MALDI-TOF-MS对原料乳中产β-内酰胺酶菌株的鉴定

为研究原料乳中产β-内酰胺酶细菌的来源,通过杯碟法检测原料乳中的β-内酰胺酶,并鉴定出原料乳中有金黄色酿脓葡萄球菌;随后,通过对原料乳产地的空气、牛体臀部、牛体腹部、牛体乳房、榨乳罩杯、输乳管路外侧、盛装原料奶的空贮罐等进行了大量细菌采集和分离,并采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technology,MALDI-TOF-MS)技术对分离出的菌株进行鉴定。结果表明,牛体乳房5号菌与原料乳中检测出的产β-内酰胺酶的菌株相似,均为金黄色酿脓葡萄球菌,由此推断原料乳中的金黄色酿脓葡萄球菌可能来源于牛体乳房。     

副溶血弧菌耐药谱及其对头孢类药物抗性分析

为了分析不同来源的副溶血孤菌病人分离株间以及病人与食品分离株间的耐药谱差异,检测其产β-内酰胺酶的情况,确定该酶与菌株头孢类抗生素抗性之间的关系,本文采用纸片扩散法调查177株副溶血弧菌分离株(127株病人分离株和50株食品分离株)对18种常见抗生素的耐药状况,从中筛选具有3代头孢类抗生素抗性的菌株,并检测它们产超广谱β-内酰胺酶和AmpC β-内酰胺酶的情况.研究发现,177株副溶血弧菌耐药谱涉及12种抗生素,尤其对阿莫西林/克拉维酸、头孢噻吩、氨苄西林3种抗生素的平均耐药率高于50％.病人分离株比食品分离株抗性菌株数量多且抗性谱宽.另外,产超广谱β-内酰胺酶和AmpC β-内酰胺酶的病人分离株分别占病人分离株总数的9.4％和4.7％.这些数据可为副溶血弧菌感染病人的临床治疗提供参考依据.本试验中未发现能产这两种酶的食品分离株.     

乳制品中残留产β-内酰胺酶菌株特性的研究

以乳制品中产β-内酰胺酶微生物为研究对象,采用杯碟法和平板分离鉴定分析了产β-内酰胺酶微生物组成、菌株产酶特性及菌株对青霉素的耐药性。结果表明,从乳制品分离的产β-内酰胺酶菌株主要为芽孢杆菌和链球菌。这些菌株在生长过程中分泌β-内酰胺酶,当菌株数量达到105CFU/m L,可导致乳制品β-内酰胺酶检测结果呈假阳性现象。     

产纤维素酶细菌菌株的分离鉴定及产酶条件优化

该实验分离鉴定了高产纤维素酶细菌菌株并探究其产酶条件。 采用3种培养基进行分离筛选。 经菌落形态观察、16S rRNA基 因序列分析菌株在系统分类地位。通过单因素试验确定最适产酶条件。结果表明,从西岭山原始森林保护区土壤中筛选到1株高产纤 维素酶细菌菌株,鉴定为伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia）。 其最适产酶条件：碳源为麦麸,最佳氮源为酵母粉,接种量为2% （V/V）,初始pH值为7,产酶时间为48 h。在此条件下,酶活最高可达2.76 U/mL。酶学特性研究显示,在pH5.0、温度60 ℃条件下CMCase 酶活力最高。     

乳及乳制品中β-内酰胺酶检测方法的研究

基于酶活测定及青霉素分解实验,研究了市售的生鲜牛乳抗生素分解剂中所含β-内酰胺酶活力、其在乳制品中最低检出限及其在液态乳制品中活力残留,结果表明,市售的四种生鲜牛乳抗生素分解剂(A、C、D及E)主要成分为β-内酰胺酶,其酶活力分别为5672590、1174215、1008126、1414437U/mL;经十万倍稀释后,可检出它们在乳中残留的酶活;经百万倍稀释后,只能检出A在乳中残留的酶活。巴氏杀菌和UHT可导致乳中残留的β-内酰胺酶活力损失近50%。73份牛奶样品中,原料乳中β-内酰胺酶检出率较高,占所检样品总数的12·33%;而巴氏杀菌乳和UHT乳样品β-内酰胺酶检出率较低,仅分别占所检样品的2·74%和1·36%。     

产褐藻胶裂解酶菌株筛选与高产酶菌株的ARTP诱变选育

该研究采用平板酶解圈法从南海海域海藻、动物及沉积物样品中筛选产褐藻胶裂解酶细菌,对筛选菌株进行分子生物学鉴定,并利用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术选育高产褐藻胶裂解酶菌株。结果表明,共分离筛选得到酶活较高的细菌14株,16S rDNA比对分析结果表明,它们隶属于3个门、5个纲、7个目、8个科、9个属,其中有5株菌（占35.7%）可能代表着新的分类单元。以高产褐藻胶裂解酶海藻类芽孢杆菌（Paenibacillus algicola）HB172198T作为原始菌株,利用ARTP诱变技术选育获得2株褐藻胶裂解酶活力明显提高的突变株（编号分别为30-19、80-6）,其酶活力分别比原始菌株提高了32.6%和21.6%,且连续6次传代培养诱变菌株的产酶遗传性状稳定。     

具有转糖苷活性β-半乳糖苷酶菌株的筛选鉴定

为了获得具有较高酶活力的β-半乳糖苷酶,以乳糖为诱导剂,采用涂有x-gal的鉴别平板分离初筛得到28株生长较好的产β-半乳糖苷酶的菌株。通过摇瓶复筛测定其水解酶活,从中筛选出4株酶活力较高的菌株,并利用高效液相检测菌株的转糖基活性,确定了一株具有转糖苷活性菌株B5582Y,其初始水解酶活可达12 U/m L。根据细胞形态、生理生化数据、16S r DNA序列和rpo B功能基因序列数据多项鉴定分析,最终确定该菌B5582Y为克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)。     

产环糊精葡萄糖基转移酶苦橙内生细菌的分离鉴定

为寻找产环糊精葡萄糖基转移酶（cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase）的微生物新菌株,采用酚酞-甲基橙筛选平板、淀粉-碘筛选平板从苦橙内生细菌中分离获得一株可产环糊精葡萄糖基转移酶的新菌株,命名为KCEB04。形态学特征、生理生化反应、16S rDNA 序列同源性分析结果表明,菌株KCEB04 归属于产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）。酶活测定结果表明,该菌株所产淀粉水解酶酶活为5 884.35 U/mL、α-CGTase 酶活为1.65 U/mL、β-CGTase 酶活为0.44 U/mL、γ-CGTase 酶活为1.05 U/mL。     

驼乳中产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选鉴定及其酶学特性分析

分离筛选高产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳源微生物,为高效合成低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides,GOS）提供新酶源。以添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的乳糖为碳源的乳酸细菌培养基（MRS）进行初级分离筛选,以产酶菌株粗酶液催化乳糖转糖基反应产物的薄层层析进行复筛,单因素优化最佳产酶条件和转糖基反应条件,硫酸铵分级沉淀纯化β-半乳糖苷酶并对其酶学特性进行初步分析。筛选获得产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌20?株,选择产酶水平较高、转糖基活性最强的产β-半乳糖苷酶菌株L6进行进一步研究。生理生化和分子生物学鉴定确定L6菌株为Lactobacillus kefiri。该菌株在2?g/100?mL乳糖、1?g/100?mL氮源（蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉）及初始pH?5.5的条件下,37?℃培养20?h,产酶水平最高可达（3.81±0.02）U/mL。L6菌株所产β-半乳糖苷酶催化反应的温度范围较宽,45～70?℃均能保持50%以上相对酶活力。以45?g/100?mL乳糖为底物,该酶在65?℃、pH?7.0条件下,反应4?h生成转移二糖的得率为13.51%（m/m,下同）,转移三糖为13.85%,转移三糖以上的GOS为4.15%。     

产人参皂苷转化β-葡萄糖苷酶乳酸菌菌株的筛选

为筛选出具有人参皂苷生物转化作用的乳酸菌菌株,以七叶苷-MRS琼脂为底物从发酵食品中分离出产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌,从中选择酶活性较高的菌株,进一步研究其产酶的特点及性质。结果表明,分离的27株乳酸菌中有3株具有β-葡萄糖苷酶活性,对其鉴定结果均为植物乳杆菌。比较粗酶液活性,筛选出酶活性最高的植物乳杆菌菌株E59,该菌株在培养时间为12h时β-葡萄糖苷酶产酶活性达到最高,粗酶液的最适pH为5.5,最适温度为37℃。实验确定该菌株能将人参皂苷Rb1转化成稀有皂苷Rg3。随着人参被批准为新资源食品,此菌株产β-葡萄糖苷酶将应用于人参皂苷Rb1的生物转化,为人参食品的开发和利用,扩大人参的消费市场具有较高的应用前景。     

我国部分地区市售巴氏杀菌乳中β-内酰胺酶含量调查

采用酶热生物传感器法对我国部分地区巴氏杀菌乳样品中β-内酰胺酶进行快速检测及本底含量调查。方法 在巴氏杀菌乳样品中预先加入一定量青霉素G,室温震荡反应3 h,使样品中的β-内酰胺酶充分酶解青霉素G底物,直接通过酶热生物传感器测定青霉素G含量。根据反应前后样品中青霉素G含量的变化,间接计算巴氏杀菌乳样品中β-内酰胺酶的活性。2013年6～8月在13个省市采集巴氏杀菌乳样品106份,对其β-内酰胺酶含量进行本底调查。结果 该方法线性范围为4～20 U/ml,检出限和定量限分别为2和4 U/ml。全国106份样品的总检出率为3.8%,其中北京市的47份样品中β-内酰胺酶活性均﹤2 U/ml;其他12个省市的59份样品中β-内酰胺酶活性均﹤4 U/ml,其中4个样品在2～4 U/ml之间。结论 我国13个省市106份巴氏杀菌乳样品的测定结果表明样品中β-内酰胺酶含量普遍较低,一定程度上表明我国巴氏杀菌乳中违法添加β-内酰胺酶的问题已得到较大改善。     

产超广谱β-内酰胺酶沙门氏菌的分布与基因型研究

目的 了解不同来源的产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamase,ESBLs)沙门氏菌的分布特征以及耐药特点.方法 分离来自食品与食物中毒患者体内的沙门氏菌,用双纸片法筛选产ESBLs沙门氏菌;采用最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)...     

产β-半乳糖苷酶的节杆菌诱变选育及培养基优化

酶法合成乳果糖需要使用同时具备水解和转苷活力的β-半乳糖苷酶为催化剂。采用物理诱变,培养基优化手段,以提高细菌产该类β-半乳糖苷酶的能力为目的,自然筛选获得的具有转苷能力的节杆菌Arthrobacter sp.,经紫外线照射处理,采用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)为平板筛选显色剂,加之摇瓶发酵筛选,得到8株产酶水平明显提高的诱变株,其中Arthrobacter sp.M2酶活力较野生株提高了89%,传代5次酶活基本稳定。采用正交实验优化产酶培养基,结果表明:在乳糖浓度为10g/L,玉米浆浓度为22g/L,Fe3+浓度为1.5mmol/L时效果最佳,酶活水平进一步提高了113%。紫外诱变和培养基优化有效地提高了节杆菌产β-半乳糖苷酶的水平。     

一株产广谱细菌素乳酸菌菌株的分离鉴定及其细菌素特性研究

目的:从母乳婴儿粪便筛选获得产广谱细菌素的乳酸菌菌株,并对其所产细菌素的理化及生物学特性进行研究分析,预测其在食品工业中的应用前景。方法:以课题组从母乳婴儿粪便分离得到的23株乳酸菌为试材,采用牛津杯琼脂扩散法,选取单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)和大肠杆菌(Escherichia coli)为指示菌筛选产广谱细菌素的优良菌株。通过菌体形态观察、生理生化特征及16S r DNA序列分析对菌株进行分类学鉴定,并从耐酸、耐热、蛋白酶敏感性、抑菌谱等角度分析菌株所产细菌素生物学特性。结果:分离得到1株产广谱细菌素菌株BL-1,发现该菌株所产细菌素具有较好的热稳定性和酸耐受性,在pH为2、121℃条件下细菌素活性仍然保持稳定,酶敏感性强,胃蛋白酶可将其完全分解,使用安全性较高,且抑菌谱较广,对受试的李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aereu)等革兰氏阳性菌和大肠杆菌阴性菌均表现出较强抑菌活性。最后该菌株经分类学鉴定为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。结论:从母乳婴儿粪便中分离出一株产广谱细菌素鼠李糖乳杆菌BL-1,该菌所产细菌素具有优良的食品加工特性,有作为天然食品防腐剂的巨大应用前景。     

浓香型大曲中产β-葡萄糖苷酶微生物的筛选鉴定及其产酶条件优化

β-葡萄糖苷酶是纤维素分解酶系中的重要组成部分,具有广泛的应用前景。浓香型大曲因其独特的制作工艺,其微生物含量非常丰富。以浓香型大曲为菌源,分离纯化出一株高产β-葡萄糖苷酶的菌株,经鉴定该菌株属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。单因素实验结果表明在含1%水杨苷发酵液体培养基中,最佳产酶培养时间72 h、生长温度40℃、生长初始p H为5.5。为了提高产酶能力,采用正交实验对产酶条件进行了优化,获得最佳产酶条件。在此条件下,该菌株发酵液β-葡萄糖苷酶活力可达到55.7 U/m L。研究通过对大曲中产β-葡萄糖苷酶微生物的筛选,获得一株高产菌株,为从大曲中分离产β-葡萄糖苷酶微生物提供了方法,拓展了产纤维素酶微生物的菌种资源;通过对高产菌株最适产酶条件和产酶能力的研究,为进一步开发该菌株奠定了一定的基础。     

传统奶酪中产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选鉴定及其合成低聚半乳糖条件

分离筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌新菌株,为酶法高效合成低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides,GOS）提供新的酶源。以乳糖为唯一碳源,碳酸钙溶钙圈和添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的MRS培养基筛选平板进行初筛,以产酶菌株粗酶液催化乳糖反应产物的薄层色谱（thin layer chromatography,TLC）分析复筛,从新疆伊犁地区牧民手工制作的奶酪样品中筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌。结合其形态学、生理生化特征及16S rRNA序列同源性分析对产转糖基活性β-半乳糖苷酶菌株进行鉴定。单因素试验确定产酶条件和转糖基反应条件,TLC结合高效液相色谱分析转糖基反应产物各组分含量。筛选获得产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株6 株,其中Lactobacillus plantarum YLBGNL-S7所产β-半乳糖苷酶的转糖基活性最强。单因素试验结果表明,在温度50 ℃、pH 6.0、乳糖质量浓度300 mg/mL的条件下反应4 h,GOS得率可达质量分数43.40%,其中转移二糖和转移三糖质量分数分别为18.29%和12.95%。以上结果表明,L. plantarum YLBGNL-S7是一株产转糖基活性β-半乳糖苷酶的新菌株,在益生性GOS的合成领域具有应用前景。     

奶酪中高产β-半乳糖苷酶菌株的筛选及发酵条件的优化

以新疆哈萨克族奶酪样品为原料,通过蓝白斑筛选找到9株产β-半乳糖苷酶的菌株。经过摇瓶发酵测定β-半乳糖苷酶的水解活性,筛选出一株酶活力较高的菌株y-2,经鉴定为马克斯克鲁维酵母。通过研究温度、pH、破壁时间、乳糖浓度、金属离子和接种量6个参数对这株菌酶活的影响,以优化合成培养基中β-半乳糖苷酶的产生。通过单因素试验进行响应面法回归统计分析,结果表明,在温度为37℃,pH为7,破壁时间为5min,K+是促生长因子且浓度为0.001g/L,乳糖浓度为10%,接种量为4%时马克斯克鲁维酵母产生的β-半乳糖苷酶活性最高。     

乳酸菌31-1菌株产细菌素的初步研究

从发酵肉制品宣威火腿中分离筛选出一株产细菌素的乳酸茵31-1,对多株植物乳杆菌具有抑菌作用.经排除有机酸等干扰因素,进行初步蛋白质分离提纯后,抑茵活性增强,因此确定该菌株为细菌素产生菌.进而研究了31-1生长过程中细菌素产生的变化情况,结果发现细菌素在对数末期(8h)开始产生,且在稳定期中期(33h)有最大产量,最终31-1产细菌素的效价达到320AU/mL.     

具有β-半乳糖苷酶转苷能力的菌株筛选及鉴定

以乳糖为惟一碳源,5-溴-4-氯-3-吲哚- β -D-半乳糖苷(X-gal)为显色剂,从土壤中筛选出10株产β- 半乳糖苷酶较高、生长较好的菌株.在30 ℃下发酵产酶,测定邻硝基苯- β- D-半乳糖苷(ONPG)水解能力.在50 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中,加入400 g/L乳糖和200 g/L果糖,并分别添加10株菌所产β- 半乳糖苷酶, 至酶活为400 U/L,37 ℃下反应8 h,经高效液相色谱分析,编号为2-1样品中含有乳果糖.通过形态特征和16S rDNA 序列分析,鉴定菌株2-1为节杆菌属.     

不同处理方式对乳中β-内酰胺酶稳定性的影响

利用青霉素酶活性检测试剂盒对乳中β-内酰胺酶的稳定性进行检测,分别对乳中β-内酰胺酶的保存时间、灭菌方法和酸碱处理对其稳定性影响进行了研究,从而对乳中β-内酰胺酶的稳定性进行全面的评估。结果表明,青霉素酶活性检测试剂盒检测乳中的β-内酰胺酶的最低检测限为2 U/m L。样品储存时间越长β-内酰胺酶的活性越小,并且减小程度与温度正相关。常规灭菌方法均不能使β-内酰胺酶彻底失活,酸碱处理对β-内酰胺酶有不同程度的抑制,其中碱性条件下比酸性条件下抑制作用强。