异补骨脂素对小鼠胚胎前成骨细胞TGF-β受体影响的实验研究

目的:探讨经不同浓度异补骨脂素干预对小鼠胚胎前成骨细胞(MC3T3-E1)增殖、Ⅰ型骨胶原的表达、TGF-βⅠ、Ⅱ型受体的影响以及与原发性骨质疏松症的关系。方法:细胞分为正常对照组与不同浓度异补骨脂素组。各组细胞采用MTT方法检测MC3T3-E1细胞增殖情况,天狼星红染色法测定Ⅰ型骨胶原的表达,荧光素酶报告基因检测TGF-β1通路活性以及Western-Blot法检测TGF-βⅠ、Ⅱ型受体的表达。结果:经不同浓度异补骨脂素刺激,可明显促进MC3T3-E1细胞增殖(P<0.05);Ⅰ型胶原表达逐渐增强;荧光素酶报告基因检测显示TGF-β1通路活性明显增强;Western-Blot结果显示TGF-βⅠ、Ⅱ型受体表达明显增强。结论:异补骨脂素可促进小鼠胚胎前成骨细胞的增殖及Ⅰ型骨胶原表达,对原发性骨质疏松症具有治疗作用。其作用机制可能是通过激活TGF-β信号通路而发挥抗骨质疏松作用。     

去甲二氢愈创木酸对成骨细胞MC3T3-E1增殖的影响

目的探讨不同浓度去甲二氢愈创木酸(NGDA)对成骨细胞MC3T3-E1增殖的影响及其机制。方法应用MTT法测定0,5,10,20,30μmol/L NGDA培养后成骨细胞MC3T3-E1增殖情况,利用流式细胞技术检测0,5,10,20μmol/L NGDA培养后MC3T3-E1细胞周期,用Western blotting法检测0,10,20,30,60μmol/L NGDA培养后MC3T3-E1成骨细胞m TOR通路蛋白表达情况。结果 NGDA浓度从5μmol/L开始有促进成骨细胞MC3T3-E1增殖的作用,20μmol/L时MC3T3-E1增殖活性最强,而30μmol/L时MC3T3-E1增殖活性明显低于20μmol/L时(P<0.05)。0,5,10,20μmol/L浓度的NGDA刺激下,成骨细胞MC3T3-E1进入S期的比例分别为28.9%,38.3%,44.2%,58.2%。NDGA浓度在20μmol/L时m TOR信号通路下游底物p-4E-BP1、p-S6水平明显高于0μmol/L时(P<0.05),但30μmol/L时m TOR信号通路下游底物p-4E-BP1、p-S6水平开始明显下降。结论低浓度NDGA可明显促进成骨细胞MC3T3-E1增殖,诱导细胞周期进入S期,且呈剂量依赖关系,这一作用可能是通过对m TOR信号通路的激活来完成的。     

补骨脂与罗非鱼鳞胶原蛋白多肽对MC3T3-E1细胞ALP、Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达的影响

目的:研究补骨脂提取物与罗非鱼鱼鳞胶原蛋白多肽对体外培养新生小鼠颅骨MC3T3-E1细胞ALP、Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达的影响。方法:将鱼胶原蛋白多肽与补骨脂提取物配伍,以小鼠成骨细胞株MC3T3-E1作为细胞模型,在培养体系中加入不同浓度及比例的补骨脂提取物和鱼胶原蛋白多肽,采用real-time PCR测定MC3T3-E1细胞ALP、Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达。结果:补骨脂提取物和鱼胶原蛋白以质量比1∶1、总浓度为0.2 mg/ml时,对ALP、Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达有明显促进作用,ALPm-RNA表达量高于单独的补骨脂提取物组。结论:中药补骨脂提取物和鱼胶原蛋白多肽能促进MC3T3-E1细胞ALP、Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达,二者配伍对促进MC3T3-E1细胞的分化具有相乘作用。     

黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞CYP27B，CYP24A mRNA及蛋白表达的影响

目的:通过研究黄芪多糖对成骨细胞增殖及1α羟化酶(CYP27B),24-羟基化酶(CYP24A)基因与蛋白表达情况的影响对其治疗骨质疏松症(OP)作用机制进行初步探讨。方法:以MC-3T3-E1成骨细胞为研究对象,实验分为5组,分别为正常组,维生素D组(1×10-5mmol·L-1),黄芪多糖高、中、低剂量组(10,1,0.1 mg·L~(-1))。用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度的黄芪多糖在不同时间(24,36,48 h)对MC-3T3-E1成骨细胞增殖率的影响。实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR)检测黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞CYP24A,CYP27B mRNA的表达情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞CYP24A,CYP27B蛋白的表达情况。结果:MTT比色法显示黄芪多糖的质量浓度在0.1,1,10 mg·L~(-1)时可以提高MC-3T3-E1成骨细胞的增殖率,且在48 h促增殖作用最佳。Real-time PCR,Western blot检测结果显示,与正常组比较,维生素D组MC-3T3-E1成骨细胞CYP27B mRNA表达量、蛋白表达量有显著促进作用(P0.05);与维生素D组比较,黄芪多糖在质量浓度为10,1,0.1 mg·L~(-1)时对MC-3T3-E1成骨细胞CYP24A mRNA表达量、蛋白表达量有显著抑制作用(P0.05)。结论:黄芪多糖能够治疗骨质疏松症其机制与提高成骨细胞活性及调节MC-3T3-E1成骨细胞CYP24A,CYP27B mRNA及蛋白表达水平有关。     

补骨脂提取物对体外培养小鼠成骨细胞株MC3T3-E1细胞分化的影响

目的:研究补骨脂提取物对体外培养新生小鼠颅骨Mc313.E1细胞分化的影响.方法:以小鼠成骨细胞株Mc3T3-E1作为药物筛选的细胞模型,将培养的Mc3T3-E1小鼠成骨细胞分为4组:空白组,补骨脂提取物(含生药)0.02,O.2,2 g·L~(-1)不同剂量组.检测细胞ALP,I型胶原蛋白的含量,采用real-time PCR测定补骨脂提取物对MC3r13.E1细胞AIJP,I型胶原蛋白及骨钙素mRNA表达的影响.结果:补骨脂提取物生药剂量O.2 g·L~(-1),能提高MX3T3-E1细胞ALP的活性,促进I型胶原蛋白分泌.同时分别在7～14 d对Mc3r13-E1细胞ALP,以及在14-21 d I型胶原蛋白、骨钙素mRNA表达有明显的促进作用.结论:中药补骨脂提取物能有效促进成骨细胞的分化,为研究中药补骨脂的作用机制提供参考.     

六味地黄丸含药血清对MC3T3-E1细胞增殖以及对Runx2、FOXO1 mRNA表达的影响

目的探讨六味地黄丸含药血清对MC3T3-E1细胞增殖以及对Runx2、FOXO1 mRNA表达的影响。方法制作六味地黄丸混悬液,对成年Wistar大鼠进行灌胃,获取六味地黄丸含药血清。常规培养MC3T3-E1细胞24 h后更换含10%不同浓度含药血清的培养基,分别培养48 h和72 h后用CCK-8法检测MC3T3-E1细胞的增殖;对MC3T3-E1细胞进行诱导培养22天后进行饥饿培养24h,随后更换含10%不同浓度的含药血清,培养72 h后检测Runx2、FOXO1 mRNA表达。结果六味地黄丸含药血清能促进MC3T3-E1细胞增殖,并且呈现一定的剂量依赖性;同时六味地黄丸含药血清各剂量组均能明显促进Runx2 mRNA的表达(P0.01),高剂量组的表达明显高于低剂量组(P0.01)。高剂量组的FOX01 mRNA表达明显高于其他3组(P0.01)。结论六味地黄丸含药血清能促进MC3T3-E1细胞增殖,同时能促进Runx2、FOXO1 mRNA表达。     

淫羊藿苷促前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化的实验研究

目的探讨淫羊藿苷(icariin,ICA)促进前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化的机制。方法采用不同浓度(10~(-10)~10~(-5)mol/L)的ICA干预前成骨细胞MC3T3-E1 3、6、9天后采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测试剂盒测定ALP活性,确定ICA最适促分化浓度。最适ICA浓度干预前成骨细胞MC3T3-E1 7天后应用实时定量PCR法(real time-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测骨形态发生蛋白(BMP)和Wnt/β-catenin信号通路相关分子(BMP-2、Runx2、β-catenin、cyclin D1)基因表达。ICA分别与BMP、Wnt/β-catenin信号通路抑制剂(Noggin、DKK-1)联合干预前成骨细胞MC3T3-E1后,茜素红钙结节染色观察钙化程度以及Western blot检测BMP-2蛋白表达变化。结果 ICA促进前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化,且10~(-9)mol/L ICA促进分化的能力最强。与对照组比较,ICA能明显上调BMP和Wnt/β-catenin信号通路相关分子(BMP-2、Runx2、β-catenin、cyclin D1)mRNA表达(P0.01)。Noggin或DKK-1能抑制前成骨细胞MC3T3-E1钙化,且两者联合作用时抑制更加明显。与ICA单独作用比较,ICA与DKK1联合干预后BMP-2蛋白表达水平下降(P0.01)。结论 ICA可能通过Wnt/β-catenin/BMP-2信号通路调控前成骨细胞MC3T3-E1的成骨分化。     

竹节参对MC3T3-E1成骨样细胞增殖与分化的影响

目的：研究竹节参不同提取物对体外培养成骨样细胞（MC3T3-E1）增殖、分化作用的影响。方法：采用MC3T3-E1细胞为体外药物筛选的细胞模型,用MTT法测定药物对成骨细胞的增殖作用,碱性磷酸酶（ALP）试剂盒测定ALP的活性,考察竹节参不同提取物对MC3T3-E1细胞增殖、分化作用的影响。结果：10^-1mg／mL的竹节参水提物和10^-4mg／mL的95％乙醇提取物能显著促进MC3T3-E1细胞的增殖和分化（P〈0．05）。结论：一定浓度的竹节参水提物和95％乙醇提取物能显著促进MC3T3-E1细胞的增殖和分化,该药物具有开发抗骨质疏松药物的潜力。     

金叶子异槲皮苷对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

该研究对从金叶子中分离得到的异槲皮苷的成骨活性进行了系统评价。在1×10-4,1×10-5,1×10-6,1×10-7mol·L-1异槲皮苷浓度作用下检测了MC3T3-E1细胞增殖活力和碱性磷酸酶活性;在异槲皮苷作用的第3天对MC3T3-E1碱性磷酸酶、I型胶原以及转录因子Runx2和Osterix的基因表达水平进行了检测;并通过茜素红染色的方法在第21天对MC3T3-E1进行了胞外基质矿化能力的评价。结果显示,异槲皮苷在1×10-7~1×10-5mol·L-1能促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化及矿化能力,上调成骨相关基因的表达,而且该作用呈现出一定的浓度依赖性,在浓度为1×10-6mol·L-1时促进作用最强。在1×10-4mol·L-1时表现出明显的细胞毒性。因此,从金叶子中分离得到的异槲皮苷有一定的成骨活性,这可能是传统中药金叶子治疗骨折的主要药效成分。     

基于分子对接的方法探讨桑根酮C对MC3T3-E1细胞的作用

目的:观察桑根酮C(SanC)对地塞米松(DEX)作用下小鼠MC3T3-E1成骨细胞增殖与分化的影响,并探讨其作用机制。方法:将SanC与同源建模所得的Runt-相关转录因子2(Runx2)蛋白结构进行分子对接。不同浓度SanC(8,16,32μmol·L^-1)和1μmol·L^-1DEX共同作用MC3T3-E1细胞,而后采用细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)法检测SanC对MC3T3-E1成骨细胞增殖影响。试剂盒测定MC3T3-E1成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性和茜素红染色检测骨矿化结节的形成。采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测Runt-相关转录因子2(Runx2),ALP,和锌指结构转录因子(Osterix)mRNA的表达水平。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Runx2蛋白表达。结果:SanC与Runx2对接打分为-9.78。与正常组比较,DEX组显著降低细胞存活率(P<0.01),其中7 d存活率差异达到最大;与DEX组比较,SanC能显著促进MC3T3-E1的细胞增值(P<0.01),其中32μmol·L^-1SanC作用细胞7 d增殖率差异达到最大。与正常组比较,DEX组Runx2,ALP和Osterix mRNA的表达均有一定程度升高(P<0.05);与DEX组比较,不同浓度SanC组依赖性上调Runx2,ALP和Osterix mRNA的表达(P<0.01)。与正常组比较,DEX组Runx2蛋白表达明显下降(P<0.05);与DEX组比较,SanC干预下细胞Runx2蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论:桑根酮C能促进MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化和矿化,其机制可能与上调Runx2表达有关。     

JNK通路对左归丸含药血清调控MC3T3 成骨细胞Runx2 mRNA表达的影响

目的:探讨c-Jun氨端激酶(JNK)信号通路在左归丸含药血清调控成骨前体细胞(MC3T3-E1)增殖和成骨特异转录因子核心结合因子(Runx2) mRNA表达中的作用.方法:以MC3T3-E1为研究对象,制备左归丸含药血清,选用JNK特异抑制剂SP 600125,实验分为空白对照组、SP 600125组、左归丸组、左归丸加SP 600125组、倍美力组、倍美力加SP 600125组.孵育48 h后,采用噻唑蓝(MTT)法检测SP600125对左归丸含药血清干预MC3T3-E1成骨前体细胞增殖作用的影响,采用Western blot法分析JNK蛋白磷酸化水平,采用Real Time RT-PCR法检测成骨细胞特异转录因子Runx2 mRNA表达情况.结果:与空白对照组比较,左归丸含药血清组显著促进细胞增殖,明显上调p-JNK蛋白和Runx2 mRNA表达(P＜0.01);SP600125显著抑制左归丸含药血清诱导的增殖和p-JNK蛋白表达(P＜0.01),对Runx2 mRNA表达的影响不显著.结论:JNK信号通路的激活可能参与了左归丸含药血清诱导的MC3T3-E1成骨前体细胞增殖,但左归丸含药血清诱导的Runx2mRNA高表达对JNK信号通路依赖不显著.     

Effect of safflower seeds supplementation on stimulation of the proliferation, differentiation and mineralization of osteoblastic MC3T3-E1 cells

Anti-bone resorption properties of the Korean herbal formulation, Gami-Honghwain (HJ), which comprises Carthamus tinctorius L. seed and hominis placenta, were investigated. We demonstrate that the production of PGE2 is inhibited by 20-100 microg/ml HJ in nontransformed osteoblastic cells (MC3T3-E1 cells), indicating that HJ inhibits PGE2 production. The effect of HJ on the proliferation and osteoblastic differentiation in MC3T3-E1 was also studied. HJ dose-dependently increased DNA synthesis (significant at 20-100 microg/ml), and increased alkaline phosphatase (ALP) and prolyl hydroxylase activities of MC3T3-E1 cells (20-100 microg/ml), while anti-estrogen tamoxifen eliminated the stimulation of proliferation and ALP activity of MC3T3-E1 which was induced by HJ. These results indicate that HJ directly stimulates cell proliferation and differentiation of osteoblasts. Also, when we assessed the effects of HJ on osteoblastic differentiation in MC3T3-E1, HJ enhanced ALP activity and mineralization in a dose- and time-dependent fashion. This stimulatory effect of the HJ was observed at relatively low doses (significant at 20-100 microg/ml and maximal at 100 microg/ml). Northern blot analysis showed that the HJ (60 microg/ml) increased in bone morphogenetic protein-2 as well as ALP mRNA concentrations in MC3T3-E1 cells. HJ (100 microg/ml) slightly increased in type I collagen mRNA abundance throughout the culture period, whereas it markedly inhibited the gene expression of collagenase-1 between days 15 and 20 of culture. These results indicate that HJ has anabolic effect on bone through the promotion of osteoblastic differentiation, suggesting that it could be used for the treatment of common metabolic bone diseases.     

新疆马鹿角提取物对MC3T3-E1成骨细胞RANKL/OPGmRNA表达的影响

目的 研究新疆马鹿角提取物对MC3T3-E1成骨细胞核因子-kβ受体活化因子配体(RANKL)/护骨素(OPG)mRNA表达的影响.方法 体外培养MC3T3-E1成骨细胞,分别加入含不同剂量新疆马鹿角提取物的培养液,72 h后分别提取细胞总RNA,用RT-PCR方法检测RANKL/OPG mRNA表达.结果 培养72 h后RANKL/OPG mRNA表达的灰度值(0.312±0.0710),与对照组(2.017±0.1320)比较,新疆马鹿角提取物呈浓度依赖性降低RANKL mRNA的表达,增加OPG mRNA的表达,各剂量组RANKL/OPG mRNA吸光度比值降低.结论 新疆马鹿角提取物可能通过调节成骨细胞RANKL/OPG的基因表达,而抑制破骨细胞介导的骨吸收.     

两种杜仲黄酮类化合物对成骨细胞OPG/RANKL及成骨相关转录因子的影响

目的:研究杜仲黄酮类化合物紫云英苷和黄芩素对成骨细胞特异性转录因子Osterix及破骨细胞抑制因子与核因子κB受体活化因子配体比值(OPG/RANKL)的影响。方法:采用MC3T3-E1 Subclone 14成骨细胞,不同浓度紫云英苷和黄芩素和维生素D3组加入质量浓度为30 mg·L-1作用细胞24 h后,用MTT法检测细胞增殖情况,成骨细胞接种于24孔板后,空白组加入培养基,给药组分别加入质量浓度为80 mg·L-1(高浓度),40 mg·L-1(中浓度),7.5 mg·L-1(低浓度)的含紫云英苷或黄芩素,作用24 h后,ELISA法检测钙离子活性,蛋白免疫印迹法检测Osterix,OPG以及RANKL的蛋白表达水平。结果:与空白组相比,紫云英苷和黄芩素可后明显促进MC3T3-E1 Subclone 14成骨细胞的增殖(P<0.05);明显上调OPG和Osterix的表达(P<0.05),同时能降低RANKL的表达(P<0.05)。结论:杜仲黄酮类化合物紫云英苷和黄芩素能促进MC3T3-E1Subclone 14成骨细胞增殖,并上调Osterix和OPG/RANKL。     

仙茅苷促MC3T3-E1成骨样细胞增殖、分化及钙化作用的研究

目的:考察仙茅苷对MC3T3-E1成骨样细胞的增殖、分化及钙化功能的影响。方法:用不同浓度仙茅苷加入MC3T3-E1细胞培养体系中,MTT法检测细胞增殖水平;用茜素红染色法考察骨小结形成能力;以对硝基苯二钠基质动力学法检测碱性磷酸酶的活性。结果:仙茅苷(10-4～10-8mol.L-1)对细胞增殖有促进作用,高浓度(10-4～10-6 mol.L-1时作用明显,其中48h为最佳作用时间;仙茅苷以10-7、10-9 mol.L-1浓度在96h时可促进MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性;仙茅苷浓度为10-9 mol.L-1时对于骨小结形成最为有效。结论:仙茅苷对MC3T3-E1成骨样细胞的增殖、分化及骨小结形成均有促进作用。