人GRB2基因真核表达及其在293T细胞中的定位研究

[目的]构建人GRB2蛋白真核表达质粒p Enter-GRB2,并观察其在293T细胞中的定位。[方法]从Hela细胞中提取总RNA,通过RT-PCR获得GRB2全长c DNA序列,并将其克隆到真核表达载体p Enter中,构建重组质粒p Enter-GRB2。转染293T细胞24 h、36 h和48 h后通过Western Blot检测其表达情况,通过免疫荧光观察其在细胞中的定位情况。[结果]经双酶切及测序鉴定,GRB2开放阅读框正确地构建到了真核表达质粒p Enter中,免疫印迹检测可见大小约为25 k Da的特异性条带,免疫荧光实验表明GRB2蛋白在细胞质和细胞核中均存在。[结论]成功构建了真核表达质粒p Enter-GRB2并在293T细胞中表达,证实GRB2在293T细胞中不仅存在于细胞质中,也存在于细胞核中,为更加深入地研究其生物学功能及机制奠定了理论基础。     

人KAT7基因促进雌激素受体α表达

目的:构建带有Myc标签的赖氨酸乙酰基转移酶(KAT7)的真核表达载体,获得Myc-KAT7融合蛋白,并检测其对雌激素受体α(ERα)表达的影响。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术从中扩增出人KAT7基因的编码序列,插入p XJ-40-Myc载体;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测转染细胞的表达情况,并提取总RNA采用q RT-PCR检测ERα的表达。结果:双酶切和测序结果表明Myc-KAT7真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后Western印迹鉴定表明融合蛋白得到表达,q RT-PCR表明KAT7在转录水平能够促进ERα表达。结论:构建了带Myc标签的人KAT7真核表达载体,并发现KAT7对ERα的表达具有促进作用。     

人CCAAT增强子结合蛋白β抑制骨肉瘤细胞增殖

目的:构建带Myc标签的CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)的真核表达载体,并检测其对骨肉瘤细胞增殖的影响。方法:应用PCR技术从人乳腺文库中扩增C/EBPβ全长编码区基因,并克隆到pXJ-40载体中;将重组质粒转染人胚胎肾293T细胞,采用SDS-PAGE和Western印迹鉴定蛋白表达;另将重组C/EBPβ质粒转染入骨肉瘤细胞系U20S,生长实验检测其对肿瘤细胞增殖的影响。结果:基因测序和双酶切鉴定表明,Myc-C/EBPβ真核表达质粒构建成功;SDS-PAGE和Western印迹结果显示,Myc-C/EBPβ转染人胚胎肾293T细胞后获得表达;生长实验证明C/EBPβ具有抑制骨肉瘤细胞增殖的功能。结论:构建了Myc-C/EBPβ的真核表达载体,为全面了解C/EBPβ的生物学功能及调控机理奠定了基础。     

准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698在真核细胞中的表达与鉴定

目的:构建真核表达质粒pEGFP-N1-mpafp698,转染人胚肾293T细胞,并表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698.方法:PCR扩增出mpafp698序列,将其克隆入本室保存的真核表达载体pEGFP-N1中,转染293T细胞;利用RT-PCR、流式细胞仪、免疫荧光、Western 印迹检测蛋白表达.结果:构...     

人LC3B基因的真核表达及鉴定

目的:构建带HA标签的重组人LC3B基因的真核表达载体,获得HA-LC3B融合蛋白,并初步检测其生物学功能。方法:从人乳腺文库中通过PCR技术扩增LC3B基因编码序列,将其插入pc DNA3.0-HA载体,获得HA-LC3B真核表达载体;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测转染细胞的表达情况,免疫共沉淀实验证实其生物学活性。结果:双酶切和测序结果表明HA-LC3B真核表达质粒构建成功,Western印迹表明重组质粒转染293T细胞后获得表达;免疫共沉淀实验显示HA-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白相互作用,具有较好的生物学活性。结论:在真核表达系统中表达了带HA标签的人LC3B,为进一步研究细胞自噬奠定了基础。     

DH结构域缺失对SGEF在293T细胞中定位的影响

目的:通过构建带EGFP标签的SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体pEGFP-C1-SGEF-△DH并使其在293T细胞表达,观察DH结构域缺失后SGEF在293T细胞中的定位。方法:利用重叠PCR技术在pcDNA3.1-SGEF质粒上扩增缺失DH结构域的SGEF基因,然后将PCR产物亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1上,对阳性克隆进行双酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染293T细胞,并用Western印迹和细胞免疫荧光技术对重组质粒pEGFP-C1-SGEF-△DH在293T细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果:双酶切和测序鉴定表明,pEGFP-C1-SGEF-△DH真核表达质粒构建成功,转染实验发现该质粒能够在293T细胞中表达,表达产物主要定位在细胞核内。结论:构建了带EGFP标签的人SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞293T中表达,表达产物定位于细胞核,为进一步研究SGEF基因DH结构域的细胞生物学功能提供了一个重要的工具。     

带Myc标签的人B55α真核表达载体的构建及其生物学功能

目的:构建带有Myc标签的人B55α真核表达载体,获得Myc-B55α融合蛋白,并初步检测其生物学功能。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增出B55α编码序列,将其插入p XJ-40-myc载体,Western印迹检测其表达情况;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测B55α蛋白表达水平及其对AKT磷酸化的影响;免疫共沉淀实验检测B55α与AKT是否存在相互作用。结果:双酶切和测序结果表明Myc-B55α真核表达质粒构建成功;Western印迹证实转染293T细胞后Myc-B55α融合蛋白获得表达,并可抑制AKT308的磷酸化;免疫共沉淀结果表明B55α与AKT存在相互作用。结论:构建了带Myc标签的人B55α真核表达载体,为进一步研究B55α在蛋白磷酸化修饰功能中的作用奠定了基础。     

带绿色荧光蛋白标签的人细胞分裂周期蛋白25同源蛋白的真核表达及其生物学功能研究

目的:构建带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的人细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cdc25c)基因的真核表达载体pEGFP-cdc25c,并检测其在人胚肾293T细胞中的表达定位情况及生物学功能。方法:采用PCR技术从实验室已有质粒中扩增人cdc25c基因,并将其克隆到pEGFP-C1载体中;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测转染细胞的表达情况,荧光显微镜观察cdc25c蛋白在细胞中的定位,并利用cdc2 Tyr15位特异性抗体验证EGFP-cdc25c作为磷酸酯酶的生物学功能。结果:双酶切和测序鉴定表明,pEGFP-cdc25c真核表达质粒构建成功;转染293T细胞后获得表达,在荧光显微镜下,表达阳性的细胞呈绿色,并定位于细胞质;Western印迹结果表明,EGFP-cdc25c能增加cdc2 Tyr15位的磷酸化水平,起到拮抗内源性cdc25c的功能。结论:构建了带EGFP标签的人cdc25c基因真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞293T中表达,表达产物定位于细胞质;EGFP-cdc25c能够发挥显性负性作用,为深入研究cdc25c的生物学功能奠定了重要基础。     

人激活转录因子5基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究

目的:构建带myc标签的人激活转录因子5(ATF5)的真核表达载体,获得myc-ATF5融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的带有XL5标签的ATF5质粒为模板,采用PCR技术扩增ATF5编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体中,Western印迹检测其表达;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹和qRT-PCR检测其下游基因哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在蛋白和mRNA水平的变化。结果:双酶切和测序结果表明myc-ATF5真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后获得表达;Western印迹和qRT-PCR证明myc-ATF5可升高mTOR的转录和蛋白水平。结论:构建了带myc标签的人ATF5真核表达载体,为进一步研究ATF5在自噬中的功能奠定了基础。     

人激活转录因子5基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究简

目的：构建带myc标签的人激活转录因子5（ATF5）的真核表达载体,获得myc-ATF5融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法：以本实验室保存的带有XL5标签的ATF5质粒为模板,采用PCR技术扩增ATF5编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体中,Western印迹检测其表达;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹和qRT-PCR检测其下游基因哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）在蛋白和mRNA水平的变化。结果：双酶切和测序结果表明myc-ATF5真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后获得表达;Western印迹和qRT-PCR证明myc-ATF5可升高roTOR的转录和蛋白水平。结论：构建了带myc标签的人ATF5真核表达载体,为进一步研究ATF5在自噬中的功能奠定了基础。     

梅花鹿胸腺素beta10基因真核表达载体的构建及鉴定

转录组测序发现Tβ10在鹿茸中高表达,为了研究Tβ10与鹿茸生长发育间的关系,构建Tβ10真核表达载体。使用Trizol法提取梅花鹿鹿茸总RNA,PCR技术特异性扩增梅花鹿Tβ10基因,利用酶切位点将目的片段插入真核表达载体VR1012构建表达质粒,通过Fugene~?6将质粒瞬时转染到293T细胞中,使用Western blotting和免疫荧光方法检测目的基因的表达。结果发现克隆得到的梅花鹿Tβ10基因长度为129bp,编码42个氨基酸,成功构建真核表达载体VR1012-Tβ10-HA,转染后使用Western blotting方法检测到梅花鹿Tβ10在293T细胞中表达,免疫荧光方法证明梅花鹿Tβ10主要定位在细胞浆中。     

SCG10基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的构建SCG10真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位。方法以人胎脑cDNA文库为模板,PCR扩增SCG10全长编码基因,亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚肾HEK293中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-SCG10在HEK293细胞内定位。结果 SCG10全长基因序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小540bp。Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为48kD。pEGFP-SCG10在细胞内定位以细胞浆为主,在细胞核少量表达。结论成功构建了SCG10全长基因真核表达载体,pEGFP-SCG10蛋白主要定位于HEK293细胞浆内。     

比格犬ERβ1293基因真核载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达和定位

目的 观察比格犬Myc 标签ERβ1293重组真核表达载体在HEK293T细胞中的表达及定位.方法 以pEGFP-N1-ERβ1293重组真核表达载体为模板,PCR保真酶扩增得到ERβ1293基因编码区全长.Myc标签ERβ1293重组真核载体瞬时转染HEK293T细胞,运用蛋白质印迹技术（Western blotting）和间接免疫荧光技术（indirect immunofluorescence,IF）鉴定pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T细胞中的表达和定位情况.结果 成功构建pcDNA3.1-Myc-ERβ1293重组真核表达载体,转染至HEK293T细胞中.Western blotting检测有蛋白条带表达,共聚焦显微镜下观察IF处理后的转染细胞,荧光定位于细胞质.结论 前期实验得到比格犬ERβ剪切异构体ERβ1293编码区序列,缺失第四外显子,导致其与配体结合能力减弱或消失,因此目的 基因编码蛋白定位在细胞中发生变化.     

人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测

旨在构建人C-Src蛋白酪氨酸激酶(Csk)基因真核表达系统。从He La细胞中提取总的RNA,通过RT-PCR获得Csk基因全长c DNA序列,并将其克隆至真核表达载体p ENTER中,构建重组质粒p ENTER-Csk-his。重组质粒转染293T细胞48h后通过SDS-PAGE、Western blot检测Csk蛋白表达情况,间接免疫荧光进行蛋白定位,通过镍螯合的磁珠法纯化Csk蛋白,hispulldown及CO-IP检测表达蛋白的活性。结果显示,经双酶切及测序鉴定,真核表达载体p ENTER-Csk-his正确没有突变,SDSPAGE及Western blot均可检测到大小约为51 k D的目的蛋白,说明Csk蛋白在293T细胞中表达成功,间接免疫荧光定位重组Csk蛋白在细胞质中表达,通过磁珠纯化得到Csk蛋白,最后通过his-pulldown及CO-IP发现Csk能够与IGF1R、SHC1相互作用,说明表达的Csk蛋白具有生物学活性。成功获得Csk基因全长序列,并构建重组p ENTER-Csk-his真核表达质粒,在真核细胞293T的细胞质中获得高效表达且表达的蛋白具有生物学活性。     

人RhoB基因真核表达载体的构建和表达分析

旨在构建带Flag标签的人RhoB基因真核表达载体并检测其表达。提取人胚肾细胞HEK-293T总RNA并反转录获得cDNA;设计引物并利用PCR技术扩增RhoB基因的ORF序列;将所扩增序列插入到带Flag标签的pCMV5真核表达载体,插入位点位于限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ之间,得到真核表达载体Flag-RhoB。酶切并测序验证该质粒的准确性。将成功构建的Flag-RhoB质粒转染乳腺癌MCF7细胞、宫颈癌HeLa细胞以及结直肠癌HCT116细胞,Western Blotting检测RhoB蛋白的表达情况;转染Mv.1.Lu细胞,免疫荧光技术检测该蛋白在细胞中的定位情况。成功扩增出RhoB基因的ORF序列;连入pCMV5中获得真核表达质粒Flag-RhoB;酶切鉴定得到590 bp大小的片段,测序结果显示连入的是RhoB基因的cDNA序列与GenBank相符。Western Blotting结果显示,该质粒可在MCF7细胞、HeLa细胞及HCT116细胞中正确表达。免疫荧光实验显示过表达的RhoB蛋白主要定位于细胞膜上,细胞质中也有分布。成功构建了带Flag标签的人RhoB基因的真核表达载体,该质粒可在细胞中顺利表达。     

非受体型酪氨酸激酶JAK1基因真核表达质粒的构建与真核表达

[目的]构建非受体型酪氨酸激酶JAK1(nonreceptor tyrosine kinase-JAK1)基因真核表达质粒pcDNA4.0-HisJAK1,并转染293T细胞进行真核表达。[方法]从Hela细胞中提取总的RNA,通过RT-PCR获得JAK1基因全长c DNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA4.0-His中,构建重组质粒pcDNA4.0-His-JAK1。将真核重组表达质粒转染293T细胞,转染48 h后,在荧光显微镜下观察转染情况。免疫印迹法检测JAK1蛋白转染24 h、36 h与48 h在293T细胞中的表达。[结果]经双酶切与质粒PCR鉴定质粒克隆正确,测序鉴定序列中第2199位碱基A突变为G,为同义突变,不影响氨基酸序列。转染293T细胞48 h后,间接免疫荧光实验显示在293T细胞中检测到绿色荧光。免疫印迹检测可见大小约为133 kDa的目的蛋白。[结论]成功获得JAK1基因全长序列,并成功构建pcDNA4.0-HisJAK1真核重组表达质粒,并在真核细胞293T中获得有效表达,为进一步研究JAK1蛋白质相互作用奠定了基础。     

人Smurf1基因真核表达质粒的构建和表达

[目的]构建人Smurf1基因的真核表达载体并检测其表达和细胞亚定位。[方法]PCR法从人胚肾细胞HEK-293T中扩增Smurf1基因的ORF序列,将其插入到带Flag标签的p CMV5真核表达载体,插入位点为限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ之间。酶切并测序鉴定该质粒的正确性。将成功构建的质粒Flag-Smurf1转染HEK-293T细胞和Hela细胞,Western Blotting检测Smurf1蛋白的表达情况;转染Mv. 1. Lu细胞,免疫荧光检测Smurf1蛋白在细胞中的亚定位。[结果]成功扩增出Smurf1基因的ORF序列;连入p CMV5中获得了质粒Flag-Smurf1;酶切鉴定得到2. 2 kb大小的片段,测序结果显示连入的是Smurf1基因的c DNA序列正确。Western Blotting结果显示该质粒可在HEK-293T细胞和Hela细胞中表达,表达大小约为80 k Da,符合预期。免疫荧光实验结果显示过表达的Smurf1主要定位在细胞膜上。[结论]成功构建了带Flag标签的人Smurf1基因的真核表达质粒,该质粒可在细胞中顺利表达。     

人自噬相关基因12真核表达载体的构建及表达

目的:构建带myc标签的自噬相关基因12(ATG12)的真核表达载体,获得myc-ATG12融合蛋白。方法:以人乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增人ATG12编码序列,将其插入p XJ-40-myc载体构建重组质粒,转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测表达情况;将重组质粒与ATG3表达质粒共转染293T细胞,免疫共沉淀法检测二者的相互作用。结果:myc-ATG12真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后融合蛋白获得表达,其相对分子质量约17×103,可与Flag-ATG3结合。结论:构建并表达了带myc标签的人ATG12真核表达载体,为进一步研究ATG12在自噬中的功能奠定了基础。     

人H-ras基因真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞生长的促进作用

目的:构建癌基因H-ras真核表达载体,并检测其对肿瘤细胞生长的作用。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增H-ras基因片段,将其插入p XJ-40-myc载体后转染人胚肾HEK293T细胞,用Western印迹检测该融合蛋白的表达;将重组质粒转染人肠癌HCT-116细胞和人肝癌Hep G2细胞,通过细胞生长曲线(CCK8法)对myc-H-ras影响肿瘤细胞生长的情况进行分析。结果:利用PCR技术,从乳腺文库中扩增出H-ras基因片段,并成功插入p XJ-40-myc载体;重组质粒转染HEK293T细胞,经Western印迹检测融合蛋白正确表达;细胞生长曲线结果显示,转染myc-H-ras的结肠癌HCT-116细胞和人肝癌Hep G2细胞比转染空载体的细胞生长快。结论:构建了人H-ras基因真核表达载体,为进一步研究ras基因在肿瘤细胞中的作用奠定了一定基础。     

人p65真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建带Myc标签的人p65真核表达载体,对其在人宫颈癌He La细胞中的定位进行检测,并研究p65对核因子κB(NF-κB)转录活性的影响。方法:构建带Myc标签的p65真核表达载体pc DNA3.1-Myc-p65,质粒测序验证正确后脂质体法瞬时转染人胚肾HEK293T细胞,Western印迹鉴定p65的表达;细胞免疫荧光实验检测p65的亚细胞定位;重组质粒与NF-κB-Luc报告基因质粒共转染HEK293T细胞,加TNFα刺激后检测萤光素酶报告基因的活性。结果:测序结果证实pc DNA3.1-Myc-p65真核表达载体构建成功;脂质体法转染HEK293T细胞后检测到Myc-p65蛋白的表达;细胞免疫荧光实验显示Myc-p65蛋白定位于He La细胞的细胞质中,当加入TNFα刺激后大部分Myc-p65蛋白进入细胞核;萤光素酶活性检测结果显示,提高细胞内p65水平或加入TNFα刺激均可明显激活NF-κB信号通路的活性。结论:构建了带Myc标签的p65真核表达载体,并使其在HEK293T细胞中表达;正常情况下,Myc-p65蛋白定位于宫颈癌He La细胞的细胞质中,TNFα促进Myc-p65入核;Myc-p65能够以TNFα不依赖的方式激活NF-κB信号通路。pc DNA3.1-Myc-p65真核表达载体的构建,为进一步筛选NF-κB的相互作用蛋白及功能研究奠定了基础。