重组酶介导的隐孢子虫属特异性等温核酸扩增 方法的建立及评价

目的　建立一种可用于隐孢子虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增（RAA）方法,并对其检测敏感性和特异性进行评价。方法　以隐孢子虫属特异性18S rRNA核酸序列作为检测靶标,采用Amplfix软件设计、合成引物及荧光检测探针,构建并优化RAA荧光反应体系;分别以不同拷贝数的含18S rRNA靶序列的重组质粒、不同浓度隐孢子虫卵囊基因组DNA及不同数量隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行RAA荧光法检测,以评价其敏感性;分别以隐孢子虫卵囊、蓝氏贾第鞭毛虫包囊、日本血吸虫虫卵、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫虫卵、沙门氏菌、志贺氏菌基因组DNA为模板进行RAA荧光法检测,以评价其特异性。结果　成功建立了隐孢子虫检测RAA法,该方法可在39 ℃、20 min内得到隐孢子虫属18S rRNA基因片段的有效扩增。以不同拷贝数的含18S rRNA靶序列的重组质粒、不同浓度隐孢子虫卵囊基因组DNA及不同数量隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板,该方法最低检出限分别为102拷贝/μL、1 pg/μL和1个/50 μL;以蓝氏贾第鞭毛虫包囊、日本血吸虫虫卵、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫虫卵、沙门氏菌、志贺氏菌基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果均为阴性。结论　成功建立了一种可用于检测隐孢子虫卵囊DNA的RAA法,该方法操作简便、反应快速,敏感性和特异性均较好。     

重组酶介导的蓝氏贾第鞭毛虫特异性等温核酸扩增方法的建立及评价

目的　建立基于重组酶介导的等温扩增技术（RAA）的蓝氏贾第鞭毛虫核酸检测方法,并评价其检测敏感性和特异性。方法　选择蓝氏贾第鞭毛虫β?贾第素（β?giardin）基因作为检测靶基因,设计、合成特异性检测引物及荧光探针,建立荧光RAA检测体系。分别以不同拷贝数的重组质粒（含β?giardin基因靶序列）和不同浓度蓝氏贾第鞭毛虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以蓝氏贾第鞭毛虫、日本血吸虫、华支睾吸虫、微小隐孢子虫、似蚓蛔线虫、沙门氏菌及志贺氏菌基因组DNA为模板进行扩增,评价其检测特异性。结果　成功建立了蓝氏贾第鞭毛虫荧光RAA检测方法,其可在等温（39 ℃）条件下实现对靶基因片段的快速、特异性扩增（20 min内）。分别以重组质粒和蓝氏贾第鞭毛虫基因组DNA为模板,该方法的检测敏感性可达102拷贝/μL和1 pg/μL;以日本血吸虫、华支睾吸虫、微小隐孢子虫、似蚓蛔线虫、沙门氏菌及志贺氏菌基因组DNA为模板的RAA检测结果均为阴性,具备较好特异性。结论　建立了一种操作简便、敏感、特异的可用于蓝氏贾第鞭毛虫核酸检测的荧光RAA方法。     

重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价

目的　建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法（RAA）。方法　以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列,设计、合成、筛选特异性引物和探针,建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法。分别以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒和不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性;通过抽提含华支睾吸虫虫卵的粪便及含囊蚴的淡水鱼肉样本DNA并进行荧光RAA扩增,初步评价其检测现场样本的能力。结果　成功建立了华支睾吸虫检测荧光RAA法,其可在39 ℃ 20 min内实现对华支睾吸虫DNA的特异性扩增。以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板,该方法最低检出限为10 拷贝/μL;以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板,该方法最低检出限为3 pg/μL;以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩蚴及曼氏血吸虫基因组DNA为模板,检测结果均为阴性。该方法可成功检出感染华支睾吸虫的人体、大鼠粪便样本以及麦穗鱼样本,具备较好的现场样本检测能力。结论　成功建立了一种简便、快速、敏感、特异的可用于华支睾吸虫检测的RAA法。     

重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价

目的　建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法（RAA）。方法　以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列，设计、合成、筛选特异性引物和探针，建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法。分别以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒和不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增，评价其检测敏感性；分别以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增，评价其检测特异性；通过抽提含华支睾吸虫虫卵的粪便及含囊蚴的淡水鱼肉样本DNA并进行荧光RAA扩增，初步评价其检测现场样本的能力。结果　成功建立了华支睾吸虫检测荧光RAA法，其可在39 ℃ 20 min内实现对华支睾吸虫DNA的特异性扩增。以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板，该方法最低检出限为10 拷贝/μL；以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板，该方法最低检出限为3 pg/μL；以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩蚴及曼氏血吸虫基因组DNA为模板，检测结果均为阴性。该方法可成功检出感染华支睾吸虫的人体、大鼠粪便样本以及麦穗鱼样本，具备较好的现场样本检测能力。结论　成功建立了一种简便、快速、敏感、特异的可用于华支睾吸虫检测的RAA法。     

重组酶介导的等温核酸扩增技术检测多房棘球绦虫方法的建立及初步应用

目的基于重组酶介导的等温扩增技术(Recombinase-aided isothermal amplification assay,RAA)建立一种快速检测多房棘球绦虫的核酸检测方法,并进行检测效果评价。方法以多房棘球绦虫线粒体基因序列(GenBank登录号:AB018440)作为靶序列,根据RAA反应原理设计并合成引物,利用该引物进行RAA扩增。以聚合酶链反应(PCR)作为平行对照,应用RAA方法扩增不同稀释浓度的多房棘球绦虫基因组DNA及梯度稀释的含不同拷贝数目的基因片段的pMD19-T(Simple)克隆质粒,以评价RAA检测的敏感性。应用此方法检测细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA,以评价其特异性。在对建立的方法进行条件优化后,检测9份感染多房棘球蚴的动物组织样本、3份模拟现场多房棘球蚴感染阳性犬粪样本以及2份现场阳性犬粪样本,以验证所建立的RAA方法的可靠性和实用性。结果所建立的RAA法可在40 min内特异性扩增多房棘球绦虫目的基因片段。以多房棘球绦虫基因组DNA为模板,RAA法最低检测量为10 pg;以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10^4个。以细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA为模板,应用所建立的RAA法扩增结果均为阴性。应用本研究建立的RAA法检测感染多房棘球蚴的动物组织样本以及模拟和现场阳性犬粪便样本结果均为阳性,且与PCR法检测结果一致。结论本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA检测方法,其在多房棘球绦虫虫种鉴定以及棘球蚴病基因诊断方面展现出较好应用前景。     

重组酶介导的核酸等温扩增荧光法快速检测 日本血吸虫感染性钉螺

目的　建立重组酶介导的核酸等温扩增荧光（Recombinase aided amplification,RAA）法快速检测日本血吸虫感染性钉螺技术,并探索钉螺样品的最佳处理方式。方法　将钉螺样本分成3组,每组均含7个亚组,其中6个亚组分别为50只阴性钉螺中混合1、2、3、4、5、10只日本血吸虫感染性钉螺,1个亚组为100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺。3组钉螺分别采用压碎去壳核酸试剂盒提取法、压碎去壳核酸粗提法和直接压碎带壳核酸粗提法进行处理,并分别进行荧光RAA与PCR法检测,对检测结果进行比较。结果　建立了荧光RAA检测技术,工作温度为39 ℃,30 min内即可完成日本血吸虫感染性钉螺检测。钉螺群体样本采用压碎去壳核酸试剂盒提取法处理后,荧光RAA法最低可检测到100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺,PCR法最低可检测到50只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺;采用压碎去壳核酸粗提法处理后, 荧光RAA法最低可检测到100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺,PCR法最低可检测到50只阴性钉螺中混合3只感染性钉螺;采用直接压碎带壳核酸粗提法处理后,荧光RAA法最低可检出50只阴性钉螺中混合10只感染性钉螺,PCR法仅可检测出50只阴性钉螺中混合10只感染性钉螺。结论　成功建立了钉螺群体样本中日本血吸虫感染性钉螺快速检测的荧光RAA法,该方法具有快速、灵敏、操作简便等特点;压碎去壳核酸粗提法为钉螺样品的最优处理方式。     

基于重组酶介导核酸等温扩增技术的日本血吸虫特异性基因片段核酸试纸条检测方法的建立

目的　结合重组酶介导核酸等温扩增技术（recombinase⁃aided isothermal amplification assay,RAA）和核酸试纸条建立一种快速检测日本血吸虫特异性基因片段的方法。方法　以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,设计并合成引物、荧光探针,建立日本血吸虫核酸试纸条检测方法。通过检测不同拷贝数的含SjG28基因片段的重组质粒和不同浓度的日本血吸虫成虫基因组DNA,对该方法敏感性进行评价;通过检测华支睾吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩口线虫、埃及血吸虫、巴贝斯虫和卫氏并殖吸虫基因组DNA,对该方法特异性进行评价。结果　以重组质粒为模板,建立的日本血吸虫特异性基因片段核酸试纸条检测方法最低检测限为10拷贝/μL;以成虫基因组DNA为模板,最低检测限为1 pg/μL。该方法检测华支睾吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩口线虫、埃及血吸虫、巴贝斯虫和卫氏并殖吸虫基因组DNA结果均为阴性。结论　本研究结合RAA技术和核酸试纸条建立了一种可快速、简便、可视化检测日本血吸虫特异性基因片段的核酸试纸条法。     

重组酶介导的核酸等温扩增荧光法检测日本血吸虫感染性钉螺的效能评价

目的 评价重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)荧光法检测日本血吸虫感染性钉螺的效能.方法 采用群体法检测.每50只钉螺作为1个检测样本,阴性样本不含感染性钉螺,阳性样本含不同数量感染性钉螺.设置阴性样本10个和分别含有1、2、3只感染性钉螺的阳性样本各10个...     

基于重组酶介导等温扩增技术的细粒棘球绦虫核酸检测方法的建立

目的　建立一种基于重组酶介导等温扩增技术（RAA）的细粒棘球绦虫核酸检测方法。方法　针对细粒棘球绦虫12S rRNA基因序列片段,设计、筛选并合成RAA特异性扩增引物和荧光检测探针,构建细粒棘球绦虫荧光RAA检测方法。分别以含靶序列的不同拷贝数重组质粒和不同浓度细粒棘球绦虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测灵敏度;分别以细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩虫、华支睾吸虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫、猪带绦虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性。结果　成功建立了细粒棘球绦虫荧光RAA检测法,在39 ℃条件下20 min内可以实现对细粒棘球绦虫基因组DNA特异性扩增,最低可以检测出10拷贝/μL含靶序列的重组质粒DNA和0.1 ng/μL细粒棘球绦虫基因组DNA样本,具备较高敏感性;对多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩虫、华支睾吸虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫、猪带绦虫基因组DNA均无阳性扩增,具备较高特异性;且该荧光RAA法可成功检出细粒球绦虫包囊中DNA。结论　成功建立了一种快速、灵敏、特异的可用于细粒棘球绦虫核酸检测的荧光RAA法。     

基于重组酶介导核酸等温扩增反应的曼氏血吸虫 基因检测方法的建立

目的　建立一种可用于曼氏血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法（Recombinase?aided amplification, RAA）。方法　以曼氏血吸虫121 bp高重复基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计、合成引物及荧光探针,建立并优化荧光RAA法反应体系。分别以不同拷贝数的含121 bp基因片段的重组质粒及不同浓度曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA法扩增,评价该方法的敏感性;分别以日本和埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,评价其特异性。结果　建立的荧光RAA法可在39 ℃、20 min内特异性扩增曼氏血吸虫基因组DNA。以重组质粒为模板,荧光RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10拷贝/μL;以基因组DNA为模板,荧光RAA法最低可检测浓度为0.1 fg/μL。以日本血吸虫虫卵、埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,结果均为阴性。结论　成功建立了一种可用于曼氏血吸虫DNA检测的荧光RAA法,该方法反应快捷、操作简便,敏感性和特异性均较好。     

新型等温扩增技术推动寄生虫病现场快速检测能力提升

随着分子生物学的快速发展,等温扩增技术凭借其高效、快速和简便等优势,现已开始应用于寄生虫病病原核酸检测,并成为推进寄生虫病现场检测和防控工作的重要手段。新型等温核酸扩增方法——重组酶介导的等温扩增技术（Recombinase?aided isothermal amplification assay）可在等温条件下（一般为37 ~42 ℃）、5 ~ 20 min内实现对目的基因片段扩增,具有操作简便、快速扩增、无需高端仪器设备、可对结果进行实时观察等优势。该方法已被成功应用于多种寄生虫及其他病原体核酸检测,均显示出较高灵敏度及特异性,且特别适合在实验室之外的环境进行大规模样品现场检测,因此具备现场快速检测和应用推广的潜在价值。