The Leu477 and Leu613 of ORF2-Encoded Protein Are Critical in Forming Neutralization Antigenic Epitope of Hepatitis E Virus Genotype 4

Hepatitis E virus （HEV） genotype 4 was originally identified in China. Its neutralization antigenic epitopes have not been characterized. Recently, we identified a neutralizing monoclonal antibody （mAb） IG10, which was generated following immunization of mice with p166Chn, a recombinant protein comprising 464-629 amino acids （aa） of the HEV genotype 4 capsid protein. In this study, a panel of 22 N- and/or C-terminal truncated and 6 site-directed mutated p166Chn proteins were prepared. Only those N- or C-terminal truncated proteins containing the region 477-613 aa could react with the mAb 1G10, suggesting the neutralization epitope of HEV genotype 4 is located between aa477 and aa613. However, a both N- and C-terminal truncated protein, pN477-C613, neither reacted to 1G10 nor elicited neutralizing antibodies in mice, while another both terminal truncated protein, pN472-C617, did, suggesting the flanking regions of the pN477-C613 could help to stabilize and allow presentation of the neutralization epitope to the immune system. Substituting Leu477 and/or Leu613 with the polar, uncharged threonine （Thr） caused 〉 50% reduction of the mutants＇ immunoreactivity to IG10, whereas replacement by hydrophobic phenylalanine （Phe） made little impact on the immunoreactivity, revealing functional associations between hydrophobicity of aa at positions 477 and 613 and the antigenicity of p166Chn. These data suggested Leu477 and Leu613 are critical in forming the neutralization epitope of HEV genotype 4. Cellular ＆ Molecular Immunology. 2008;5（6）：447-456.     

一种新型戊型肝炎病毒样颗粒的表达、纯化及其免疫原性

目的以非包涵体形式表达含戊型肝炎病毒(HEV)中和抗原表位的新型HEV重组蛋白,并对其进行鉴定和分析。方法将HEV开放阅读框架2(ORF2)编码452~617位氨基酸的基因片段连接到载体pET28a( ),转化大肠杆菌,获取表达克隆。以Ni-NTA层析柱纯化表达的蛋白,并用SDS-PAGE、Westernblot和直接电镜负染等方法分析鉴定,最后免疫小鼠检测特异性抗体的产生水平。结果表达的重组蛋白天然可溶,相对分子质量(Mr)约为22000,并可形成直径为20nm左右的病毒样颗粒,能与戊型肝炎患者血清发生Westernblot阳性反应,免疫小鼠后可诱导产生高滴度的特异性抗体。体外中和试验显示产生的抗体具有中和HEV的活性。结论原核表达的、含HEV中和抗原表位的、长度仅166个氨基酸的HEVORF2近3′端编码蛋白能够形成病毒样颗粒,而且该新型病毒样颗粒具有良好的抗原性和免疫原性。     

马传染性贫血病毒囊膜蛋白GP90的表达及其免疫效果研究

目的：探索马传染性贫血病毒（EIAV）野毒株（强毒，LN）和疫苗毒株（弱毒，DLV）的囊膜蛋白GP90作为鉴别诊断试剂的效果及基因工程疫苗的可能性。方法：将中国EIAV疫苗株（DLV）及其亲本毒株辽毒株（LN）接种于驴外周血白细胞培养物，提取前病毒DNA，并以其为模板，经聚合酶链法（PCR）扩增出LN和DLV的GP90片段，在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达。表达的GP90蛋白经金属离子亲和层析（IMAC）纯化后免疫小鼠，ELISA法检测抗EIAV抗体，中和试验检测中和抗体活性。同时对DLV和LN GP90的核苷酸与氨基酸进行比较。结果：DLV和LN GP90核苷酸序列的同源性为95．3％，氨基酸序列的同源性为87.7％。未加佐剂组抗体滴度为800，佐剂组抗体滴度达1600;不加佐剂组的中和抗体滴度在40－80之间，加佐剂组中和抗体滴度在80－160之间。结论：成功构建了分别表达EIAV野毒株LN和疫苗毒株DLV囊膜蛋白GP90的重组杆状病毒，大量表达的蛋白纯化后纯度较好，该纯化产物在小鼠体内可激发良好的体液免疫应答。     

人乳头瘤病毒(HPV)L2肽免疫小鼠诱导的抗体水平与保护作用的关系研究

目的 检测HPV-58 L2 11～200 AA肽在动物体内对HPV的保护效果,并分析疫苗诱导的抗体滴度或中和抗体滴度与疫苗保护作用之间的对应关系.方法 利用大肠杆菌表达HPV-58L2 11～200 AA肽,纯化目的 蛋白并与铝佐剂吸附后免疫小鼠,利用小鼠HPV-58假病毒感染模型检测不同剂量的免疫原对小鼠的保护作用.通过ELISA和假病毒中和抗体检测方法 检测免疫血清中的总抗体水平和中和抗体水平,分析具有保护作用的抗体或中和抗体滴度.结果 当蛋白免疫剂量为8μg时,能够完全保护小鼠不受HPV假病毒的感染.小鼠免疫血清中的中和抗体水平较低,利用已建立的假病毒中和试验方法 检测不到血清中的中和抗体.而利用ELISA检测血清中的总抗体水平结果 显示,免疫血清中的总抗体水平与疫苗的保护效果之间存在对应关系,当抗体滴度大于等于1:25 000时,小鼠体内检测不到荧光信号,能够保护机体不受假病毒的感染.结论 HPV-58 L2 11～200 AA肽能够保护小鼠不受假病毒的感染,L2 11～200 AA肽具有较好的疫苗发展前景,其引发的总抗体水平可以作为评价保护效果的间接指标.     

登革病毒Ⅱ型E基因片段在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析

目的分析登革病毒Ⅱ型（DEN2）重组包膜蛋白的免疫原性，为登革Ⅱ型亚单位疫苗的研制奠定基础。方法扩增DEN2E基因片段（254—395AA），与表达载体pET-30a连接，构建重组表达载体，在大肠杆菌BL21（DE3）中表达重组蛋白。重组蛋白经高效液相色谱（HPLC）柱纯化后，进行阻断DEN2感染C6／36细胞试验，同时用重组蛋白免疫小鼠，采用中和实验法测定血清中和抗体效价。结果该基因片段在大肠杆菌中高效表达重组蛋白，重组蛋白可被抗DEN2多克隆抗体识别，纯化后的重组蛋白能有效地抑制DEN2感染C6／36细胞，经重组蛋白免疫的小鼠可产生中和抗体。结论表达的DEN2重组包膜蛋白具有良好的免疫原性，能诱导中和抗体的产生。     

登革病毒重组亚单位疫苗的构建及免疫原性分析

目的 构建登革病毒1～4型重组亚单位疫苗,分析重组疫苗的免疫原性.方法 利用连接肽将登革病毒1型与2型,3型与4型的外膜蛋白DⅢ基因片段连接在一起,克隆人原核表达载体pET-30a,在大肠埃希菌中表达DEN1/2型、DEN3/4型融合重组蛋白.重组蛋白经高效液相色谱柱分离纯化后,混和免疫小鼠,采用中和实验法测定血清中和抗体效价,同时进行乳鼠体内中和实验,观察中和抗体对乳鼠的免疫保护作用.结果 重组蛋白能诱导小鼠产生针对登革病毒1～4型的中和抗体,平均中和效价分别为1：34.9、1：45.3、1：24.7和1：38.4.中和抗体能保护新生乳鼠免受致死剂量DEN1～4的攻击,保护率分别为100%,100%,83%,83%.结论 构建的重组亚单位疫苗具有良好的免疫原性,能诱导小鼠产生中和抗体,为构建单一四价疫苗提供了实验室依据.     

基于PCR的乙型肝炎病毒体外中和试验

目的　建立一种新的基于PCR的乙型肝炎病毒(HBV)体外中和试验,将其用于HBV中和抗体的检测,为新型HBV疫苗的评估提供一种体外模型。方法　待检免疫血清与已知HBV作用后接种HepG2 细胞,吸附、洗涤、培养后提取细胞核酸,PCR检测HBVDNA以判断中和试验结果。结果　免疫血清与10倍最小PCR感染剂量的HBV作用后接种细胞,培养2 4h后检测表明,其中和滴度高,结果稳定。市售疫苗免疫小鼠血清、多数抗HBsELISA阳性人血清和2份含HBVS区的新型候选疫苗的免疫血清中和试验阳性,而正常小鼠血清、戊型肝炎病毒重组蛋白免疫血清和抗 HBs阴性人血清中和试验阴性。结论　基于PCR的HBV体外中和试验简单、快速、经济,具有良好的特异性和敏感性,可以用于新型HBV疫苗免疫效果的评估。     

牛AsiaⅠ型口蹄疫病毒重组蛋白疫苗的构建及功能研究

目的为了取代有安全隐患的牛AsiaⅠ型口蹄疫病毒灭活疫苗,我们构建了基因工程重组蛋白疫苗。方法应用PCR方法合成含有表位的基因片段,经过克隆连接获得重组基因,在大肠杆菌中表达后经镍亲和层析纯化重组蛋白。重组蛋白免疫豚鼠后,分别经ELISA和乳鼠中和实验检测血清中抗FMDV抗体水平。结果构建了牛AsiaⅠ型口蹄疫病毒重组蛋白疫苗的结构基因,并成功表达和纯化了该重组蛋白。功能实验表明,该蛋白在豚鼠体内诱生了高水平的抗牛AsiaⅠ型口蹄疫病毒的中和性抗体。结论该重组蛋白为制备牛AsiaⅠ型口蹄疫病毒新型疫苗提供了有价值的线索。     

重组杆状病毒表达HEV ORF2抗原片段

目的：用重组杆状病毒表达戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV)ORF2基因片段,并对其免疫学特性进行研究。方法：与中间转染载体pVL1393相连构建重组质粒,在Lipofectin介导下将其与杆状病毒线性DNA（BaculoGold^TM)共转染Sf9昆虫细胞得到重组病毒,用免疫荧光,Western blot等方法对表达产物进行免疫学特性初步研究,并进行动物免疫试验。结果：含ORF2结构基因片段的重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中获得了高效表达,经免疫荧光,Western blot,动物免疫试验证实该重组蛋白为HEV特异性蛋白,可刺激机体产生相应抗体。结论：重组杆状病毒能有效表达HEV抗原基因,所表达的ORF2重组蛋白具有HEV抗体识别的抗原表位,具有较好的抗原性和免疫原性。     

戊型肝炎病毒第Ⅳ基因型毒株中和抗原表位的鉴定

目的确定在我国新发现的戊型肝炎病毒（HEV）第Ⅳ基因型毒株的中和抗原表位特征及其与世界各地其他基因型HEV毒株中和抗原表位的异同。方法制备HEV第Ⅳ基因型ORF2重组衣壳蛋白p166Chn及其单克隆抗体（McAb），采用体外中和试验鉴定McAb的中和活性；通过间接ELISA和免疫印迹法测定中和性McAb与不同基因型HEVORF2编码蛋白p166的免疫反应性，并结合相加ELISA确定p166Chn中和抗原表位的分布和性质。结果获得6株稳定分泌抗-p166Chn McAb的杂交瘤细胞株。所得McAb能在体外中和HEV中国毒株（第Ⅳ基因型）对PLC/PRF／5细胞的感染性，并与来源于HEV4种不同基因型代表株的7种p166重组蛋白（p166Chn、p166Bur、p166Mor、p166Pak、p166Mex、p166Us和p166Nz）均能发生阳性反应。抗体间的相加ELISA结果为阴性。表明6株McAb识别p166上的同一个中和抗原表位。结论在我国新发现的HEV第Ⅳ基因型毒株与分布在世界各地的其他基因型毒株具有共同的中和抗原表位。     

Immunodominant epitopes mapped by synthetic peptides on the capsid protein of avian hepatitis E virus are non-protective

Avian hepatitis E virus (avian HEV) was recently discovered in chickens with hepatitis-splenomegaly syndrome in the United States. The open reading frame 2 (ORF2) protein of avian HEV has been shown to cross-react with human and swine HEV ORF2 proteins, and immunodominant antigenic epitopes on avian HEV ORF2 protein were identified in the predicted antigenic domains by synthetic peptides. However, whether these epitopes are protective against avian HEV infection has not been investigated. In this study, groups of chickens were immunized with keyhole limpet hemocyanin (KLH)-conjugated peptides and recombinant avian HEV ORF2 antigen followed by challenge with avian HEV virus to assess the protective capacity of these peptides containing the epitopes. While avian HEV ORF2 protein showed complete protection against infection, viremia and fecal virus shedding were found in all peptide-immunized chickens. Using purified IgY from normal, anti-peptide, and anti-avian HEV ORF2 chicken sera, an in-vitro neutralization and in-vivo monitoring assay was performed to further evaluate the neutralizing ability of anti-peptide IgY. Results showed that none of the anti-peptide IgY can neutralize avian HEV in vitro, as viremia, fecal virus shedding, and seroconversion appeared similarly in chickens inoculated with avian HEV mixed with anti-peptide IgY and chickens inoculated with avian HEV mixed with normal IgY. As expected, chickens inoculated with the avian HEV and anti-avian HEV ORF2 IgY mixture did not show detectable avian HEV infection. Taken together, the results of this study demonstrated that immunodominant epitopes on avian HEV ORF2 protein identified by synthetic peptides are non-protective, suggesting protective neutralizing epitope on avian HEV ORF2 may not be linear as is human HEV.     

Identification and characterization of the neutralization epitope(s) of the hepatitis E virus

The neutralization epitope(s) of the hepatitis E virus (HEV) was studied by an in vitro neutralization assay using antibodies obtained by immunization of mice with 51 overlapping 30-mer synthetic peptides spanning the region 221-660 amino acids (aa) of the HEV open reading frame 2 encoded protein (pORF2) and 31 overlapping recombinant proteins of different sizes derived from the entire pORF2 of the HEV Burma strain. Antibodies against synthetic peptides and short recombinant proteins of approximately 100 aa did not neutralize HEV, suggesting the HEV neutralization epitope(s) is conformation-dependent. However, one recombinant protein of approximately 400 aa in length comprising the pORF2 sequence at position 274-660 aa as well as all truncated derivatives of this protein containing region 452-617 aa elicited antibodies, demonstrating HEV neutralizing activity. These findings establish for the first time that the minimal size fragment, designated pB166, that can efficiently model the neutralization epitope(s) is 166 aa in length and is located at position 452-617 aa of the HEV pORF2. Additionally, antibodies against pB166 were found to cross-neutralize three different HEV genotypes, suggesting that a common neutralization epitope(s) may exist within the different HEV genotypes. Thus, recombinant proteins constructed in this study may be considered as potential candidates for the development of an HEV subunit vaccine as well as for the development of highly sensitive and specific diagnostic tests.     

GST与戊型肝炎病毒ORF2编码蛋白融合表达形成的新抗原表位的鉴定

目的:以戊型肝炎病毒(HEV)ORF2编码的重组蛋白p166为例,研究蛋白标签GST对融合表达的重组蛋白抗原结构的影响.方法:以HEV中国株重组蛋白p166Chn-GST为免疫原,制备单克隆抗体(mAb),与代表HEV 4个基因型的摩洛哥株、墨西哥株、美国株和中国株p166的GST或His融合蛋白、中国株非融合重组蛋白p179Chn以及GST融合的HEV无关蛋白进行ELISA检测,鉴定mAb所识别的抗原表位. 结果:获得3株稳定分泌抗p166Chn-GST的杂交瘤细胞株,分泌的mAb 1A8、9B4和8H10与p166Chn-GST反应,与GST不反应.其中1A8和9B4可与带GST标签的4种p166-GST蛋白以及N和C端截短的p146Chn-GST、p137Chn-GST反应,而不与4种p166-His蛋白反应,也不与p179Chn反应,与HEV病毒颗粒竞争试验阴性,与GST融合的HEV无关蛋白无交叉反应性,表明1A8和9B4识别的抗原表位不是HEV病毒颗粒表面天然存在的抗原表位,而是GST与HEV ORF2编码蛋白的465-601aa区段序列共同形成的新的抗原表位.结论:GST能够赋予基因工程重组蛋白以新的抗原特性,它与融合表达的重组蛋白可以共同形成新的抗原表位.     

酵母表达的戊型肝炎病毒结构区ORF2蛋白的免疫原性研究

目的 研究巴氏毕赤酵母表达系统表达的戊型肝炎病毒（Hepatitis Evirus,HEV)结构区ORF2蛋白的免疫原性。方法 将重组蛋白免疫BALB/c小鼠。首先通过亲和捕获反转录PCR鉴定免疫小鼠抗血清是否能结合感染HEV恒河猴粪便及胆汁中的病毒颗粒,其次将重组蛋白分别以不同免疫途径,不同佐剂免疫小鼠,通过检测小鼠血清中抗-HEVORF2抗体阳转率及抗体滴度,观察其免疫原性。结果 亲和捕获反转录PCR阳性,表明免疫鼠抗血清可以捕获感染恒河猴粪便及胆汁样品中的HEV。在小鼠免疫实验中,肌内免疫优于腹腔免疫,抗原联合铝佐剂及CpG佐剂及CpG佐剂优于抗原联合铝佐剂,以抗原联合铝佐剂和CpG佐剂经股四头肌免疫小鼠,4周后加强一次的免疫效果最佳,ED500为0.023μg,实验表明,巴氏毕赤酵母表达的重组HEVORF2蛋白刺激小鼠产生的抗体,不仅可以特异性结合天然HEV,而且该蛋白在小鼠体内可以有效地诱发体液免疫反应。结论 巴氏毕赤酵母表达系统表达的HEVORF2蛋白具有良好的免疫原性,这为新型戊型肝炎疫苗的研制奠定了基础。     

4型戊型肝炎病毒ORF2多肽的二聚体特性和抗原性特征

目的 研究4型戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)开放阅读框架2(open readingframe 2,ORF2)编码的多肽二聚体特性和抗原性特征.方法 从患者血清克隆HEV ORF2基因,在大肠杆菌中表达不同长度的ORF2多肽,并表达点突变多肽,纯化后在SDS-PAGE不同条件下分析二聚体特性,同时用Westem blot分析其抗原性特征.结果 由459～607位氨基酸构成的ORF2多肽能形成二聚体,而在氨基端截短13个氨基酸或在羧基端截短13个氨基酸均不形成二聚体,562位天冬酰胺、595位异亮氨酸分别突变后在SDS作用下仅以单体存在.Westem blot显示,抗-HEV仅与二聚体的ORF2多肽反应,而不与单体ORF2多肽或截短肽反应.结论 4型HEV ORF2多肽形成二聚体必须含有459～607位氨基酸,其中562位和595位氨基酸突变能影响二聚体的稳定性.该多肽的抗原性取决于二聚体结构.     

Expression of hepatitis E virus putative structural proteins in recombinant vaccinia viruses.

Hepatitis E virus (HEV) is a polyadenylated, positive-stranded RNA virus which is a major cause of enterically transmitted non-A, non-B hepatitis in many developing countries. The viral genome contains three different open reading frames (ORFs): ORF1, which is believed to encode nonstructural proteins, and ORF2 and ORF3, which are believed to encode structural proteins. The full-length putative structural proteins encoded by ORF2 and ORF3 of HEV have been cloned and expressed in recombinant vaccinia virus. Proteins encoded by ORF2 and ORF3 when expressed in vaccinia virus are recognized by pooled sera obtained from individuals with acute hepatitis E. Vaccinia-expressed viral gene products of HEV will have utility in characterizing the cell-mediated immune response to HEV.     

抗戊型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建与筛选

目的 :构建人抗戊型肝炎病毒 (HEV)噬菌体抗体库 ,筛选人源中和性抗HEV的单克隆抗体 (mAb)。方法 :取抗HEV抗体阳性的 6例HE患者静脉血 ,分离淋巴细胞 ,提取细胞总RNA后逆转录。用一组人IgGFab基因特异性引物 ,分别扩增IgGκ0轻链与重链Fd段基因。将κ轻链与Fd段基因先后克隆入噬菌体载体pComb3的相应位点 ,经电穿孔法转化大肠杆菌XL1 Blue ,再以辅助噬菌体VCSM13超感染 ,构建人抗HEV噬菌体抗体库。采用独特的 5轮筛选法 (逐渐降低抗原包被量 ,严格洗脱条件 ) ,以固相化的 4种含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原 ,筛选人噬菌体抗体库 ,并以ELISA鉴定噬菌体抗体。结果 :经数次电转化构建了容量为1.9× 10 7重组率为 80 %的κ轻链基因库 ;容量为 1.8× 10 7重组率为 2 0 %的Fab基因库。以含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原特异淘筛 5次 ,出现特异富集。ELISA鉴定第 5轮筛选产物 ,得到 4株与HEVORF2重组混合抗原具有较高亲和力的Fab噬菌体抗体 ,可能为中和抗体。结论 :成功地构建了人抗HEV噬菌体抗体库 ,并获得人源抗HEV特异性噬菌体抗体。     

肾综合征出血热病毒结构蛋白的纯化及免疫学特性分析

应用从肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）患者血清中提取的ＩｇＧ与活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ偶联，制备亲和层析柱，用此亲和层析柱从ＨＦＲＳＶ感染的小白鼠乳鼠鼠脑中提取出２种分子量为６７０００和５５０００的病毒结构蛋白。经ＥＬＩＳＡ证明，此病毒结构蛋白能与ＨＦＲＳ患者血清ＩｇＧ及抗ＨＦＲＳ病毒的ＭｃＡｂ反应，效价为１６０。与６株抗ＨＦＲＳＶＭｃＡｈ试验表明，此病毒结构蛋白能与Ｈ７株反应。血凝试验证明，此病毒蛋白不能凝集鹅红细胞、鸽血球和人＂Ｏ＂型血红细胞。将纯化的病毒结构蛋白免疫家兔，证明其有较强的免疫原性，可刺激家兔产生特异性抗体；微量中和试验及乳鼠中和试验证明，中和效价为２５６，说明纯化的病毒结构蛋白具有中和抗原位点；免疫血清对感染乳鼠有一定保护作用。     

4型戊型肝炎病毒重组衣壳研究及感染模型初探

目的 表达4型戊型肝炎病毒(HEV)开放式阅读框ORF2重组衣壳蛋白并初步建立用于4型HEV早期感染过程研究的细胞模型.方法 从猪胆汁中调取4型HEV ORF2的肽段(aa368-606)基因,并且利用大肠杆菌系统得到重组D66蛋白.结果 重组D66蛋白在水相中以二聚体为基本单位自组装成分子半径约为13 nm的颗粒.该颗粒与HEV感染的急性期、恢复期患者的血清均有较强的反应性.将D66颗粒与细胞共孵育,发现该颗粒可以与肝实质细胞系HepG2的细胞结合并进入细胞内,这种结合可被恢复期及急性期HEV患者血清所阻断.结论 这些结果表明重组D66蛋白颗粒,可以一定程度上模拟4型HEV的表面位点,并且可以特异性吸附并进入细胞,为进一步研究4型HEV感染的分子机制提供基础和平台.