胆盐水解酶基因在植物乳杆菌ST-Ⅲ中的表达

胆盐水解酶(Bile salt hydrolase,BSH)是微生物生长、繁殖过程中产生的一种胞内酶,因其与降低血胆固醇、预防心血管疾病有关而受到广泛关注。本研究通过基因工程技术实现了4种胆盐水解酶基因在Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ的过表达,并利用茚三酮显色法测定了表达4种BSHs重组菌的酶活,结果显示表达BSH1重组菌的酶活最高,其次是BSH3和BSH2的重组菌,而以BSH4重组菌酶活最低。本研究结果表明,BSH1可能在L.plantarum ST-Ⅲ水解胆盐方面起着更为重要的作用,其次为BSH3,而BSH2和BSH4在L.plantarum ST-Ⅲ中对牛磺酸结合胆盐的水解能力较弱。     

双歧杆菌胆盐水解酶基因的重组表达、纯化与酶学性质

为了提高胆盐水解酶在大肠杆菌中的表达量,研究重组胆盐水解酶的酶学性质。利用大肠杆菌表达系统,对双歧杆菌来源的胆盐水解酶进行了表达。将PCR获得的胆盐水解酶基因克隆至表达载体p ET-22b(+),得到重组质粒p ET-22b(+)-bsh,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。经发酵优化,重组菌在20℃、IPTG 1 mmol/L条件下诱导32 h可达最高酶活,对甘氨脱氧胆酸钠和牛磺酸脱氧胆酸钠的酶活分别为135.2 U/m L和121.3 U/m L。采用镍亲和层析柱对重组胆盐水解酶进行纯化,经SDS-PAGE分析,胆盐水解酶相对分子质量(Mr)为35.0×103。酶学性质研究表明,重组胆盐水解酶偏好水解甘氨结合胆盐,对甘氨胆酸钠的催化活性最高,达到220.1 U/mg。酶催化反应的动力学参数经Hill方程拟合,希尔系数大于1,表明底物与酶之间存在协同作用,且不同底物与重组胆盐水解酶之间存在不同的协同作用,表明重组胆盐水解酶属于变构酶。研究结果为其他来源胆盐水解酶在基因工程菌中的表达,和进一步研究胆盐水解酶的结构和催化反应机理提供了参考。     

胆盐水解酶的研究现状

阐述了胆盐水解酶(BSH)的功能、特性以及对宿主微生物产生的影响;介绍了胆盐水解酶基因、基因调节及同系物;讨论了胆盐水解酶未来研究方向和应用的前景。     

4种胆盐水解酶在发酵乳杆菌AR497中的异源表达

为提高发酵乳杆菌耐胆盐能力,将植物乳杆菌AR113来源的4种BSH基因(BSH1、BSH2、BSH3和BSH4)转化至发酵乳杆菌AR497中进行表达。结果表明,植物乳杆菌来源的4种BSH同功酶异源表达可提高发酵乳杆菌的耐胆盐能力。在2.0mg/mL甘氨脱氧胆酸钠浓度下,表达BSH2的工程菌致死率最低,其他菌株生长被完全抑制;BSH酶活测定表明,BSH2表达菌株酶活最高,达57.74U/mL,比对照空质粒菌株提高了2.88倍。     

植物乳杆菌中胆盐水解酶的研究现状及展望

益生菌的降胆固醇作用与它们所产的胆盐水解酶(bile salt hydrolase,BSH)有关,这使得胆盐水解酶成为近年来研究的热点之一。文中主要对植物乳杆菌中胆盐水解酶的克隆表达、生化特性以及降胆固醇作用等方面的研究现状进行了综述,并展望了它未来的发展方向。以期对植物乳杆菌胆盐水解酶的研究及其相关制品的开发利用提供一定的指导意义。     

产胆酸盐水解酶乳酸菌的鉴定及其生物信息分析

对初步筛选得到的胆酸盐水解酶活性高的2株乳杆菌进行了16SrDNA鉴定,结果表明,KLDS 1.0317和KLDS 1.0386均为植物乳杆菌。以牛磺脱氧胆酸盐和甘氨脱氧胆酸盐为底物,对两株植物乳杆菌所产BSH的比酶活进行了测定,试验证明了BSH具有底物特异性,且两株菌降解甘氨结合胆盐的能力强于牛磺结合胆盐;利用PCR技术克隆出胆酸盐水解酶基因,翻译成相应的氨基酸,并利用生物分析手段对bsh 1基因以及其预测氨基酸序列进行了对比分析,结果表明,两株植物乳杆菌的bsh 1基因非常保守,且预测的氨基酸序列的相似性非常高,不低于98%。     

植物乳杆菌ST-Ⅲ胆盐水解酶的表达及其酶活力分析

以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ST-Ⅲ4种胆盐水解酶(BSHs)的编码序列(bsh 1～4),将其克隆至表达载体pET-28b(+)上,在原核系统进行表达,并对其酶活力进行测定,结果发现4种BSHs的酶活力分别为29.00、20.49、24.90、21.13U/mL。同时BSH1比其他3种BSHs表现出更高的水解能力。     

胆盐水解酶酶学性质与基因结构研究进展

胆盐水解酶（Bile salt hydrolase, BSH）广泛存在于哺乳动物胃肠道中,是肠道菌群在生长、繁殖过程中产生的一种胞内酶,可以调节宿主的胆汁酸平衡,影响脂质代谢,有控制胆固醇、调节肠道疾病的作用,并且BSH这种调控作用可以实现益生菌部分益生功能,因此BSH一直是研究热点。BSH结构和底物特异性的详细知识是开发BSH相关产品的坚实基础。本文介绍了BSH的来源及活性检测方法,BSH基因结构、酶学性质及底物识别机制,最后讨论了BSH在畜禽业食品工业及医药等方面的应用,期望为胆盐水解酶的深入研究及其在食品、保健品及医药方面的开发利用提供参考。     

胆盐水解酶基因在植物乳杆菌KLDS1.0386中的表达研究

本文从转录水平上研究了四种胆盐水解酶基因在植物乳杆菌KLDS1.0386中不同生长阶段的表达情况,并且分别以不同浓度的牛磺脱氧胆酸盐和甘氨脱氧胆酸盐为底物,以16s r RNA作为内参基因,利用实时荧光定量PCR技术研究不同浓度底物下的胆盐水解酶基因(bsh1、bsh2、bsh3、bsh4)表达的变化规律。结果显示,内参基因和目的基因的扩增效率均在90%~105%之间,说明目的基因的表达量可以被很好的反应出来。通过实时荧光定量PCR结果分析可知,植物乳杆菌KLDS1.0386中的4种胆盐水解酶基因随着生长时间的延长,表达量显著增加,而且在两种胆盐中都表达,基因表达量都被不同剂量(1%、2%、3%)的胆盐上调,上升幅度随着胆盐浓度的增加表现出极显著的增加趋势,而且胆盐不同,同浓度时每个基因的表达量也各不相同,在甘氨脱氧胆盐中的表达量普遍高于牛磺脱氧胆盐。     

胆盐水解酶降胆固醇的研究进展

体内胆固醇水平失衡会引起多种疾病,威胁人体健康。因此,控制体内胆固醇水平是目前普遍关注的问题。除常见的他汀和依齐麦布药物外,植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌等乳酸菌也已被证实可有效降低体内的胆固醇水平。大量研究发现,促使乳酸菌起到降胆固醇作用的主要物质与其在生长过程中产生的一类代谢产物胆盐水解酶（Bile salt hydrolase,BSH）相关。该研究通过对胆盐水解酶特性、功能介绍,总结分析了胆盐水解酶降胆固醇机制,以期为降胆固醇的深入研究提供理论基础,并为益生菌开发应用提供理论依据与指导。     

Short communication: Improving the activity of bile salt hydrolases in Lactobacillus casei based on in silico molecular docking and heterologous expression

Bile salt hydrolase (BSH) plays an essential role in the cholesterol-removing effect of lactic acid bacteria, which hydrolyze conjugated bile salts to amino acid and deconjugated bile salts. However, Lactobacillus casei lacks the bsh gene, which may make it highly sensitive to bile salt stress. We wanted to improve the BSH activity of L. casei for various food-industry applications (e.g., milk fermentation). Plate assay testing indicated that Lactobacillus plantarum AR113 has the highest BSH activity. We cloned and sequenced 4 bsh genes from the genome of L. plantarum AR113. Structure modeling and molecular docking of BSH indicated that BSH1 and BSH3 could react efficiently with bile salts, so we selected BSH1 and BSH3 for heterologous expression in L. casei. Compared with single expression of BSH1 or BSH3, co-expression of both protein sequences showed the highest hydrolysis activity by HPLC analysis. Our results suggested that heterologous expression of BSH in L. casei can significantly improve host activity against bile salts, and in silico molecular docking could be an efficient method of rapid screening for BSH with high activity.     

Construction of R16F and D19L mutations in the loop I of bile salt hydrolase (BSH) enzyme from Lactobacillus plantarum B14 and structural and functional analysis of the mutant BSHs

Bile salt hydrolase (BSH), found commonly in intestinal species of Lactobacillus and Bifidobacterium, catalyzes the hydrolysis of glycine or taurine-conjugated bile acids into the amino acids and free bile acids. Deconjugated bile acids potentially play an important role in the reduction of blood cholesterol level and formation of some gastrointestinal diseases such as cholestasis, gallstone formation, and colon cancer. Although the crystal and three-dimensional structures of BSH enzyme are known, the working mechanism of catalytic activity of such an important BSH enzyme is not known very well. Previous in silico analysis of multiple BSH has identified that Arginine-16 (R16) and Aspartate-19 (D19) were catalytically important residues in the active site of BSH. To confirm the function of these amino acids, in this study, BSH enzyme from Lactobacillus plantarum B14 strain was cloned into Escherichia coli and strictly conserved polar R16 and D19 amino acids of BSH enzyme were substituted for hydrophobic Phenylalanine-16 (F16) and Leucine-19 (L19) amino acids, respectively, by polymerase chain reaction (PCR)-based site-directed mutagenesis. The effects of the mutations on catalytic activity and structure of the BSH enzymes were detected by ninhidrin assay and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis, respectively. Research results showed that although F16 mutation led to loss of enzyme activity completely, L19 mutation led to abolishment of the synthesis of BSH enzyme. These results indicated that R16 and D19 amino acids located in loop I of the BSH enzyme might be critical for catalytic activity and assembly of the BSH enzyme respectively.     

大豆球蛋白A1a酸性多肽的原核表达及纯化

为建立大豆球蛋白免疫检测方法及致敏机理的深入研究提供基础材料,人工合成了大豆球蛋白A1a酸性多肽基因的cDNA序列,通过聚合酶链式反应(PCR)和Bam HI、Kpn I双酶切构建了原核表达载体pET30a-A1a,将重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21后用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。SDS-PAGE分析表明,A1a酸性多肽融合蛋白能以可溶蛋白形式进行分泌表达,并且诱导5h后,A1a酸性多肽融合蛋白表达量达到最高。经His亲和层析纯化,获得纯度达90%的融合A1a蛋白,分子质量大小约为38kD。Western blotting显示,所获得的A1a融合蛋白能与对豆粕过敏的仔猪血清发生免疫反应,表明所获得融合蛋白具有免疫活性。     

深海古菌Thermococcus siculi HJ21高温普鲁兰酶基因的克隆及表达

根据NCBI 上公布的普鲁兰酶基因的保守序列设计简并引物,以Thermococcus siculi HJ21 基因组DNA 为模板进行PCR,得到T. siculi HJ21 普鲁兰酶的基因,测序后通过Blast(NCBI)数据库比对和分析表明扩增基因有一个4056bp、编码1351 个氨基酸的开放阅读框,为一新的普鲁兰酶基因。将该基因插入表达载体pET28a,并转化Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG 诱导,测定普鲁兰酶比活力。重组转化子的细胞破碎液有高温普鲁兰酶活性,SDS-PAGE 电泳结果显示出分子质量约为150kD 的特异性条带。     

增强型绿色荧光蛋白在DH5α大肠杆菌中的表达

采用PCR 技术从pEGFPpA-CAN 克隆载体中扩增出增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP),插入到pGEM-T easy载体中,构建pGT-EGFP 重组质粒,其中的SP6 启动子可用来表达EGFP 蛋白。携带pGT-EGFP 重组载体的DH5α大肠杆菌较普通DH5α大肠杆菌菌液略带淡绿色,在荧光显微镜下能够清晰观察该大肠杆菌的形态,带有绿色荧光。同时超声裂解携带pGT-EGFP 重组载体的DH5α大肠杆菌,提取菌体总蛋白,SDS-PAGE 显示EGFP 蛋白是以可溶性蛋白形式存在的,分子质量大约为30kD,与其理论值大小一致。     

牛链球菌L-(+)-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

利用PCR方法从牛链球菌(Streptococcus bovis)基因组DNA中扩增出了L(+)乳酸脱氢酶基因(ldh),并将其连接到表达载体pSE380上,得到重组质粒pSEldh,将重组质粒转化到大肠杆菌菌株JM109。利用SDS-PAGE分析ldh表达产物的分子量为36KD,重组菌株的乳酸脱氢酶酶活力为168.2U/mL,最适反应温度25℃,最适作用pH为5.0,重组质粒的稳定性达99.9%。     

花生过敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表达

本实验首先从花生中提取总RNA,利用反转录聚合酶链式反应技术克隆了花生过敏原蛋白Ara h 6全cDNA,并以此为模板扩增出Ara h 6目的基因。将目的基因与pMD19-T Simple质粒进行重组后转入BL21（DE3）宿主表达菌中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导产物表达,并利用镍离子亲和层析纯化表达产物。DNA测序结果显示Ara h 6基因片段全长为438 bp,编码145 个氨基酸,与已知该蛋白DNA序列97%相同;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示表达产物分子质量为24 kD,与融合组氨酸标签的重组Ara h 6蛋白理论分子质量相符;质谱鉴定结果表明重组蛋白的一级结构与天然Ara h 6匹配度为100%;Western blotting结果显示融合蛋白能够为抗Ara h 6多克隆抗体所识别,具有免疫原性。     

麻疹病毒N蛋白原核表达纯化条件的优化

通过构建重组表达质粒,诱导表达纯化麻疹病毒N蛋白．将麻疹病毒N蛋白基因片段与载体pET-32a（＋）相连接,通过PCR方法扩增获得重组质粒pET-32a（＋）／N,然后将重组质粒转入大肠杆菌E．coliBL21（DE3）内,并优化诱导表达时间、温度、诱导剂浓度等条件．SDS—PAGE和Western blot蛋白印迹检测表明,麻疹病毒N蛋白分子质量约为60kD,表达产物用Ni—NTA亲和层析和DEAE纯化后,纯度达90％．     

绿色木霉葡聚糖内切酶(EGⅠ)基因克隆及在酿酒酵母中的表达

以纤维素酶工业生产菌株绿色木霉Sn-9106的总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得大小为1 400 bp的cDNA片段,该序列与GenBank中的E00390葡聚糖内切酶序列相比,氨基酸序列同源性达91%。将EGⅠ基因构建入表达载体pESC中,在GAL10启动子控制下,目的基因在酿酒酵母Fm135a中成功表达,所得葡聚糖内切酶经初步纯化后,SDS-PAGE检测为49 kD,比活力为2.45 U/mg。