神经生长因子诱导神经干细胞分化的作用机制探讨

目的探讨神经生长因子(NGF)对体外培养的小鼠神经干细胞(NSCs)分化为神经元的作用及可能机制。方法以无血清培养法从孕13～14 d的昆明小鼠大脑皮质分离培养获得NSCs,传至3代后,进行NGF处理,并对培养的细胞进行MAP-2免疫细胞化学染色,荧光显微镜下对MAP-2阳性细胞进行计数。同时运用蛋白免疫印迹法(Western blot)考察NGF对TrkA、Akt、Erk磷酸化水平的影响;在研究NGF作用的信号转导通路时,预先给予各种信号通路抑制剂处理,再进行NGF干预,通过MAP-2染色及Western blot考察NGF促进神经干细胞分化为神经元的信号通路。结果 NGF可以显著促使NSCs分化为神经元并可以促进TrkA、Akt和Erk的磷酸化,呈现剂量和时间依赖性;各种通路抑制剂结果显示PI3K/Akt抑制剂可以阻断NGF对Akt的磷酸化作用,同时阻断了NGF对NSCs的促分化作用,MAPK抑制剂处理可以阻断NGF对Erk的磷酸化作用,但未见明显阻断NGF的促分化作用。结论 NGF可以促进NSCs分化为神经元,其作用机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。     

C5a激活Akt1⁃ERK1/2通路促进NSCLC细胞的增殖和迁移

目的：探讨C5a对非小细胞肺癌（non?small cell lung cancer,NSCLC）细胞增殖和迁移的影响及其潜在的分子机制。方法：RT?PCR和Western blot检测人正常支气管上皮细胞系BEAS?2B和3种NSCLC细胞系（H1703、PC9、H1299）中C5a受体（C5aR）的表达;CCK?8和划痕实验检测C5a对PC9细胞增殖和迁移的影响;Western blot检查C5a刺激PC9细胞后蛋白激酶Akt1、细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal?regulated kinase,ERK1/2）和蛋白激酶C?α（protein kinase C?α,PKC?α）表达及磷酸化水平;用Akt1抑制剂Perifosine和ERK1/2抑制剂U0126分别处理PC9细胞后再给予C5a刺激,Western blot检测Akt1和ERK1/2的表达和磷酸化及其上下游调控关系,CCK?8和划痕实验检测Perifosine和U0126对细胞增殖和迁移的影响。结果：PC9细胞C5aR的表达水平显著高于其他细胞;C5a可明显促进PC9细胞的增殖和迁移能力;C5a刺激PC9细胞后,可显著增强Akt1和ERK1/2的磷酸化;Akt1和ERK1/2抑制剂均能明显降低C5a刺激PC9细胞后引起的细胞增殖和迁移,且Akt1抑制剂不仅能减弱Akt1的磷酸化,还能减弱ERK1/2的磷酸化,而ERK1/2抑制剂则仅能阻断其自身的磷酸化。结论：C5a刺激NSCLC细胞后可能通过激活Akt1?ERK1/2通路促进细胞的增殖和迁移。     

MAPK、PI3K途径在蛇毒神经生长因子诱导PC12细胞分化的作用

目的 研究丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt途径在蛇毒神经生长因子(NGF)诱导PC12细胞分化中的作用.方法 应用蛋白免疫印迹法分析p44/p42MAPK和Akt的磷酸化水平,并利用MAPK抑制剂PD98059和PI3K抑制剂LY294002,观察其对NGF诱导的PC12细胞形态学改变的影响.结果 眼镜蛇毒NGF在10ng/mL即可诱导PC12细胞长出突起,100,1000ng/mL作用明显,呈剂量效应关系;NGF能有效刺激p44/p42MAPK、Akt的磷酸化;分别用特异抑制剂PD98059抑制MAPK活性,LY294002抑制PI3K活性后,NGF诱导的细胞分化均受抑制.结论 蛇毒神经生长因子诱导PC12细胞的分化作用与p44/p42MAPK和PI3K/Akt途径相关.     

内质网应激下肝癌细胞Akt和ERK通路间的cross-talk研究

目的 研究内质网应激介导的肝癌细胞PI3K/AKt和MEK/ERK途径间的信号交流。方法 采用PI3K抑制剂LY294002/Akt激活型突变载体myr-Akt和MEK抑制剂U0126分别阻断/激活内质网应激介导的Akt和ERK活化,并利用Western blot分析内质网应激条件下PI3K/Akt和MEK/ERK途径间的信号交流。结果 阻断PI3K/Akt明显促进内质网应激介导的MEK/ERK活化,而过度激活PI3K/Akt则抑制内质网应激介导的MEK/ERK活化。阻断MEK/ERK对内质网应激介导的PI3K/Akt活化无影响。结论 PI3K/Akt和MEK/ERK信号途径问在内质网应激肝癌细胞中存在信号交流。     

PI3K/Akt抑制剂对内质网应激下肝癌细胞MEK/ERK途径的影响

目的:研究内质网应激介导的PI3K/Akt抑制剂对肝癌细胞MEK/ERK途径的影响。方法:采用PI3K抑制剂LY294002/激活型突变载体myr-Akt分别阻断/激活内质网应激介导的Akt和ERK活化,并利用Western blot ting技术分析内质网应激条件下PI3K/Akt和MEK/ERK途径间的关系。结果:阻断PI3K/Akt促进内质网应激介导的MEK/ERK活化,过度激活PI3K/Akt则抑制内质网应激介导的MEK/ERK活化。结论:PI3K/Akt和MEK/ERK信号途径间在内质网应激肝癌细胞中可能存在信号交流。     

醛糖还原酶抑制剂影响PDGF-BB促系膜细胞增殖作用的机制研究

目的探讨醛糖还原酶抑制剂（ARI）影响血小板源性生长因子-BB（PDGF-BB）促体外培养大鼠系膜细胞（MsC）增殖作用的机制。方法用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,对比PDGF-BB刺激MsC生长速度与MAPK3条信号通路（ERK、JNK及p38）抑制剂及PI3K信号通路抑制剂对PDGF促MsC增殖作用的影响。用半定量RT-PCR检测醛糖还原酶抑制剂（ARI）对MsC合成内源性PDGF-B链的影响。蛋白印迹法观察ARI对PDGF引起的信号通路磷酸化的影响。结果（1）ERK抑制剂U0126、JNK抑制剂SP600125及PI3K抑制剂LY294002能明显抑制PDGF对MsC的促增殖作用（P〈0.05）,而p38抑制剂SB203580不能抑制PDGF的促MsC增殖作用;（2）ARI在转录水平对MsC合成内源性PDGF-B链没有明显影响。（3）PDGF刺激MsC后引起ERK、JNK及PI3K/Akt信号通路的磷酸化,而ARI仅能抑制JNK及PI3K/Akt两条信号通路的磷酸化（P〈0.05）,对ERK信号通路的磷酸化没有明显影响。结论ARI部分抑制PDGF促MsC增殖作用可能与其影响JNK和PI3K/Akt信号通路活化有关。     

MAPK途径在大鼠肝干细胞增殖调控中的作用

目的探讨ERK1／2、p38-MAPK、PI3K／AKT等信号途径在HGF介导的肝干细胞增殖信号中的作用及其信号转导途径之间的相互联系和作用机制。方法通过western blotting检测ERK、p38MAPK、Akt信号分子及磷酸化蛋白的表达；通过^3H—TdR掺入DNA的方法来检测细胞的增殖细胞。结果在WB细胞。HGF确实能够激活ERK、p38MAPK、PI3K／AKT途径。ERK途径在HGF刺激5min后发生磷酸化，并且完全磷酸化发生在HGF作用15min。1h后逐渐消失。Akt也在HGF作用5min后发生磷酸化，15min后达到完全磷酸化并且持续至少2h。P38MAPK途径也在5min后开始激活．在30min后逐渐减少，持续大约3h；我们还发现，用MAPK抑制剂U0126，SB23580处理后能够明显减低HGF诱导的增殖效应，但是用Ly294002处理阻断PI3K／AKT途径后则并不影响HGF诱导的增殖效应。表明，ERK1／2、p38MAPK途径的激活参与HGF介导的细胞增殖效应，而PI3K／AKT途径则并不参与HGF介导的细胞增殖调控。结论在WB细胞，HGF能够激活ERK、p38MAPK、PI3K／Akt等信号途径。ERK1／2和p38MAPK途径的激活参与HGF介导的细胞增殖效应，而PI3K／AKT途径则并不参与HGF介导的细胞增殖调控。     

神经生长因子促进骨髓间充质干细胞血管新生能力

目的 探讨神经生长因子(NGF)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)血管新生能力的影响,及其可能的作用机制.方法 24孔板中matrigel铺板后种植MSCs,用不同浓度的NGF(0、25、50、100、200 ng/mL)处理细胞24 h,观察MSCs体外形成管腔样结构的能力,同时用特异性NGF酪氨酸受体(TrkA)阻滞剂K-252a阻断受体.观察K-252a对NGF促MSCs血管新生的抑制作用.应用Western印迹法比较NGF处理组MSCs与对照组MSCs的血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况.结果 不同浓度的NGF均有促血管新生的作用,其中NGF 50 ng/mL促进MSCs血管新生的能力最强,该组MSCs形成的管腔长度为对照组的2.24倍(P=0.01).NGF处理组MSCs的VEGF表达情况与对照组的差异无统计学意义(P>0.05).K-252a阻断TrkA受体后,NGF促进MSCs管腔样结构形成的能力明显减弱.结论 NGF可以促进MSCs在体外matrigel中的血管新生能力,其作用机制可能与激活TrkA受体有关.     

胰岛素对1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导的嗜铬细胞瘤细胞损伤的保护

目的 观察胰岛素处理是否减轻1-甲基4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡,探讨可能的机制.方法 测定不同处理后PC12细胞的存活和细胞凋亡情况,观察胰岛素处理对细胞内信号蛋白激酶B(Akt)、糖元合成酶激酶3β(GSK3β)和微管相关蛋白tau磷酸化的影响.结果 胰岛素处理能保护细胞,增加撤除血清后细胞的活力(P＜0.01);增强PC12细胞对100μmol/L MPP+毒性的耐受(P＜0.05),这一作用可以被Akt抑制剂--LY294002阻断.Hoechest染色和流式细胞检测显示,胰岛素干预减少细胞凋亡.100 nmol/L胰岛素处理细胞,Akt ser-473磷酸化程度升高(P＜0.01);GSK3βser-9磷酸化增强(P＜0.01).胰岛素干预,减少tau pS199过磷酸化,而不改变tan pT231的磷酸化.结论 胰岛素通过其细胞内信号通路,调节Akt/GSK3β的磷酸化,减轻MPP+诱导的PC12细胞凋亡.     

趋化因子受体CCR7介导树突状细胞抗凋亡机制研究

目的研究趋化因子受体CCR7对成熟树突状细胞（DCs）的抗凋亡作用，并对其机制进行探讨。方法体外培养大鼠骨髓来源DCs，脂多糖诱导成熟。加入CCR7配体CCL21进行刺激，以不加CCL21为对照组，流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blot检测磷酸化Akt、Akt蛋白表达，应用Wortmannin抑制PI3K/Akt信号通路进一步观察磷酸化Akt蛋白表达和细胞凋亡的变化。结果在CCL21的作用下，DCs细胞凋亡率明显低于对照组，而磷酸化Akt蛋白表达却明显增高（P〈0.05）。DCs经PI3K抑制剂预处理后，CCR7介导的Akt蛋白磷酸化及抗凋亡作用被阻断。结论在CCL21作用下，CCR7介导了抗凋亡效应，其对DCs的凋亡调控通过PI3K/Akt信号通路发挥作用。     

熊果酸(UA)对大鼠活化型肝星状细胞(HSC)的NADPH氧化酶(NOX)亚基及PI3K/Akt、P38MAPK信号通路活化的影响

 目的  观察熊果酸(ursolic acid,UA)对大鼠活化型肝星状细胞-6 (hepatic stellate cell T6,HSC-T6) NADPH氧化酶(NAPDH oxidase,NOX)亚基及其调控的磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase/Akt,PI3K/Akt)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen activated protein kinase,P38MAPK)信号通路及其对基质金属蛋白酶组织抑制剂-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)、基质金属蛋白酶-1(metal matrix proteinase -1,MMP-1)蛋白表达的影响,并探讨其机制。方法  取对数生长期的HSC-T6细胞,随机分成6组:空白对照组、瘦素组(100 ng/mL)、UA干预组(UA 50 μmol/L+瘦素)、NOX抑制剂DPI干预组(DPI 20 μmol/L+瘦素)、P38MAPK抑制剂SB203580干预组(SB203580 10 μmol/L+瘦素)及PI3K抑制剂LY294002干预组(LY294002 10 μmol/L+瘦素)。采用Western blot法分别检测NOX亚基gp91phox、p22phox、p67phox、Rac1蛋白表达;信号通路PI3K、Akt、P38MAPK的活化及TIMP 1、MMP 1蛋白表达。结果  UA能显著抑制瘦素诱导的gp91phox、 p22phox、p67phox、Rac1蛋白表达(P均<0.01),但UA对gp91phox、p67phox蛋白表达的抑制作用不及DPI和LY294002。UA能抑制瘦素诱导的PI3K蛋白表达及Akt、P38MAPK蛋白磷酸化(P均<0.01),与DPI及LY294002作用的差异无统计学意义。UA能抑制瘦素诱导的TIMP-1蛋白表达,同时促进MMP-1蛋白表达(P均<0.01)。结论  UA能抑制瘦素诱导的大鼠HSC T6细胞NOX亚基gp91phox、p22phox、p67phox、Rac1表达及PI3K/Akt、P38MAPK信号通路的活化;其下调TIMP-1蛋白及上调MMP-1蛋白表达的机制可能与UA抑制NOX调控的PI3K/Akt及P38MAPK信号通路有关。     

CTGF诱导的人胚肺成纤维细胞转分化中PI3K/Akt与p38MAPK磷酸化的关系

目的 探讨结缔组织生长因子(CTGF)诱导的人胚肺成纤维细胞(HFL-I)转分化中磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路的活动状态以及相关性的研究.方法 将体外培养的HFL-I分成4组:(1)CTGF处理组(20 ng/ml);(2) LY294002(10 μmol/L)预处理60min,再行CTGF刺激(20 ng/ml):(3)SB203580 (10 μmol/L)预处理60 min,再行CTGF刺激(20 ng/ml); (4)LY294002(10 μmol/L)和SB203580(10 μmol/L)联合作用60 min,再加入CTGF(20 ng/ml).选取不同时相点,Western blot测定平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、p-Akt和Akt的蛋白表达:RT-PCR检测PI3K和p38MAPKmRNA表达.结果 与对照组相比,CTGF诱导15 min后p-Akt水平升高,30 min时达至顶峰(P＜0.01).CTGF诱导24h后α-SMA表达显著升高(P＜0.01),可被LY294002阻断.LY294002和SB203580单独或联合预处理后,显著抑制CTGF诱导的p-Akt活化(P＜0.01).结论 CTGF诱导的成纤维细胞-肌成纤维细胞转分化中有PI3K/Akt通路的激活,PI3K和p38MAPK均可以调节Akt的活性,其特异性抑制剂均可阻断Akt的磷酸化.     

脂多糖调控PI3K/Akt通路增强中性粒细胞吞噬功能

目的: 探讨脂多糖对中性粒细胞细菌吞噬功能的影响及可能机制。方法: 取健康人静脉血中性粒细胞,重悬分为对照组、脂多糖10 min、20 min、30 min组,按1 ∶50加入大肠埃希菌GFP(25922GFP),孵育30 min,荧光显微镜和流式细胞术检测中性粒细胞的吞噬功能;另取中性粒细胞重悬分为对照组、脂多糖组、LY294002(PI3K抑制剂)组、LY294002+脂多糖组,一部分细胞行丝状肌动蛋白(filamentous actin,F-actin)荧光染料染色,流式细胞术观察与分析细胞中F actin,荧光显微镜观察中性粒细形态;另一部分细胞按1 ∶50加入25922GFP,孵育30 min,荧光显微镜和流式细胞术检测中性粒细胞的吞噬功能。免疫印迹法检测各组细胞蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷脂酰肌醇激酶(PI3K)和磷酸化磷脂酰肌醇激酶(p-PI3K)的表达。结果： 与对照组比较,脂多糖10 min、20 min、30 min组中性粒细胞25922GFP荧光表达逐渐增强,p-PI3K和p-Akt表达逐渐增加;脂多糖组荧光强度和p-PI3K和Akt表达明显高于对照组(P均＜0.05)。与对照组比较,脂多糖组F-actin表达增加,细胞形态改变,LY294002组和LY294002+脂多糖组细胞形态无明显改变,LY294002+脂多糖组F-actin表达明显低于脂多糖组(P＜0.05);对照组、LY294002组和LY294002+脂多糖组p-Akt表达明显低于脂多糖组。结论： 经脂多糖刺激后中性粒细胞吞噬功能增强,其机制可能与脂多糖促进PI3K/Akt通路磷酸化有关。     

塞来昔布通过调节PI3K/Akt通路活化影响人膀胱肿瘤细胞株T24的增殖和凋亡

探讨PI3K/Akt通路在选择性环氧化酶2(Cox-2)抑制剂塞来昔布抗膀胱肿瘤机制中的可能作用。方法常规培养的贴壁生长的T24细胞,加入不同浓度PI3K抑制剂LY294002共培养,MTT法测定其对T24细胞增殖活性的影响;贴壁生长及悬浮培养的T24细胞,分别加入塞来昔布、PGE2、LY294002等共培养,流式细胞仪测定T24细胞凋亡率。Western blot检测塞来昔布及PGE2作用后悬浮生长的T24细胞Akt活化情况。结果塞来昔布对贴壁及悬浮培养的T24细胞均可诱导其凋亡;PGE2及LY294002均对贴壁的T24细胞增殖和凋亡无明显影响,但PGE2对悬浮生长的T24细胞可减少其凋亡,而LY294002可显著增加T24细胞的失巢凋亡率。Western blot结果提示塞来昔布显著降低而PGE2增加Akt的活化。结论塞来昔布对PI3K/Akt信号通路的主要作用是阻遏Akt的磷酸化,通过阻止Akt活化抑制T24细胞增殖并诱导其产生凋亡。更多还原     

抗肿瘤海洋放线菌LYG-1的筛选及分类鉴定

从连云港海域海泥中分离得到一株具有抗肿瘤活性海洋放线菌LYG-1,通过对其形态特征、培养特征、生理生化特性的研究以及16S rRNA基因序列分析,将海洋放线菌LYG-1归属为链霉菌属玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseos-porus)的新的海洋变种。利用MTT法对海洋放线菌LYG-1发酵产物的抗肿瘤活性进行了初步研究,结果表明放线菌LYG-1的发酵原液对HepG2、MCF-7、HCT116以及MDA-MB-231 4种肿瘤细胞具有良好的体外抗肿瘤活性。     

膜雌激素受体介导的NO途径对EPCs增殖和凋亡的影响

 【目的】 观察一氧化氮(NO)信号途径在膜雌激素受体介导的内皮祖细胞(EPCs)增殖和凋亡中的作用&;#65377; 【方法】 在培养的EPCs上,分别使用E2-BSA&;#65380;或加雌激素受体阻断剂ICI 182,780&;#65380;PI3K抑制剂LY294002和NOS抑制剂l-NAME,利用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性(10组,n = 9),利用化学比色法测定NO的含量(6组,n = 6),Hoechst 33258染色观察EPCs凋亡(8组,n = 5)以及免疫印迹法检测EPCs磷酸化eNOS蛋白表达的情况(4组,n = 4)&;#65377;【结果】 与对照组相比,E2-BSA 可以促进EPCs的增殖,ICI 182,780可以抑制其增殖作用,表明膜雌激素受体介导的信号通路参与雌激素对EPCs的增殖作用;NO合成和细胞凋亡结果显示,E2-BSA可以促进一氧化氮的合成和抑制血清撤退诱导的凋亡,PI3K抑制剂LY294002&;#65380;NOS 抑制剂l-NAME以及和ICI 182,780可以抑制上述作用;免疫印迹结果显示,E2-BSA可以促使eNOS的磷酸化,而LY294002可抑制上述作用&;#65377;【结论】 膜雌激素受体可通过PI3K/Akt/eNOS信号途径抑制EPCs的凋亡从而促进其增殖&;#65377;     

Akt通过磷酸化p27诱导胆管癌细胞生长

 目的  探讨Akt和p27蛋白控制胆管癌细胞生长的分子机制。方法  利用突变载体、突变失活载体以及位点突变基因的转染技术,流式细胞仪检测PI3K、转染各类载体对胆管癌细胞周期的影响,免疫印迹、免疫荧光检测PI3K抑制剂、转染各类载体对P27蛋白表达及分布的影响。结果  PI3K抑制剂LY294002引起胆管癌细胞株G1期细胞周期阻滞,并引起p27蛋白入核;Akt能通过诱导p27蛋白出细胞核而解除LY294002的G1期细胞周期阻滞;Akt通过磷酸化野生型p27蛋白第157位苏氨酸逆转细胞周期阻滞。 结论  Akt通过磷酸化p27第157位苏氨酸来诱导p27细胞内重定位于细胞质,促进胆管癌细胞的生长。