东北雷公藤DXR HMGR基因克隆及生物信息学分析

目的:克隆东北雷公藤萜类物质生物合成关键酶基因3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGR)基因和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)基因全长,并对其进行生物信息学分析。方法:根据东北雷公藤转录组数据,设计特异性引物,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术克隆东北雷公藤DXR、HMGR基因编码区的全长序列,并进行一系列生物信息学分析。结果:成功克隆东北雷公藤DXR、HMGR基因各1条,分别命名为TrDXR和TrHMGR,两者分别长1410、1770 bp,编码469个和589个氨基酸。TrDXR为亲水性蛋白,亚细胞定位在叶绿体,无跨膜结构,转运肽定位于叶绿体,含有2个结合功能域和2个活性位点基序;TrHMGR为疏水性蛋白,亚细胞定位在内质网,有跨膜结构,无转运肽,含有4个结合功能域。TrDXR和TrHMGR与不同物种同源序列的相似性高,保守性强。结论:克隆获得TrDXR、TrHMGR基因cDNA全长,并对其生物功能进行了初步预测,为基因功能鉴定及东北雷公藤萜类物质分子形成机制研究奠定基础。     

诱导子对丹参毛状根酚酸类和丹参酮类成分积累的影响

目的:考察生物诱导子真菌菌丝提取物和非生物诱导子茉莉酸甲酯及二者协同作用对丹参毛状根酚酸类和丹参酮类成分积累的综合性影响.方法:在继代培养21 d的丹参毛状根中添加不同的诱导子及诱导子组合,分别测定不同收获期毛状根的生长量和两大类成分的积累量.结果:3种处理均显著抑制了丹参毛状根的生长,促进了隐丹参酮和二氢丹参酮Ⅰ的积累,但对酚酸类成分的积累却有不同的作用,茉莉酸甲酯可以促进酚酸类成分的积累,真菌诱导子在一定程度上抑制了酚酸类成分的积累.结论:真菌诱导子和茉莉酸甲酯以及二者协同作用对丹参毛状根不同成分的积累具有不同的影响,3种处理条件下水溶性成分的积累和脂溶性成分的积累基本不存在关联性.     

丹参转基因毛状根离体培养体系的建立及分析

目的:建立起丹参的转基因毛状根诱导及离体培养体系。方法:考察了不同外植体、不同农杆菌侵染时间和共培养时间诱导丹参毛状根的效率,共培养外植体用400 g.L-1Cef水除菌5 min,接种在MS+400 g.L-1Cef+2.5 g.L-1Hyg的固体培养基上,完全除菌后转接入6,7-V+2.5 g.L-1Hyg液体培养基继代培养,GFP荧光检测阳性毛状根,PCR检测农杆菌特征基因rolC,并测定不同生长时期的毛状根干重和二氢丹参酮I的积累。结果:用丹参叶片基部诱导毛状根,成功率可达到93.3%;农杆菌侵染10 min诱导效率最高为63.3%;共培养2～3 d诱导效果最好;PCR结合GFP荧光检测的方法鉴定阳性转基因材料具有较高的可信性;丹参毛状根生物量变化与次生代谢物积累之间有着紧密联系。结论:成功建立起丹参转基因毛状根离体培养体系,为进一步的基因工程应用打下基础。     

丹参毛状根的诱导及培养条件的优化

为了建立丹参毛状根的诱导方法及液体培养体系,以发根农杆菌A4,LBA9402,15834为试验菌株分别侵染丹参无菌苗叶片,诱导丹参毛状根,PCR扩增筛选阳性株系,HPLC测定丹酚酸含量并在此基础上进一步优化毛状根的液体培养条件。结果显示：3种发根农杆菌A4,LBA9402,15834均诱导出丹参毛状根,经PCR鉴定证明其Ri质粒T-DNA均已整合到丹参基因组中,其中发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根丹酚酸含量较高,质量分数分别为（3.27±0.37）%,（3.17±0.20）%;由发根农杆菌LBA9402诱导MSOH液体培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量较高,质量分数为（4.56±0.36）%;由发根农杆菌LBA9402诱导,pH为4.81的MSOH液体培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量最高可达4.85%。因此,以发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根在pH为4.81的MSOH液体培养基中培养的丹酚酸含量较高。为进一步利用基因工程技术改良中药丹参的品质奠定了基础。     

磷胺霉素处理对丹参毛状根合成丹参酮类化合物的影响

使用萜类物质合成MEP途径中关键酶DXR的有效抑制剂磷胺霉素（100 μmol·L^-1）处理丹参毛状根,在处理后2,4,6,8,10,16,21 d收获毛状根,检测处理组和对照组毛状根中SmDXR基因的mRNA水平以及丹参酮类物质含量的变化情况。结果发现,随着磷胺霉素处理时间延长,丹参毛状根颜色与对照组相比明显变浅;毛状根中SmDXR基因的mRNA水平呈抛物线型变化,在处理后第6天达到最高值,随后逐渐降低;检测了4种丹参酮类化合物含量,其中丹参酮Ⅰ的含量变化不显著,而二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅱ_A的含量随处理时间延长而逐渐降低,第21天时对照组毛状根中总丹参酮含量是处理组的5.63倍。上述结果表明,丹参DXR基因对于MEP途径丹参酮类化合物的积累具有重要作用,抑制SmDXR基因表达将对该途径次生代谢产物积累产生显著影响。     

一个新的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶3基因的克隆及其表达分析

目的:对丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3methylglutary CoA reductase,HMGR3)基因的cDNA克隆并进行序列分析。方法:利用丹参转录组文库克隆一种新的丹参次生代谢途径上的功能基因;利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,Clustal W比对丹参中已有的3条HMGR的氨基酸序列,构建系统进化树,QRT-PCR检测丹参HMGR3基因在根、茎、叶中的mRNA水平,并检测Ag+诱导子诱导后丹参毛状根中该基因的转录水平。结果:克隆得到一个新的丹参HMGR3基因,该基因ORF全长1 692 bp,编码563个氨基酸,具有HMGR基因家族的特征序列,与SmHMGR1和SmH-MGR2分别具有75.04%,80.64%的同源性,QRT-PCR分析表明该基因在丹参根茎叶中均有表达,在叶中表达量最高,Ag+诱导24 h时mRNA水平达到最高值。结论:首次克隆得到了1条新的丹参HMGR家族基因SmHMGR3,这一结果为进一步研究丹参次生代谢途径提供了新的思路和靶点。     

基于茉莉酸甲酯诱导的丹参毛状根酚酸类成分次生代谢机制研究

目的:研究外源茉莉酸甲酯诱导后丹参毛状根中酚酸类有效成分形成的次生代谢分子机制.方法:用茉莉酸甲酯(MJ,100μmol·L-1)对丹参毛状根进行诱导实验,分别在0,6,12,24,36h收获材料,运用实时定量PCR对丹参中迷迭香酸次生代谢途径上的关键酶基因的mRNA表达水平进行检测.同时,采用LC-MS测定各个时间点毛状根材料中迷迭香酸(RA)、丹酚酸B(LAB)及咖啡酸(CA)的含量.结果与结论:外源性信号分子MJ作用于丹参毛状根,酚酸类成分迅速积累,表现为CA,RA均在诱导后24h达到最大值,LAB的含量36h后达到最高.其诱导机制可能与不同程度的激活RA合成中苯丙氨酸途径上关键酶基因PAL,4CL,C4H与酪氨酸途径中TAT,HPPR基因的表达有关,基因表达在时间呈现先后性,其中,4CL与PAL的贡献度较大.这为今后更深一步的研究丹参水溶性酚酸类成分的次生代谢途径机制提供了依据.     

ABA及其生物合成抑制剂对丹参毛状根酚酸类成分和关键酶的影响

目的:研究脱落酸(ABA)及其生物合成抑制剂氟啶酮(fluridone),对丹参毛状根酚酸类成分和关键酶的影响。方法:继代培养18 d的丹参毛状根添加不同浓度的ABA及ABA与氟啶酮组合,处理1 d后测定关键酶PAL和TAT活性;处理6 d后测定不同处理的丹参毛状根中酚酸类物质的含量。结果:在一定浓度范围内,低浓度的ABA促进丹参毛状根的生长,高浓度的ABA抑制丹参毛状根的生长;ABA显著促进酚酸类物质的积累,对咖啡酸的诱导表现出正相关,但是迷迭香酸和丹酚酸B的效果,表现出在低浓度效果较好,随浓度增大,诱导效果降低,直到ABA浓度至200μmol.L-1,含量开始上升;当ABA与氟啶酮组合处理时,氟啶酮抑制ABA对丹参毛状根酚酸类的积累,但是有差异;不同浓度的ABA会不同程度的提高PAL和TAT酶的活性,添加ABA生物合成抑制剂,酶活性诱导效果降低。结论:ABA能诱导丹参毛状根中酚酸类化合物积累,同时也能激活合成相关酶的活性;ABA生物合成抑制剂氟啶酮不同程度抑制ABA的诱导效果。     

丹参SmJAZ1蛋白原核表达及条件优化

目的:在前期克隆丹参SmJAZ1基因的cDNA全长基础上,为研究丹参SmJAZ蛋白的功能,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达丹参SmJAZ1蛋白,并对其表达条件进行优化.方法:利用分子克隆的方法将丹参JAZ1基因构建到原核表达载体pET32a上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中进行诱导表达.结果:对影响重组蛋白表达的4个因素,即诱导温度、诱导时间、IPTG浓度、及IPTG添加时间进行优化,确定丹参SmJAZ1重组蛋白最适表达条件.IPTG浓度对目的蛋白的表达量没有显著影响;随诱导时间和诱导温度增加,SmJAZ蛋白的表达量增加;而IPTG添加时间对蛋白的表达量有明显影响.结论:丹参JAZ1蛋白在30℃温度条件下,重组菌生长2 h(A600 =0.9),加入0.1 mmol·L-1浓度的IPTG,诱导20 h后,表达条件最合适.     

丹参抗肿瘤活性成分研究新进展

丹参中含有多种抗肿瘤活性成分,在水溶性成分中主要有丹酚酸A,丹酚酸B,salvinal等,在脂溶性成分中主要有丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ_A、二氢丹参酮Ⅰ、次丹参酮、隐丹参酮、凤眼草内酯、新丹参内酯、含氮化合物等.这些抗肿瘤活性成分在肿瘤发生发展及转移的不同阶段,起着重要作用.丹参中新的抗肿瘤活性成分的发现,对丹参的抗肿瘤临床应用具有推动作用.     

丹参新的EST-SSR分布规律及分子标记的建立

目的:建立新近较高覆盖度丹参KST-SSR分子标记,为不同产地来源丹参居群的遗传变异分析奠定基础.方法:对截止2010年11月Genbank下载的丹参EST序列结合HMPL实验室获取的共计1 408条EST序列,进行处理,获取高质量EST序列;经SSRIT软件搜索、分析EST序列中SSR位点的分布规律及类型;在此基础上,运用Websat软件设计EST-SSR引物,经对不同产地丹参样本DNA模板的PCR筛选和条件优化,建立最新EST-SSR分子标记.结果:丹参的EST-SSR种类丰富、覆盖度较大,平均每5.8 kb就检出1条SSR.各种类型出现的频率相差很大,主要重复类型为二核苷酸、三核苷酸重复,分别占SSR总数的63.0%,35.5%,其次为四核苷酸和五核苷酸重复.在重复基元类型中,二核苷酸重复以CT/AG为主,三核苷酸重复以GAA/TCC为主.所优选的36对引物中有29对引物有扩增产物,有效率达80.5%,所选引物对不同产地丹参居群的分子标记出现了多态性.结论:建立的丹参最新EST-SSR分子标记具有较高的覆盖度和多态性,可用于不同产地丹参居群的遗传变异分析.