疯草内生真菌Undifilum oxytropis次级代谢产物分析

为阐明疯草内生真菌Undifilum oxytropis次级代谢产物的化学组成,为其生物活性研究和开发利用提供依据,以本实验室保存的疯草内生真菌Undifilum oxytropis为研究菌株,采用察氏液体培养基对该菌发酵培养30d,收集菌丝体和发酵液,按照植物化学成分传统预试方法进行预试。在此基础上用不同极性有机溶剂梯度萃取得到菌丝体和发酵液石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和正丁醇相,经薄层色谱检测及气相检测方法对其次级代谢产物进行初步分析。系统预试表明,Undifilum oxytropis发酵产物中含有生物碱、蛋白质、酚类与鞣质、黄酮类、醌类、挥发油和油脂等物质;薄层色谱检测发现,Undifilum oxytropis发酵产物中至少含有5种化合物,且菌丝体和发酵液正丁醇相均有苦马豆素及其类似物存在;气相色谱分析Undifilum oxytropis发酵液中苦马豆素含量为5.17×10~(-3)g/L。疯草内生真菌Undifilum oxytropis发酵产物含有苦马豆素等多种次级代谢产物。     

产苦马豆素疯草内生真菌U.oxytropis的发酵培养及苦马豆素检测方法的建立

通过对生长初期疯草内生真菌U.oxytropis菌丝复苏后连续培养32d,每隔4d取样1次,并设3个平行培养组,测定其不同培养时期菌丝干重变化,利用超声减压旋蒸法提取菌丝和发酵液中苦马豆素(SW),并分别利用薄层层析法、气相色谱法和α-甘露糖苷酶抑制法对菌丝、发酵液中SW含量进行测定。结果显示,经测定疯草内生真菌U.oxytropis菌丝干重质量,确定疯草内生真菌U.oxytropis生长周期为24d;薄层层析法、气相色谱法和α-甘露糖苷酶抑制法都可快速对菌丝和发酵液中提取的SW进行定性、定量检测,并比较3种检测方法,发现气相色谱法检测限低、灵敏度更高。本试验完成了疯草内生真菌U.oxytropis生长周期的测定,并建立了菌丝、发酵液中SW的有效、快速提取及检测方法,为下一步产苦马豆素疯草内生真菌U.oxytropis生物合成机理的研究奠定基础。     

产苦马豆素疯草内生真菌及苦马豆素研究进展

疯草(Locoweed)是黄芪属、棘豆属和苦马豆属中含苦马豆素(swainsonine, SW)有毒植物的统称,具有抗旱耐寒,分布广泛的特性。牲畜长期采食疯草会引起蓄积性中毒,严重时导致死亡,严重危害了我国草原畜牧业的可持续发展。疯草内生真菌是疯草具有毒性的根本原因,其毒性代谢产物即苦马豆素。论文对疯草在中国的种类与分布、疯草与内生真菌互作关系、疯草内生真菌种属及检测方法、疯草内生真菌传播方式与内生真菌育种;苦马豆素的来源、毒理机制及生物合成通路最新研究进展做一综述,以期为疯草植株及其内生真菌的改造利用方面提供参考。     

宁夏黄花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离及鉴定

对宁夏黄花棘豆中产苦马豆素内生真菌进行分离和鉴定,为进一步研究疯草内生真菌合成苦马豆素的分子调控机理提供菌种和奠定基础。分离并纯化黄花棘豆植物组织中的真菌,采用气相色谱质谱联用法对各菌株菌丝中的苦马豆素进行分析,筛选能产生苦马豆素的内生真菌;紫外线照射和黑暗交替培养诱导内生真菌产孢;提取真菌DNA,扩增和测定真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GPD）、内部转录间隔区（internal transcribed space,ITS）和线粒体核糖体小亚基（mitochondrial small subunit,mt SSU）基因序列,进行同源性比对和遗传进化分析,对其进行种属分类和命名。本研究从宁夏黄花棘豆中共分离到5株真菌,其中菌株NX-FEL001菌丝中含有苦马豆素,经诱导培养,该菌株能产生分生孢子及分生孢子梗等结构;序列同源性和系统发育分析结果表明,该菌株与Undifilum真菌的亲缘关系最近,根据形态结构和分子进化分析结果将菌株NX-FEL001鉴定为Undifilum oxytropis。     

产苦马豆素疯草内生真菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据疯草内生真菌苦马豆素合成基因簇中swn K 基因KS 区域设计引物,构建SYGR Green I实时荧光定量PCR检测方法,初步分析黄花棘豆植物样品中内生真菌生物量与苦马豆素含量的关系.结果表明,基于swnK基因KS区域构建的实时荧光定量PCR法特异性较好,灵敏性较高,当真菌起始DNA浓度在0.009?90ng/μ...     

疯草内生真菌苦马豆素合成相关基因及其研究方法的进展

<正>豆科棘豆属(Oxytropis)和黄芪属(Astragalus)有毒植物统称为疯草。疯草的营养价值丰富,是潜在的优良牧草。但家畜长期或过量采食后,可发生以神经机能紊乱为特征的慢性中毒病,称之为疯草中毒病[1]。中毒家畜表现为共济失调、瘫痪、流产、不孕、出生缺陷和死亡等。疯草导致动物中毒的主要因素是疯草中的吲哚里西啶类生物碱—苦马豆素,它能特异性地抑制参与糖蛋白分解代谢的溶酶体α-甘露糖苷酶、高尔基α-甘露糖苷酶Ⅱ,破坏细胞内膜系统[2-     

不同因素对疯草内生真菌合成苦马豆素的影响

研究不同因素对疯草内生真菌——Undifilum oxytropis合成苦马豆素的影响,筛选出显著影响U.oxytropis苦马豆素合成的因素。将U.oxytropis分别接种到不同pH或不同浓度聚乙二醇(PEG)、L-哌可酸、L-赖氨酸、α-酮戊二酸的培养基中培养,测定菌丝及其发酵液中苦马豆素,分析各条件下真菌苦马豆素产率的变化。结果表明:当pH在4.5~6.5时,随pH增加,真菌SW产率显著增加(P0.05);当PEG质量浓度在0~32g·L-1时,随PEG增加,真菌苦马豆素产率显著降低(P0.01);当在培养基中添加相同量(10-3 mol·L-1)的L-哌可酸、L-赖氨酸、ɑ-酮戊二酸时,L-哌可酸添加组的苦马豆素产率显著降低(P0.05),L-赖氨酸添加组苦马豆素产率显著增加(P0.05);当L-哌可酸的初始浓度为10-3和10-2 mol·L-1时,真菌的苦马豆素产率显著下降(P0.05),当其浓度为10-4 mol·L-1时,苦马豆素产率显著增加(P0.01);当L-赖氨酸的初始浓度为10-1、10-2或10-4mol·L-1时,真菌苦马豆素产率显著降低(P0.05)。当ɑ-酮戊二酸的初始浓度分别为10-1、10-2、10-3 mol·L-1时,真菌的苦马豆素产率显著降低(P0.05)。由试验可知,低pH或添加PEG可抑制U.oxytropis中苦马豆素的合成,L-哌可酸、L-赖氨酸、α-酮戊二酸均对U.oxytropis的苦马豆素合成产生显著影响,但对苦马豆素合成的影响与各物质在培养基中的浓度密切相关。     

小花棘豆产苦马豆素内生真菌的筛选与鉴定

通过对小花棘豆内生真菌的分离纯化,筛选产苦马豆素内生真菌,探讨小花棘豆内生真菌与其毒性成分苦马豆素的相互关系。本研究对采自内蒙古西部草地的6份小花棘豆样品进行内生真菌分离纯化,采用薄层色谱和气相色谱技术对内生真菌发酵液进行苦马豆素定性、定量检测,筛选产苦马豆素内生真菌;结合形态学和分子生物学方法进行内生真菌种属鉴定。从小花棘豆样品中分离得到6株内生真菌。经筛选,其中有2株产苦马豆素,编号为XJ-J-I和XJ-H-1,其发酵液中苦马豆素产量分别为4.209 2mg.L-1和16.733 8mg.L-1。鉴定结果表明,这2株内生真菌虽然形态学存在差异,但基因型相同,同属镰刀属内生真菌—层出镰刀菌(Fusarium prolifera-tum)。小花棘豆中存在产苦马豆素内生真菌。     

棘豆属植物中产苦马豆素内生真菌的研究进展

苦马豆素(SW)是棘豆属(Oxytropis)植物引起家畜中毒的主要原因,而苦马豆素的产生与棘豆属植物的内生真菌有关。目前,棘豆属植物中能够产生苦马豆素的内生真菌不断被发现,所以文章对产苦马豆素内生真菌的寄主植物、形态、培养条件及其与苦马豆素的关系、对寄主植物的影响等进行了综述,为棘豆属植物的有效利用及家畜中毒的防治提供理论依据。     

薄层扫描测定5种疯草中苦马豆素含量

称取甘肃棘豆粉200g，变异黄芪粉200g，茎直黄芪粉171g，毛瓣棘豆粉174g，冰川棘豆粉200g，甲醇渗漉，回收甲醇，浸膏用1mol/L HCl溶解，过阳离子交换柱，洗脱液75℃水浴挥干，残留物先用甲醇溶解，回收甲醇后再用氨性氯仿溶解，回收氯仿，分别得到总生物碱214、117．5、75．4、33．1、10．5mg。甲醇溶解总生物碱与苦马豆素标准品，定量点样于硅胶板，显色后薄层扫描得出甘萧棘豆、变异黄芪、茎直黄芪、毛瓣棘豆和冰川棘豆中苦马豆素的含量分别为0．106、0．030、0．053、0．032、0．020mg/g.     

利用亚硝基胍诱变和高通量测序技术分析疯草内生真菌产SW生物合成通路

阐明产苦马豆素(swainsonine,SW)疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis中SW的生物合成通路,可以为生物发酵获得大量SW用于抗肿瘤应用和疯草的脱毒育种奠定理论基础和技术支撑。采用不同作用剂量的化学诱变剂亚硝基胍,在28℃,120r·min^-1与Alternaria Section Undifilum oxytropis孢子悬液分别作用5、10、15、20、25、30min,选取生长良好的菌株接种PDA培养基,连续培养发酵24d,应用α-甘露糖苷酶活性分析法检测菌丝及发酵液中SW含量,评价其传代及产SW稳定性。联合使用玻璃珠、液氮破壁法预处理菌丝,选用真菌基因组提取试剂盒提取原始菌株和突变株D4基因组DNA,经纯化、酶切、构建菌株DNA文库,并应用荧光定量PCR法检测评价文库构建质量,利用Ion torrent PGM^TM测序平台进行突变株和原始株高通量全基因组测序。结果表明,经化学诱变成功获得1株突变株D4,利用MIRA软件对高通量测序序列拼接、组装,分别获得突变株D4和原始株相关基因组片段19、21条,经BLAST、GO分析,注释到AlternariaSection Undifilum oxytropis生物合成SW的关键基因SwnK、SwnH2、SwnH1、SwnR和关键酶putative amino acid transporter、pyrroline-5-carboxylate reductase、formate/glycerate dehydrogenase catalytic、saccharopine reductase-like protein,并结合KEGG数据库,预测了AlternariaSection Undifilum oxytropis产SW可能的生物合成通路。本研究为揭示AlternariaSection Undifilum oxytropis生物合成SW机制作出了新的探索尝试。     

内蒙古不同小花棘豆种群苦马豆素及其内生真菌关系的分析

小花棘豆是广泛分布于内蒙古草原和荒漠区的一种有毒植物,其主要毒性成分为有毒生物碱——苦马豆素（swainsonine,SW）,牲畜采食后可引起中毒,甚至死亡,给当地畜牧业造成重大经济损失。本研究旨在探究内蒙古不同小花棘豆种群植株苦马豆素及其与内生真菌关系。采集内蒙古8个样地120株小花棘豆,利用萃取、离心、离子交换层析法提取和纯化植物单株和菌丝体的SW,用气相色谱-质谱联用法（GC-MS）检测SW水平,取茎和叶外植体分离培养内生真菌,提取植物和真菌的总DNA,扩增真菌特异序列,利用内生真菌微生物学特征和DNA序列比对进行鉴定。结果显示：8个种群共111株小花棘豆检测出SW,最高水平为369.05 μg·g^-1,平均水平32.78 μg·g^-1,从38株小花棘豆分离培养出内生真菌,纯培养下菌丝体呈松散白色绒毛状,菌落圆形、隆起、边缘整齐、辐射状生长,颜色逐渐呈现灰色、深灰色或褐色至深褐色,内生真菌均测出SW,其水平为0.83~2 573.24 μg·g^-1,经微生物学研究及5.8S rDNA/ITS序列比对分析,在属水平上鉴定该内生真菌为Alternaria。有Alternaria内生真菌的小花棘豆植株含SW,无该内生真菌的植株不含SW,培养的Alternaria内生真菌合成了SW。     

小花棘豆添加量对卡拉库尔羊利用青贮饲料的影响

试验选用9只健康的雄性卡拉库尔公羊为试验动物,采用全收粪消化试验方法,研究不同的小花棘豆添加量下卡拉库尔羊对青贮饲料的利用率。试验结果表明,小花棘豆添加量在400 g/d和800 g/d时,卡拉库尔羊干物质、粗蛋白、粗脂肪和矿物质采食量均有所提高,NDF和ADF采食量降低;卡拉库尔羊干物质、粗蛋白、粗脂肪、矿物质和ADF的消化率均显著增高,NDF消化率变化不显著。通过对试验羊AMA、AKP、BUN、GOT、GPT、LDH活性的监测,400 g/d和800 g/d的小花棘豆添加量对卡拉库尔羊的健康无明显影响。     

紫花苜蓿保卫细胞原生质体的制备

为了获得紫花苜蓿(Medicago sativa)保卫细胞原生质体,并为后续的紫花苜蓿保卫细胞原生质体的相关研究奠定基础,本研究探索了适合紫花苜蓿保卫细胞的提取方法。利用研磨和匀浆机处理的方式获得表皮条,将获得的表皮条再通过两步酶解法去除残留的叶肉细胞和细胞壁,并经多次过滤和离心获得保卫细胞原生质体。最后统计原生质体数目并用FDA染色检测保卫细胞原生质体活性。结果表明,本研究成功分离并获得了高活性的紫花苜蓿保卫细胞原生质体。每5片成熟叶获得1 000个保卫细胞原生质体,经FDA染色后在荧光下显示活性保卫细胞原生质体占90%以上。     

披针叶黄华内生真菌的分离与鉴定

旨在探讨有毒植物披针叶黄华内生真菌种类与种群分布情况,本试验以采自青海的披针叶黄华为试验材料,用表面消毒法对样品消毒后进行内生真菌分离,结合形态学鉴定和5.8S rDNA-ITS序列分析对分离菌株进行种属鉴定,并应用MEGA7.0软件进行系统发育分析。结果显示,从披针叶黄华中共分离获得29种内生真菌,分属于7纲、9目、11科、12属。披针叶黄华内生真菌总相对分离频率为79.31%,其中,叶的内生真菌种类最多（41.38%）,茎次之（37.93%）,种子（13.79%）和根（6.90%）相对较少;根据系统发育分析,所有内生真菌分属于两大种群,种群间亲缘关系较近。综上表明,披针叶黄华内生真菌种类丰富,青霉属是优势菌属。     

嗜线虫真菌制剂研制及其防治绵羊胃肠道线虫病的效果

用WA或PA琼脂平板制备嗜线虫真菌一级种子,用以小麦为基质加土豆汁的固体培养基或以土豆汁、微量盐为基础的液体培养基制备二级种子。再以上述固体培养基进行扩大培养,26℃培养3-4周,制剂厚垣孢子量可达1×106/g。研究了该制剂不经胃肠道和经胃肠道捕杀幼虫的生物学活性。用1×106/kg体重的剂量饲喂绵羊,对围栏草场中人工感染胃肠道线虫的绵羊进行生物防治临床效果观察,试验组羊克粪便虫卵数较对照组减少87.5%,草场中感染性幼虫减少82.6%,该制剂对绵羊胃肠道线虫病有良好的生物防治效果。     

Preparation and Identification of Monoclonal Antibody Against Swainsonine

In this test,BALB/c mice were immunized by SW-OVA for the preparation of monoclonal antibody against swainsonine (SW). Hybridoma cells that could secrete specific antibody against SW were prepared by hybridoma technique,and then the strain that secreted monoclonal antibody against SW designated 1F10 was prepared,and the chromosome average number of 1F10 cell was 45 to 50 couples. The ELISA titers of cell supernatant were 1:25 600, and that of ascites were 1:80 000.The subclasses of monoclonal antibody was IgG1,and the affinity constant was 1.14×10¹⁰,the purity of ascites antibodies was up to 98%,and the recovery rate was 80%.The result of sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis proved that purified antibody had been obtained that the molecular weight of H-chain and L-chain of antibody was about 50 and 25 ku. The monoclonal antibody against SW specifically bound to SW determined by Western blotting. The linear range was 4 to 128 μg/mL (R²=0.9969) and no cross-reactivity was detected with BSA,gelatin,polylysine,me-Gal,etc. The result laid the foundation for immunodetection on SW and immunological prevention of animal toxic disease.     

苦马豆素单克隆抗体的制备与鉴定

本试验采用苦马豆素（swainsonine,SW）人工抗原SW-OVA免疫接种BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术建立了1株能稳定分泌SW单克隆抗体的杂交瘤细胞1F10,杂交瘤细胞染色体数目为45~50对。经间接ELISA检测,该株细胞培养上清中抗体效价为1：25 600,诱生腹水效价为1：80 000。单克隆抗体的亚型为IgG1,亲和力解离常数为1.14×10¹⁰,腹水抗体纯化后纯度可达98%,回收率80%,SDS-PAGE凝胶电泳可见单克隆抗体的轻链、重链分子质量分别为25和50 ku,Western blotting检测抗体能特异性的识别SW。其线性检测范围为4~128 μg/mL（R²=0.9969）,与BSA、明胶、多聚赖氨酸、α-甘露糖苷等无交叉反应。本试验制备的SW单克隆抗体为免疫学检测SW和免疫学防制家畜疯草中毒奠定基础。