大鼠胚胎下丘脑神经元体外培养的生长特点

用神经细胞体外培养技术,在光、电镜下进行定量组织化学、免疫组化方法观察17—18天大鼠胚胎下丘脑神经元体外生长发育过程。结果显示:细胞培养3天时,神经元以2个突起为主,占81％;1周时,神经元以3个突起为主,占51％;2周时神经元以3～4个突起为主,分别占37％和31％。定量组化结果显示神经元SDH、AChE含量随培养时间延长而增多,在第3天分别为64.2和3.8,1周时分别为98.2和12.8,2周时分别为127.6和24.6。免疫组化结果显示培养神经元在第3天时,神经元特异烯醇酶(NSE)呈阳性反应。上述结果提示,体外培养胚胎大鼠下丘脑神经元在第3天基本发育成熟。本文还对体外培养神经元的特点进行了详细的描述。     

胚胎小鼠肠道神经元的分离和原代培养

目的:建立一种简便的胚胎小鼠肠道神经元分离和培养方法。方法:分离12～13 d胎鼠肠道组织,制备单细胞悬液,用神经元专用培养基进行培养,观察神经元的生长情况。培养第3、5、7、9、14 d使用免疫细胞化学染色法,以β微管蛋白(Tu J1)反映神经元突起形态并用Sholl分析进行量化,以神经元核心抗原(Neu N)为标志物反映神经元的纯度。结果:培养24 h神经元贴壁,随培养天数延长神经元突起长度增加,数目增多,形态逐渐复杂,与邻近细胞突起相互连接,形成网络。与培养第3 d相比,第7、9、14 d神经元纯度明显增高(P 0.05)。结论:本方法分离培养的神经元纯度高,在神经元专用培养基中存活状态良好,未见胶质细胞明显增生。     

新生大鼠皮层神经元分离和培养方法的优化

目的:优化新生大鼠皮层神经元提取、培养的方法,以获得高纯度并且生长状态良好的神经元,为神经系统的体外研究提供实验技术.方法:取新生24 h内的SD大鼠皮层组织,通过单次消化法、分步消化法两种不同的消化方法制备单细胞悬液,并以3种不同接种密度铺板,采用Neurobasal-A培养基+2％B27+0.5 mmol/L L-...     

体外培养大鼠小脑神经元划痕模型的建立

目的:建立体外培养SD大鼠小脑神经元划痕模型。方法:用200μl塑料枪头划痕体外培养大鼠小脑神经元,观察相同视野下不同时间点(0,24,48 h)的划痕宽度。结果:倒置相差显微镜下可见划痕细胞后0 h即形成划痕区,边缘整齐。24 h后,划痕边缘变模糊同时划痕宽度变窄。48 h后,划痕宽度进一步缩小。结论:本模型简便经济,能较好地模拟脑损伤后神经元的迁移。     

体外培养脊髓神经元损伤后c-Jun蛋白表达

目的建立一个模拟脊髓全横断损伤后脊髓组分——原代培养的脊髓神经元损伤的模型。探讨中枢神经损伤后损伤应答基因c-jun的表达及变化。方法取Wistar大鼠(孕14d)脊髓,培养10～12d后,采用所设计的标准模板,直视下进行损伤。观察损伤前、后不同时间神经元的形态及即刻早期基因c-jun的表达及变化。结果脊髓神经元损伤10min后胞核即有c-Jun标记,损伤2h后最多,而且阳性神经元的密度与划痕之间的距离呈明显的反比关系。结论受机械损伤的神经元中,c-Jun表达阳性意味着此即刻早期基因产物已进入细胞核内起着“第三信使”的作用。     

体外培养大鼠皮质神经元兴奋性对Agrin表达的影响

本文目的在于观察体外培养神经元在兴奋性改变状况下其Agrin表达的变化,藉以了解Agrin与神经元发育的关系。采用高钾和低钾培养基培养皮质神经元,用免疫组织化学方法观察这些神经元Agrin表达的变化程度。结果表明,与正常组相比,高钾培养的皮质神经元在形态上无明显改变,神经元胞体的大小、突起的长短都与对照组接近;低钾培养神经元也仍能保持正常的形态,未发现明显的形态改变。免疫细胞化学结果提示,在高钾和低钾培养的皮质神经元中Agrin表达都明显增强,但高钾组的表达程度较低钾组为高。结论:神经元培养液中钾离子浓度所致的神经元活动是影响Agrin表达的重要因素。     

5-HT受体亚型在原代培养大鼠脊髓背角神经元的表达

为探讨脊髓背角内 5 -HT发挥作用的受体类型及其胞内信号转导机制 ,本研究首先利用免疫荧光技术对胎鼠脊髓背角神经元的产率进行了观察 ,再利用反转录 PCR方法观察了 5 -HT受体 14种亚型 m RNAs在原代培养神经元中的表达。原代培养的背角神经元生长状态良好 ,存活时间达到 14～ 2 1d。对培养的背角细胞用神经元特异性标志物—神经细胞核蛋白 (Neu N)进行免疫荧光检测的结果表明 ,神经元的产率超过 90 % ;用 PCR方法在培养的背角神经元中检测到了 5 -HT1 A、5 -HT1 B、5 -HT1 D、5 -HT1 F、5 -HT2 A、5 -HT2 C、5 -HT3、5 -HT4 、5 -HT5A、5 -HT5B、5 -HT6 和 5 -HT7等受体亚型 m RNAs的表达。但上述各受体亚型的表达水平存在差异 ,未检测到 5 -HT1 E和 5 -HT2 B受体亚型 m RNAs的表达。结果表明 ,本研究建立的实验方法可满意地获得原代培养脊髓背角神经元 ;这些神经元不但表达多种受体亚型 ,而且表达类型与以往在成年大鼠脊髓背角观察到的表达状况基本一致。上述结果为进一步开展 5 -HT作用机制的体外研究奠定了基础。     

大鼠原代脊髓微血管内皮细胞的体外分离培养及鉴定

目的:建立一种简单高效的大鼠原代脊髓微血管内皮细胞培养方法。方法:分离大鼠脊髓组织,经剪碎、细胞筛网过滤、Ⅱ型胶原酶消化后接种培养。通过细胞形态学观察、FⅧRag免疫细胞化学染色鉴定所培养的目的细胞。结果:接种的脊髓微血管段呈“短棍样”,培养24 h后有少量短梭形细胞从血管段周围迁移爬出,48 h后逐渐形成“岛屿状”的细胞集落,72 h后细胞铺满皿底,呈典型的单层、“鹅卵石样”、镶嵌式排列生长;细胞FⅧRag免疫细胞化学染色显示细胞质呈棕红色,表达为阳性。结论:该方法可成功分离培养出活性好、纯度高的大鼠原代脊髓微血管内皮细胞。     

胚胎大鼠脊髓运动神经元的体外培养及鉴定

本实验建立了体外胚胎大鼠脊髓运动神经元的分离培养,并进行鉴定。取孕15d SD大鼠胚胎的脊髓腹侧组织,用胰蛋白酶和胶原酶消化分离成单细胞悬液,进行原代细胞培养,应用神经元特异性的烯醇化酶(NSE)抗体和抗神经微丝抗体-SMI32单克隆抗体对培养细胞进行鉴定,同时行尼氏染色。结果分离培养的细胞鉴定为脊髓运动神经元(SMN),SMN在体外适宜的条件下可存活4周左右,可作为神经科学研究的一种手段。     

胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养与定向分化为胆碱能神经元的研究

为了研究胚胎大鼠脊髓源神经干细胞(ESCSCs)的培养和体外分化为胆碱能神经元的情况,本文从孕龄13d的胚胎大鼠脊髓组织中分离获得神经干细胞,采用含表皮生长因子(EGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清限定性培养基培养,并通过添加维甲酸(RA)、音猬因子(SHH)和神经营养因子-3(NT-3)等诱导因子,进行干细胞体外诱导,用免疫荧光细胞化学方法观测其向胆碱能神经元分化的情况。结果表明:从胚胎脊髓中可分离得到大量的神经干细胞,通过含EGF和bFGF的限定性培养基培养可获得干细胞球,通过添加RA、SHH和NT-3等诱导因子后,可见有胆碱能神经元生成。本研究结果提示,胚胎大鼠脊髓神经干细胞在添加EGF与bFGF的限定性培养基中可以增殖并长期保持稳定的ESCSCs性状,在添加特殊因子的条件下,并在体外ESCSCs可以被定向诱导分化为胆碱能神经元。     

BDNF对体外培养的大鼠脊髓前角神经元内突触素Ⅰ与突触囊泡素表达的影响

探讨BDNF对体外培养的大鼠脊髓前角神经元内突触素I与突触囊泡素(SYN)表达的影响。取孕14d大鼠子宫内胎鼠的脊髓腹侧部分神经元,体外有血清培养。在培养7d后,随机分成对照组、BDNF组和抗BDNF组。BDNF组培养液中加入BDNF(20ng/ml),抗BDNF组培养液中加入BDNF抗体(20μg/ml),对照组加入等量Hanks液。3d后在倒置显微镜下计数三组神经元存活数,并用NF200、MAP2、NSE的免疫组化反应对神经细胞进行鉴定。行突触素I与SYN免疫组化反应,对部分细胞行突触素ImRNA原位杂交反应,运用图像分析系统对突触素I与SYN免疫组织反应阳性产物以及突触素I原位杂交反应阳性产物作光密度分析。结果发现有血清培养时各组脊髓前角神经元的存活数无显著差异(P>0.05);BDNF组突触素I与SYN免疫反应阳性产物的平均光密度值高于其它两组,抗BDNF组最低(P<0.01)。BDNF组突触素ImRNA阳性产物的平均光密度值明显高于其它两组,抗BDNF组突触素ImRNA阳性产物的平均光密度值最低(P<0.01)。本研究结果提示BDNF对有血清培养时脊髓前角神经元的存活没有明显影响,但BDNF可明显上调培养的脊髓前角神经元内突触素I与SYN的表达。     

脊髓提取液对体外培养的神经细胞在缺气损伤环境中的作用

本实验目的在于研究小鼠胚胎脊髓提取液对损伤环境中的体外培养脊髓和背根节神经细胞的保护作用。神经细胞取自１２～１４ ｄ 胚胎小鼠脊髓和背根节,接种于２４ 孔板中。培养第５ ｄ 时在培养板中加入２５０ ｍ ｇ／Ｌ 脊髓提取液,对照组不加;培养第１０ ｄ 在液体表面加入液体石蜡造成缺气损伤。继续培养４、８、１２、２４ ｈ,然后去除液体石蜡,观察细胞形态和Ｋ＋ 、ＬＤＨ 的变化,用Ｍ ＴＴ 方法检测细胞活性,通过ＮＳＥ免疫组化反应显示神经元存活状况。结果表明：损伤神经元出现细胞肿胀、失去折光性、核偏位以及ＮＳＥ 染色变弱;而在培养液中加入脊髓提取液,可以减轻这种“缺气”造成的损伤,提高体外培养神经元在损伤环境中的生存率,保持细胞的活性和细胞膜的通透性。     

大鼠脊髓P物质受体定位分布的免疫细胞化学研究

用免疫细胞化学技术对大鼠脊髓和脊神经节内Ｐ物质受体的定位分布进行了系统的研究。结果证明，Ｐ物质受体阳性胞体和树突主要密集地分布于脊髓全长的Ⅰ层，此外，还发现Ⅱ层的外侧部出现少量阳性胞体和树突，来自Ⅲ层的阳性树突穿过Ⅱ层后进入Ⅰ层；Ⅲ～Ⅳ和Ⅹ层也可见中等密度的阳性胞体和树突；Ⅵ层和Ⅶ层仅见少量阳性胞体和树突，但胸髓中间带外侧核、骶髓副交感运动核、骶髓后连合核内可见大量浓染的阳性胞体和树突；Ⅷ、Ⅸ层、Ｏｎｕｆ氏核、外侧颈核和外侧脊索核也有阳性胞体和树突．灰质内的阳性胞体的树突还伸向前索和外侧索，有时可达脊髓的边缘．此外，脊神经节内也可见少量散在且均匀分布的小型阳性胞体．     

P物质免疫反应纤维在鼠脊髓内的分布

本文应用免疫细胞化学PAP法研究了大鼠脊髓全长的P物质(SP)免疫反应纤维和终末的分布和定位。结果表明:SP免疫反应阳性纤维和终末分布在脊髓全长各节段和各板层内,并只有其分布特点。呈很高密度反应者有后角Ⅰ、Ⅱ层,呈商密度反应有Lissauer氏束,外侧颈核、胸髓侧角、低副交感核和X层;呈中等密度或低密度反应有Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ和Ⅸ层。本研究从形态学上进一步证实SP免疫反应纤维和终末广泛存在于脊髓全长内,这提示SP作为递质参与脊髓感觉、躯体运动和植物性等功能,且起着重要作用。     

大鼠脊髓发育过程中神经干细胞的分布

本研究应用BrdU注射技术及免疫荧光染色技术检测正常大鼠发育中脊髓内BrdU、PCNA、nestin阳性细胞分布情况。结果显示,胚胎12.5d(E12.5)时,BrdU阳性细胞分布于神经管全层,阳性标记率最高。随胚龄增加,大鼠脊髓内BrdU阳性细胞标记率降低。PCNA阳性细胞分布和变化规律与BrdU阳性细胞一致。正常成体动物脊髓内较难检测到增殖细胞。胚胎发育早期脊髓脑室带、套层、缘层均可检测到nestin阳性细胞。随大鼠脊髓发育成熟,nestin阳性细胞数量逐渐减少。本研究结果提示,脊髓源性神经干细胞的分布有时空规律性。随大鼠脊髓发育的逐渐成熟,增殖细胞减少,干细胞标记逐渐消失,因此在E12左右分离脊髓源性神经干细胞较适宜。     

胎鼠脊髓原代培养神经元蛋白激酶C与突起生长关系的研究

本研究的目的在于通过观察大鼠脊髓原代培养神经元生长过程中 α、β 、β 、ε四种蛋白激酶 C亚型在胞体和突起中的表达与分布以及其总活性的动态变化 ,了解蛋白激酶 C与神经突起生长间的关系。结果表明 ,随着神经突起的生长 ,蛋白激酶C四种亚型的表达及总活性均发生规律性的变化。本研究提示 ,神经突起的生长以及其形态和功能的维持均离不开蛋白激酶 C的活性     

大鼠三叉神经脊束核尾侧亚核和脊髓向丘脑和臂旁核的谷氨酸能投射

本研究用荧光金逆行追踪与免疫荧光组比技术相结合的方法,对大鼠三叉神经脊束核尾侧亚核和脊髓向丘脑和臂旁核的谷氨酸能投射进行了观察。磷酸激活的谷氨酸胺酶（PAG）是谷氨酸能神经元的特异性标识物。PAG样阳性胞体主要位于三叉神经脊束核尾侧亚核和颈髓背角的Ⅰ层,少量PAG样阳性胞体也见于它们的Ⅱ层外侧部及外侧网状核。将荧光金注入丘脑腹基底复合体后．荧光金逆标神经元主要见于对侧三叉神经脊束核尾侧亚核和颈髓背角的Ⅰ层及外侧网状核;将荧光金注入臂旁核后,荧光金逆标神经元也主要见于对侧三叉神经脊束核尾侧亚核和颈髓背角的Ⅰ层及外侧网状核。三叉神经脊束核尾侧亚核向丘脑腹基底复合体投射神经元的12．4％,向臂旁核投射神经元的13．2％呈PAG样阳性;颈髓背角浅层向丘脑瓜基底复合体投射神经元的12．7％,向臂旁核投射神经元的14．3％呈PAG样阳性。向丘脑腹基底复合体和臂旁核投射的PAG／荧光金双标神经元分别占三叉神经脊束核尾侧亚核浅层内PAG样阳性神经元总数的13％和24．6％,向丘脑腹基底复合体和臂旁核投射的PAG／荧光金双标神经元分别占颈髓背角浅层内PAG样阳性神经元总数的11．6％和30．1％。外侧网状核内的部分PAG样阳性神经元也向丘脑腹基底复合体或臂旁核投射。Ⅰ层内的双?     

妊14脊髓植入成鼠损伤脊髓前后的发育分化

在光电镜下观察了Ｅ１４胎鼠脊髓及其被植入成鼠损伤脊髓后７，１５，３０，６０，１２０和２４０天时的结构变化。结果表明：Ｅ１４胎鼠脊髓主要由神经上皮细胞和神经母细胞构成。前者的超微结构特征是胞浆内富含游离核糖体，后者是在游离核糖体的基础上出Ｇｏｌｇｉ丛，仙质网等细胞器。