(45.25%7、5.25%)、血常规指标恢复正常,适合做精原干细胞移植受体。     

乙型肝炎病毒转基因小鼠中外源基因整合的检测

目的 :了解乙型肝炎病毒DNA序列在乙型肝炎病毒转基因小鼠中的整合情况。方法 :用头尾相接的乙型肝炎病毒全序列基因 ,通过原核显微注射法产生转基因小鼠 ,用C区特异性引物扩增鼠尾DNA检测整合 ,对其中 10只阳性鼠的扩增产物测序。结果 :12 8只仔鼠中 ,14只整合阳性。对 10只阳性鼠测序 ,9只与所转基因序列完全相同 ,1只在173 9、1740位缺失两个碱基。结论 :外源乙型肝炎病毒基因确实整合至小鼠基因组 ,多数为正常整合 ,但也存在缺失整合。     

HBV X基因及其调控序列的克隆

目的 构建一个含有ＨＢＶ Ｘ（ＨＢｘ）基因和它的调控序列的重组质粒。方法 通过ＰＣＲ法获取目的基因,将目的基因与ｐＧＥＭ－５ｚｆ（＋）Ｔ载体相连组成重组质粒,转入大肠杆菌ＪＭ１０９株后获得重组克隆。并分别通过ＰＣＲ、限制性内切酶酶切图谱和序列分析３种方法对重组质粒进行鉴定。结果 ＰＣＲ、限制性内切酶酶切图谱和序列分析均证实所获重组质粒中含有目的基因。结论 得到了含有ＨＢｘ结构基因及其上游调控序列的