受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。     

转录因子CBF4诱导型启动子的克隆及功能分析

根据已有文献及公开的拟南芥基因组序列,利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA中扩增得到了转录因子CBF4上游的DNA片断,对其进行序列分析表明与GenBank序列高度同源,同时对其进行初步的功能分析。采用生物信息学方法对这一序列分析的结果显示这一片段具有启动子的特殊结构域;与GUS基因融合构建双元表达载体,转化烟草的组织特异性表达检测可见明显的GUS活性,初步表明所获片断为CBF4基因的诱导型启动子。     

水稻干旱诱导型启动子的研究进展

目前在水稻转基因技术中使用的启动子多为组成型启动子,其表达不受植物体内外环境变化的影响,逆境诱导型启动子能够响应于逆境变化而灵活调控转录,因此比组成型启动子更适合控制抗逆基因的表达。筛选一定数量有实际应用价值的干旱诱导型启动子,有利于推动植物转基因技术的发展,满足抗性品种培育的实际需求,也有助于深入了解干旱等逆境条件对植物生长、发育的影响及植物对胁迫的响应机制。本综述结合目前的研究现状,对水稻干旱诱导型启动子的来源、上游元件特点和研究方法进行介绍,为水稻诱导型启动子的筛选、应用和胁迫响应研究提供参考。     

水稻胚乳特异性启动子Gt1的克隆及其功能验证

以水稻品种"密阳46"的DNA为模板, 用PCR方法从水稻谷蛋白基因Gt1上游序列扩增出特异性条带, 并克隆出种子特异性启动子. 经鉴定, 它的长度为929 bp, 与Takaiwa(1987)报道的序列仅有12个核苷酸的差异, 已知的功能部位序列没有发生改变. 用它构建了带动报告基因Gus表达的双元载体, 并用农杆菌介导法转化水稻得到了转基因植株.     

稻瘟病菌激发子诱导的水稻叶片mRNA差异表达研究

本文主要以广州优势水稻稻瘟病菌小种ZC13(97-151a)和以CO39为背景的水稻近等基因系C101LAC为材料,研究水稻激发子与稻瘟病菌之间的互作关系。采用mRNA差异显示技术,将得到的可能差异条带进行重扩增和纯化,最后得到差异显著的条带,采用重复试验,对重复性好且稳定的部分条带利用pMD18-T载体及大肠杆菌DH5α进行克隆测序,NCBI比对分析,发现某些差异片段与水稻的激酶及锌指蛋白有较高的同源性。     

葡萄逆境胁迫诱导启动子的克隆及表达分析

为了研究葡萄抗逆基因(CAN70200.1)的表达特性,采用PCR技术从葡萄中克隆了CAN70200.1基因上游一段长度为1 354 bp的启动子片段,命名为PCAN。采用Plant CARE和PLACE启动子在线预测工具分析表明,PCAN启动子序列具有CAAT-box、TATA-box基本的顺式作用元件和一些参与非生物胁迫、光和植物激素应答相关的顺式作用元件。为验证启动子的表达特性,将PCAN启动子连接到p CAMBIA1391Z载体GUS基因的上游,构建成植物表达载体p1391Z-CAN,并通过农杆菌介导法转化烟草,经PCR鉴定,获得转基因植株。对转基因烟草植株进行逆境胁迫处理发现,在干旱处理120 min后,PCAN启动子活性达到最强;而4℃低温处理30~60 min时,PCAN启动子活性达到最强,表明PCAN启动子具有低温和干旱胁迫诱导表达特性。     

稻瘟病菌与水稻互作研究进展

为了更好的防控稻瘟病的发生,为水稻育种工作和新药研发提供科学依据,深入了解稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)与水稻相互作用的机制是非常必要的。本文归纳了稻瘟病菌侵染水稻的机制、水稻对稻瘟病菌侵染的信号识别及其下游反应以及识别后诱导水稻产生的防御反应机制,分析了水稻防御相关基因的表达调控以及利用分子育种手段提高水稻抗病性的相关策略。稻瘟病菌侵染水稻后,植株会通过细胞壁加厚、病程相关蛋白表达以及病原菌侵入位点细胞程序性死亡等系统免疫反应来抵御稻瘟病菌的侵染;因此指出通过基因工程手段诱导植物发生免疫反应来抵御稻瘟病菌的危害具有重要的现实意义,也是防治病害最有效和最经济的方法;而且,作为研究病原菌—植物互作的模式系统,深入了解稻瘟病菌与水稻的互作机制,也为通过诱导水稻防御基因的表达来防治其他重要真菌性病害提供了科学依据。     

转抗稻瘟病基因水稻遗传和表达的初步研究

稻瘟病是水稻三大病害之一,长期的生产实践证明,水稻抗瘟性品种的选育和利用是防治稻瘟病行之有效的措施。溶菌酶是一个广泛分布的酶家族,并且具有几丁质酶的活力,能够分解细菌或真菌细胞壁组分中多糖的糖苷键,从而抵御病原菌的侵染。本文以转溶菌酶基因水稻的10个株系当代及其后代为研究对象,对其农艺性状以及它们对稻瘟病的抗性水平变化进行研究,并利用PCR检测来研究外源基因在转基因株系各世代中的分离规律。结果表明:在R0、R1代群体中农艺性状、外源基因分离情况比较大,在R2代群体中只有个别株系分离较大。在R0代群体中单株之间的表现差异可能是由外源基因插入的位点和拷贝数不同而造成的,R1代表现出来的群体差异要比当代更大,在R1代中的差异可能是由于当代植株中的外源基因是杂合型,分离世代造成的,在R2代群体中由于外源基因趋于纯合,群体中株系相差小,同对照水平接近。与未转化株系比较,转基因植株进行了苗瘟、叶瘟和穗茎瘟的鉴定,在转基因的两个品系中溶菌酶基因的插入整合提高了转基因株系的抗稻瘟病的能力。     

稻瘟病菌的遗传学研究

稻瘟病菌除感染水稻引起的稻瘟病外，还危害多种禾谷类作物及禾本科杂草。稻瘟病菌属易变异菌。不断出现新的生理小种，造成了生产推广品种的抗性丧失，研究稻瘟病菌的遗传学，有助于探明该菌的小种变化规律，为抗病育种提供理论依据。     

7种杀菌剂对稻瘟病菌和水稻纹枯病菌的室内毒力测定

水稻稻瘟病和纹枯病是水稻上重要的真菌性病害,化学防治是其主要防控措施之一,本研究旨在通过室内毒力测定筛选对稻瘟病菌和水稻纹枯病菌毒力作用强的杀菌剂。采用菌丝生长速率法测定了7种杀菌剂制剂对水稻稻瘟病菌和纹枯病菌的室内毒力作用。测定结果表明,在3种琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)类杀菌剂制剂中,6.25% Fluindapyr（研发代号IR9792）EC对稻瘟病菌毒力作用最强,EC50为1.01 mg/L;在3 种甲氧基丙烯酸酯(Strobilurin)类的杀菌剂制剂中25%吡唑醚菌酯EC对稻瘟病菌毒力最高,EC50为0.01 mg/L;三唑硫酮类杀菌剂48%丙硫菌唑SC对稻瘟病菌的EC50为0.70 mg/L。对于纹枯病菌,琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)类的24%噻呋酰胺SC对纹枯病菌毒力最高,EC50为0.07 mg/L;甲氧基丙烯酸酯(Strobilurin)类的20%丁香菌酯SC对纹枯病菌的毒力强,EC50为0.52 mg/L;48%丙硫菌唑SC对纹枯病菌的EC50为1.19 mg/L。研究结果为上述杀菌剂的进一步开发和应用提供了一定的基础。     

黑龙江省水稻品种对稻瘟病的抗性分析及评价利用

采用室内苗期抗谱鉴定的方法,选取178个稻瘟病菌株对黑龙江省13个主栽品种的抗稻瘟病进行了鉴定。从品种对整个黑龙江省稻瘟病菌株的抗性来看,龙粳14和龙盾104抗性最好,抗谱分别为93．82％和93．26％。从品种对适宜积温带稻瘟病菌株的抗性来看,绥粳7和龙盾104分别是第2和第3积温带抗瘟性最好的品种,抗谱分别为73．08％和95．40％。此外,还利用生物间遗传学关于联合抗病性分析的方法。分析了品种搭配在生产上的应用前景,联合抗病性系数最高的组合是龙稻7和绥粳7,联合毒性系数最低的组合是绥粳4和垦稻10。     

小麦穗发芽抗性相关Vp1基因启动子的分离及功能验证

成熟期穗发芽严重影响小麦产量和品质。Vp1是调节胚发育, 促进胚成熟和休眠的重要转录因子, 对小麦种子休眠和穗发芽抗性具有重要作用。本研究分离了普通小麦B基因组Vp1基因的启动子, 生物信息学预测结果表明, 其含有9个脱落酸响应元件ABRE、2个DREB和6个MYB干旱响应元件、3个赤霉素响应元件GARE、1个水杨酸响应元件TCA-E、2个茉莉酸甲酯响应元件TGACG-motif、4个SKn-1和1个RYREPE胚乳特异表达元件。采用5′端缺失的方法, 构建了系列含Vp1启动子不同区段融合GUS报告基因的瞬时表达载体和植物表达载体。通过基因枪转化小麦愈伤组织, 瞬时表达结果显示, Vp1启动子在无诱导的情况下不能启动GUS基因表达, 在低温、ABA、GA、PEG和NaCl诱导后可以启动GUS基因表达, 表现诱导表达特性, 且其诱导表达强度随启动子缺失片段长度变短而减弱。利用Gateway方法成功构建了6个启动子各缺失片段类型的植物表达载体, 并通过农杆菌介导转化四倍体小麦Stewart, 获得转基因植株。该启动子可有效启动GUS基因在转基因植株的花药、糊粉层、穗轴及根中表达, 其他组织中没有表达。当启动子片段大于660 bp时, 外源ABA可诱导启动子启动GUS基因在转基因植株茎节中的表达。     

拟南芥热激启动子AtHSP70b的克隆与功能分析

从拟南芥Columbia生态型(Arabidopsis thaliana)的基因组DNA中扩增出热激启动子AtHSP70b基因,并检测其热激表达的严谨性。将热激启动子AtHSP70b插入到pSAU2008的gus基因及NOS终止子上游,构成热激启动子控制GUS报告基因的表达盒“AtHSP70b-GUS-Tnos”,并将其插入到pVCT2020中得到表达载体pV-HSP70bGUS。通过冻融法将其导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404,并转化烟草(W38)获得再生植株,通过PCR检测鉴定,表明“AtHSP70b-GUS-Tnos”表达盒已整合到烟草基因组中。并转化烟草检测启动子的表达活性。序列分析表明,克隆的启动子长度204bp与目前已经发表的启动子序列完全一致。GUS组织化学法检测证明启动子AtHSP70b在烟草中具有高温诱导表达的能力。但在常温下也有不同程度的表达,因此需要对该启动子进行序列改造以增强其热激表达的严谨性。     

稻瘟病菌一个假定的漆酶基因功能分析

漆酶可能是病原真菌毒力因子之一。稻瘟病菌基因组共有16个假定的漆酶类基因,对其中的Mgg_00551.5进行了生物信息学和分子遗传学分析,以明确其功能。生物信息学分析表明该漆酶是具有3个多铜氧化酶结构域、可以分泌到胞外的蛋白。经基因敲除表明,Mgg_00551.5功能缺失突变体ΔMG0551-13的漆酶活性比野生型菌株稍低,但是其生长速度、产孢能力、致病性等方面与野生型菌株相比均无明显差异,可能是功能冗余所致。进一步的双突变或多突变可能是明确漆酶功能的重要方法。     

水稻组织特异型人工合成启动子的设计、构建及功能鉴定

合成启动子是合成生物学的一个重要研究领域及研究热点。水稻是世界上最重要的粮食作物之一,亦是禾本科作物功能基因组研究的模式植物。本研究旨在对水稻组织特异表达启动子的合成作有益尝试。根据已发表的文献选取了一些与组织特异表达相关的顺式元件,将它们以不同的方式组合并连接Mini 35S核心启动子以驱动GUS报告基因的表达。转基因水稻的GUS组织化学染色和酶活测定结果证实,通过上述方法在水稻中成功构建出组织特异型合成启动子,同时也揭示了顺式元件在合成启动子中不同的组合方式对启动子的表达活性和表达模式起着关键作用。本研究为植物合成启动子的设计思路和构建方法提供了有益信息和实践基础。     

部分水稻品种对稻瘟病菌群体的抗病性分析

利用生物间遗传学关于毒力频率和联合抗病性分析的方法，分析了16个品种对稻瘟病菌群体的抗瘟性。结果表明，参试病菌群体对各个品种的毒力以及不同稻区的病菌群体对同一品种的毒力均存在明显差异，筛选出毒力频率较低的4个品种：汕优多系1号、Ⅱ优多系1号、金优431和金优多系1号。用联合致病性系数和联合抗病性系数分析了品种搭配在生产上的应用前景。     

拟南芥AtNUDT10启动子的分离及其功能分析

根据已发表的拟南芥基因组序列设计合成一对引物,以拟南芥基因组DNA为模板克隆AtNUDT10上游非编码区,并与pBAR-GUS3相连构建了植物表达载体pNUDT10P-GUS,采用农杆菌GV3101介导的渗透法转化野生型拟南芥,通过除草剂筛选获得了一批抗性纯合子转基因植株。然后对转基因植株2周幼苗进行GUS活性的组织化学染色分析,并对3.5~4周的转基因植株叶片进行病原菌诱导表达分析。结果表明,已获得AtNUDT10启动子,该启动子为组成型表达的启动子,并且病原菌Pst.DC3000及Pst.DC3000 AvrB对该启动子没有诱导作用。     

2007-2008年江苏省稻瘟病菌遗传多样性

利用致病性测定及Pot2-rep-PCR技术对2007、2008年采集自江苏省五大稻区的稻瘟病菌株进行多样性分析,这2年的菌株被划分为10个小种和14个系谱,其中ZG1为优势小种,JSL5为优势系谱,研究结果表明:江苏稻瘟病菌具有丰富的多样性,但与1999 - 2002年的群体结构比较时发现,群体结构趋于简单;对病原菌...