ALK3基因敲除小鼠的繁育及基因鉴定

为了繁育和鉴定ALK3基因敲除小鼠,将引进的杂合子小鼠进行饲养并繁殖,繁殖成功后提取每种基因型小鼠组织基因组DNA,用PCR法进行鉴定,将其雄性杂合子与雌性杂合子交配。结果表明：ALK3杂合子小鼠的繁殖和饲养均获得成功,亦获得了较多的基因敲除纯合子小鼠。说明正确的饲养繁殖以及鉴定方法是从杂合子中获得ALK3基因敲除纯合子小鼠的有效途径。     

利用体外受精-胚胎移植技术进行ALK3基因敲除小鼠的保种鉴定

建立用于ALK3基因敲除小鼠品种保存的体外受精一胚胎移植(IVF-ET)模型.采用杂合子雌性ALK3小鼠卵子与杂合子雄性ALK3小鼠精子进行体外受精,收集2-cell,进行胚胎冷冻,1周后进行胚胎复苏移植,通过PCR方法进行子代鉴定.结果表明,冻存胚胎320枚,复苏获得存活胚胎96枚,移植80枚,产子23只,获得杂合子11只,通过体外受精一胚胎移植可对ALK3基因敲除小鼠进行保种鉴定.     

利用CRISPR/Cas9技术构建gdf11基因敲除小鼠及其表型鉴定

为了探讨敲除生长分化因子11(gdf11)基因对小鼠生长性状的影响,本试验根据gdf11基因序列设计向导RNA(sgRNA)并利用规律成蔟的短间隔回文重复序列和CRISPR相关蛋白(CRISPR/Cas9)基因编辑系统对该基因进行敲除,利用显微注射的方法获得gdf11敲除型F0代小鼠,通过聚合酶链式反应(PCR)和测序鉴定子代小鼠基因型。繁育后观察F1代小鼠形态,并采用骨架染色方法观察不同基因型小鼠的性状。结果显示,成功构建了gdf11基因敲除小鼠,并且通过繁育得到了野生型(gdf11^+/+)、杂合型(gdf11^+/-)和纯合型(gdf11^-/-)3种基因型的小鼠;形态观察发现,与野生型小鼠相比,纯合型小鼠在围产期死亡且尾巴是截断的,骨架染色显示,野生型小鼠有13个胸椎和6个腰椎,纯合型小鼠有18个胸椎和9个腰椎。结果表明,敲除gdf11基因可能会影响小鼠胚胎和中轴骨发育从而改变小鼠的生长性状。     

PCSK9基因工程小鼠的饲养繁殖及鉴定

本研究旨在对PCSK9基因工程小鼠进行繁育和鉴定,为研究人类高胆固醇血症等心血管疾病获得一种小鼠的疾病模型.基因工程小鼠由于数量较少,故在饲养繁育方面要求更高.本研究采用雄鼠或雌鼠与野生型小鼠长期合笼的方式进行繁殖,并利用PCR和琼脂糖凝胶电泳法对子代小鼠进行基因型鉴定,同时对PCR阳性结果进行测序验证,结果获得9只P...     

近交系基因敲除小鼠微卫星不稳定性分析

前期研究中选取了198个与基因突变和疾病相关的小鼠微卫星不稳定性位点,经对转基因和基因突变小鼠研究,发现有41个位点具有不稳定性.为了进一步确认这些位点与基因改变的相关性,本试验应用这41个微卫星位点对29种C57BL/6J基因敲除小鼠进行了检测,并将野生型C57BL/6J和129品系小鼠(ES供体)作为对照.通过PCR扩增,STR扫描和直接测序的方法检测微卫星的不稳定性.在41个微卫星位点中有10个位点在11种基因敲除小鼠中呈现不稳定性(24.4％,10/41).核心序列为三核苷酸的D3Mit22在9号基因敲除小鼠中显示不稳定性,其余40个位点的核心序列均为二核苷酸,有9个位点呈现不稳定性(22.5％,9/40);另一方面,29种基因敲除小鼠有11种出现了不稳定性(37.9％,11/29);(TG)n为核心序列的二核苷酸表现不稳定性的比率最大(50％,2/4),依次为(GT)n(27.27％,3/11)和(AG)n(25％,1/4),重复序列(CA)n、(CT)n分别为23.08％(3/13)和20％(1/5).克隆测序的结果显示,6种基因敲除小鼠呈现核心序列片段的插入,1种基因敲除小鼠则为缺失.有2个位点(D13Mit3和D14Mit102)在2种基因敲除小鼠中出现不稳定性,9号基因敲除小鼠在2个位点(D3Mit22和D13Mit3)呈现不稳定性.结果显示基因敲除小鼠出现了微卫星不稳定性.     

人血清白蛋白（HSA）轩基因小鼠的制备

以绵羊金属硫蛋白基因（ｍＴＭ）为启动子，构建了２种结构的ＨＳＡ质粒：ｐｏＭＴＨＳＡ和ｐｏＭＴＨＳＡＵＤ。其中ｐｏＭＴＨＳＡ是将ＨＳＡｃＤＮＡ直接置于ｏＭＴ启动子的控制下，以ＰＳＰＯＲＴ１为载体构建而成；而ＰＯＭＴＨＳＡＵＤ另融有ＨＳＡ基因５，３侧翼序列（包括内含子１，２，１３，１４）。将这２种结构的质粒用ＮｏｔⅠ线化后，注入昆明种小鼠受精卵的雄原核，再移植到假孕受体鼠的输卵管。共注射５７７枚受精     

利用体外受精-胚胎移植技术对ALK3基因敲除小鼠进行保种鉴定

目的建立用于ALK3基因敲除小鼠品种保存的体外受精-胚胎移植(IVF-ET)模型.方法取杂合子雌性ALK3小鼠卵子与杂合子雄性ALK3小鼠精子进行体外受精,收集2-cell,进行胚胎冷冻,1周后进行胚胎复苏移植,通过PCR方法对仔代鉴定.结果冻存胚胎242枚,复苏获得存活胚胎196枚,移植78枚,产仔19只,获得杂合子...     

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定

目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法.方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔,分离获取小鼠腹腔巨噬细胞,在含有10％成牛血清的DMEM培养液中培养.采用倒置显微镜观察细胞形态,台盼蓝染色计算存活率,瑞氏染色计算纯度.结果获得高纯度的巨噬细胞,具备巨噬细胞的形态特征.结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法.     

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定

目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔,分离获取小鼠腹腔巨噬细胞,在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态,台盼蓝染色计算存活率,瑞氏染色计算纯度。结果获得高纯度的巨噬细胞,具备巨噬细胞的形态特征。结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。     

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定

目的:建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。方法:以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔,分离获取小鼠腹腔巨噬细胞,在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态,台盼蓝染色计算存活率,瑞氏染色计算纯度。结果:获得高纯度的巨噬细胞,具备巨噬细胞的形态特征。结论:该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。     

静脉滴注心房利钠肽对阿勒泰羊血液脂代谢激素的影响及尾脂转录组分析

旨在研究静脉滴注心房利钠肽（ANP）对绵羊血液中脂代谢激素及尾脂转录组的影响,为阐明ANP在调节绵羊脂代谢中的作用机理提供参考。本试验选取体重为（45.6±6.5） kg、健康状况良好、1.5岁阿勒泰母羊8只,试验采用自身对照设计,对照期颈静脉滴注100 mL生理盐水45 min;试验期以1.125 μg·kg^-1 BW颈静脉滴注100 mL ANP生理盐水溶液45 min,连续静脉滴注ANP 4 d,各期均在试验结束当天（即第4天）滴注开始后0、15、30、45、60、90和120 min采集血液,分离血浆,测定ANP、脂联素、胰岛素、瘦素和环鸟苷酸水平;每期采集尾脂,进行转录组测序及生物学信息分析,并采用实时荧光定量PCR技术检测候选基因相对表达量的变化。结果显示：1）静脉滴注ANP后,较对照期,试验期血浆ANP含量在30、90 min时显著增加（P<0.05）;血浆脂联素含量在30 min时显著增加（P<0.05）,在90 min时极显著增加（P<0.01）;cGMP含量在30、90 min时极显著增加（P<0.01）,在45、60 min时显著增加（P<0.05）;胰岛素含量在0、30、120 min时极显著增加（P<0.01）,在15、45、60、90 min时显著增加（P<0.05）;瘦素含量在0、15 min时显著增加（P<0.05）,在30 min时极显著增加（P<0.01）。2）转录组分析表明,共3 686个差异表达基因,其中1 482个基因上调表达、2 204个基因下调表达;GO功能富集分析显示,差异基因显著富集到118个生物学功能,主要与线粒体呼吸链和氧化磷酸化有关;KEGG通路分析表明,差异基因显著富集到46条通路中,主要参与核糖体、产热、氧化磷酸化和调节脂肪细胞中的脂肪分解等信号通路;qRT-PCR分析结果表明,AQP7、FABP4、PLIN5、ADIPOR2、MGLL、IDE和ACSL1表达趋势与RNA-seq结果一致。由此可见,外源ANP通过改变脂代谢相关激素水平及增加绵羊脂肪组织氧化磷酸化和产热促进脂肪分解。     

Expression Analysis of C-type Natriuretic Peptide and Its Receptor in Buffalo Follicles

In order to investigate the expression pattern of C-type natriuretic peptide（CNP）and its receptors（NPR）in buffalo follicles,firstly,the mRNA expression level of ANP,BNP,CNP,NPR1 and NPR2 in ovary were assayed by Real-time quantitative PCR;Secondly,the protein expression of CNP and NPR2 in buffalo follicles were detected by immunohistochemical stainning method;Lastly,the mRNA expression level of CNP and NPR2 in granule cells and cumulus cells were assayed by Real-time quantitative PCR.The results showed that CNP gene and its receptor NPR2 mainly expressed in buffalo ovary,the protein of CNP and NPR2 expressed in all stages of follicles,CNP mainly expressed in mural granulosa cells and NPR2 primarily presented in cumulus cells,the mRNA expression of CNP gene in granule cells was significantly higher than cumulus cells（P<0.05),whereas the mRNA expression of NPR2 gene in cumulus cells was significantly higher than granule cells（P<0.05).In conclusion,among the main members of natriuretic peptides and its receptors,CNP and NPR2 presented strong expression in buffalo ovary.CNP mainly expressed in mural granulosa cells,but NPR2 primarily presented in cumulus cells which arounding oocytes.     

C型利钠肽及其受体在水牛卵泡中的表达分析

为了探明C型利钠肽（C-type natriuretic peptide,CNP）及其受体（natriuretic peptide receptor,NPR）在水牛卵泡中的表达模式,本研究首先采用实时荧光定量PCR技术检测水牛卵巢中利钠肽家族主要成员A型、B型、C型利钠肽（ANP、BNP、CNP）及其Ⅰ型、Ⅱ型受体（NPR1、NPR2）的mRNA表达情况,然后利用免疫组化技术对水牛卵泡中CNP及NPR2蛋白进行定位,最后利用实时荧光定量PCR技术检测颗粒细胞和卵丘细胞中CNP及NPR2的mRNA表达规律。结果显示,水牛卵巢主要表达CNP及NPR2,且在各级卵泡中均有表达,其中,CNP主要在壁层颗粒细胞中表达,NPR2主要在卵丘细胞中表达;颗粒细胞上CNP mRNA表达水平显著高于卵母细胞周围的卵丘细胞（P<0.05）,而卵丘细胞上NPR2 mRNA表达水平显著高于颗粒细胞（P<0.05）。综上所述,在利钠肽主要家族成员和受体中,CNP和NPR2在水牛卵巢中呈现强表达,CNP主要在壁层颗粒细胞中表达,而NPR2主要在卵母细胞周围的卵丘细胞中表达。     

心钠素在肉鸡腹水综合征发生发展中的作用

大群艾维菌商品代肉鸡从1日龄起用高能日粮常规饲养，以获得自然腹水综合征（ascites syndrome，AS）病例。应用放射免疫分析方法，分别测定了2～6周龄正常组、轻度腹水组、重度腹水组内鸡血浆和5周龄时心、肝、肺、肾等组织心钠素（atrial natriuretic polypeptide,ANP）的含量；用右心导管法测定了平均肺动脉压（mPAP），并用常规方法测定了腹水心脏指数（AHI），同时还对血浆ANP的含量与AHI、mPAP的相关性进行了分析。结果发现，随着日龄的增长，ANP的含量增加，AHI、mPAP也随着发生明显的变化；随腹水程度的加深，mPAP、AHI以及肉鸡血浆、组织ANP的含量均显著（P〈0．05）或极显著（P〈0．01）升高，组织中ANP的含量明显比血浆中的高；另外还发现，不同腹水程度肉鸡血浆ANP含量与5～6周龄时的mPAP、4～5周龄时的AHI相关性显著（P〈0．05）。结果表明，ANP参与了肉鸡AS的发生和发展过程并与肉鸡发生AS的程度有密切关系。     

Mechanism of C-type Natriuretic Peptide Regulating Lipid Deposition of Intramuscular Adipocytes in Chickens

The aim of this study was to investigate the regulatory effect and mechanism of C-type natriuretic peptide (CNP) on the proliferation,differentiation and lipolysis of intramuscular preadipocytes (IMPs) in breast muscle of chickens,and lay a foundation on further elucidating the molecular mechanism of intramuscular fat deposition in chickens.The IMPs of breast muscle in Yellow-feathered broilers were used as the model in vitro,the preadipocytes were induced by 10^-7 mol/L CNP.The proliferation,differentiation and lipolysis of IMPs were observed by CCK8,Edu staining,Oil Red O staining and isopropanol extraction,respectively.The concentration of cGMP and glycerin were detected by cGMP and glycerin kit,respectively.The expression of NPRA,NPRB and NPRC genes mRNA was detected by Real-time quantitative PCR.The results showed that compared with control group,the cell proliferation in CNP treatment group was enhanced significantly at 1 and 3 d (P<0.05).The cell differentiation and lipid deposition were extremely significantly decreased at 3 and 6 d (P<0.01),the intracellular cGMP concentration and glycerin concentration in the medium at 3 and 6 d were extremely significantly increased (P<0.01).The expression of NPRB and NPRC genes mRNA in CNP treatment group was extremely significantly or significantly higher than control group (P<0.01;P<0.05),and the expression of NPRA gene mRNA had no significant difference (P>0.05).The results revealed that CNP regulated the lipid deposition of intramuscular adipocytes through NPRB/NPRC-cGMP pathway in chickens.     

C-型利钠肽调控鸡肌内脂肪细胞脂肪沉积的作用机制研究

本研究旨在探讨C型利钠肽（CNP）对鸡胸肌组织肌内前脂肪细胞的增殖、分化和分解的调控作用及机制,为进一步阐明肌内脂肪沉积的分子机制奠定基础。以黄羽肉鸡胸肌组织的肌内前脂肪细胞作为体外研究模型,利用10^-7 mol/L CNP激素外源诱导前脂肪细胞,采用CCK8、Edu染色法观察肌内前脂肪细胞增殖的变化,油红O染色和异丙醇萃取法观察脂肪分化和沉积的变化;利用试剂盒检测细胞内cGMP及甘油浓度变化;实时荧光定量PCR检测利钠肽受体A、B、C（NPRA、NPRB和NPRC）的表达变化。结果显示,与对照组相比,CNP诱导前脂肪细胞1和3 d后,细胞的增殖能力显著升高（P<0.05）;CNP诱导3和6 d后,诱导组脂肪细胞的分化和脂滴沉积能力极显著降低（P<0.01）,释放到培养基的甘油浓度及细胞中的cGMP的浓度极显著升高（P<0.01）。NPRB和NPRC基因mRNA的表达极显著和显著高于对照组（P<0.01;P<0.05）,NPRA基因mRNA的表达无显著变化（P>0.05）。本试验结果表明,CNP通过NPRB/NPRC-cGMP通路调控肉鸡肌内脂肪细胞的脂代谢过程。     

Usefulness of cardiac hormones for evaluating valvular disease in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis)

Nonhuman primates are commonly used as experimental animals due to their biological resemblance to humans. In patients with cardiac disease, the levels of atrial natriuretic peptide (ANP) and brain natriuretic peptide (BNP) tend to increase in response to cardiac damage, and they are thus used as indicators for the diagnosis of human heart failure. However, no reference values for ANP and BNP have been reported for heart disease in nonhuman primates. In this study, we recorded the age, sex, and body weight of 202 cynomolgus monkeys, and performed evaluations to assess the ANP and BNP levels, electrocardiography and echocardiography, and accordingly divided the monkeys into two groups: healthy monkeys and those with spontaneous cardiac disease. Statistical analysis was performed to determine the relationship of ANP and BNP with the factors of age, sex, and body weight. No significant relationship was found between the levels of ANP and BNP and the factors of age, sex, and body weight. However, both the ANP and BNP levels were significantly different between the healthy monkeys and monkeys with valvular disease. Similar to humans, the ANP and BNP levels tended to increase with the progression of cardiac disease in monkeys. Based on these results, we concluded that ANP and BNP are indicators of cardiac disease in nonhuman primates, and that this nonhuman primate cardiac disease model is applicable for cardiology research in humans.     

果蝇Drosomycin基因(drs)的克隆鉴定

为了克隆Drosomycin基因用于今后定点诱变修饰和生物技术开发研究 ,根据果蝇Drosomycin基因 (drs)的cDNA序列 ,分别设计Drosomycin基因含和不含信号肽序列的两对特异引物Drs1/Drs2、Dro3/Dro4 ,由黑腹果蝇(DrosophilamelanogasterMeigen)基因组PCR扩增获得目的片段drs和dro ,克隆到表达载体pET 2 1d(+)和pHIL S1之中。经测序表明 ,克隆的drs与文献报道的drs序列仅在 +116位点有 1个碱基的差异 (A/T) ,而克隆的dro序列则与文献报道的dro序列完全相同。     

近交系高表达HBV转基因小鼠的建立及表达传代稳定性

将纯化的高表达 1.3copy HBV全基因 ,通过原核显微注射方法 ,建立了近交系 ( Balb/ c)高表达 HBV转基因小鼠模型 ,以血清 HBs Ag为检测指标 ,对该转基因鼠 HBV基因持续表达水平和数代遗传稳定性进行了研究。结果 ,获高表达 HBV( 1.3copy)转基因 Balb/ c小鼠 Founder 2只 ,用回交传代方法 ,本 HBV转基因小鼠已稳定传至第 8代 ,每代转基因鼠阳性率平均保持在 4 4 .6 7% ,性别对 HBV转基因小鼠总体阳性率有影响 ,雄性小鼠的阳性率 ( 4 4.15 % )明显高于雌性小鼠 ( 4 2 .2 6 % ) ( P<0 .0 5 ) ;血清表达 HBs Ag水平较稳定 ,平均为 ( 85 3.2 8± 2 35 .4 3)μg/ L ,雌雄小鼠之间表达水平没有明显差异。     

猪卵泡抑素基因成熟肽序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据猪卵泡抑素(follistatin,FS)基因编码区序列(GenBank登录号:M36512.1)设计并合成1对引物,经PCR扩增获得了FS基因成熟肽序列,将其克隆入pMD18-T载体并转化E.coli DH5α感受态细胞,进行PCR、双酶切及测序验证。然后将其克隆到表达载体pRSET-A的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间,构建重组质粒pR-FS并转化E.coli BL21(DE3) 感受态细胞,再经PCR、双酶切和测序验证。转化重组质粒pR-FS的重组菌经IPTG诱导后的表达产物进行SDS-PAGE分析,分子质量与预期相符,为26.1 ku左右,经0.2 mmol/L IPTG诱导3 h之后表达量达到最高,约占总菌体蛋白的30%。表达产物可经Ni-NTA凝胶纯化。以上结果表明正确完成了猪FS基因成熟肽序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达及纯化。