棉铃虫Bt毒素受体蛋白—氨肽酶N与抗性的关系

随着我国转基因棉花种植面积的日益增加,主要目标害虫—棉铃虫的抗性问题越来越被大家所关注。氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)是一类昆虫中肠内Bt毒素的受体蛋白,其结构、结合位点的改变或基因突变可能是昆虫对Bt毒素产生抗性的重要原因。本文通过分析Bt毒素的作用方式,从生化、生理、分子生物学等方面探讨了棉铃虫Bt毒素受体蛋白APN与抗性的关系。     

昆虫氨肽酶N的研究进展

氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)是一种偏好水解蛋白或寡肽N端中性氨基酸的酶,广泛分布于动植物中。在昆虫中,APN主要分布于中肠刷状缘膜上,涉及食物蛋白的消化以及Bt毒素对靶标害虫的作用。从APN的结构特征和分类地位、APN的分离纯化及其酶活性位点与结合位点的相关性、APN同工酶的区分特征及系统发育关系、APN同工酶的基因功能、不同APN同工酶在昆虫体内的分布及表达量、APN基因功能最新研究方法和结果以及APN与昆虫抗药性的关系等方面概述了昆虫APN的最新研究进展。鉴于昆虫体内受体的多样性、复杂性及当前研究手段的局限性,对APN功能的全面了解还有赖于研究方法的改进和提高而逐步深入。     

Bt抗性和敏感棉铃虫钙黏蛋白及氨肽酶N1表达量的比较

棉铃虫体内的钙黏蛋白（CAD）和氨肽酶N1（APN1）是Bt的主要作用靶标,两种受体蛋白的变化也是棉铃虫对Bt产生抗性的主要原因。本文利用实时荧光定量PCR技术比较了Bt抗性和敏感棉铃虫CAD和APN1的表达量变化,分析受体蛋白表达量变化与抗性的关系。结果表明,与敏感品系相比,抗性品系棉铃虫CAD和APN1的表达量明显降低,1、2龄幼虫的差异达到极显著。在敏感品系中,CAD和APN1的表达量随龄期的增加呈现“V”字形变化,1、2龄幼虫的表达量最高,3、4龄时显著降低,到5龄时表达量又有所增加。抗性品系中CAD和APN1的表达量提前降低,与表达量最高的1龄幼虫相比,2、3龄时表达量显著降低,到4、5龄时又略有回升。说明棉铃虫中肠钙黏蛋白、APN1表达量的下降与抗性相关,且不同龄期棉铃虫幼虫表达量不同。     

粉纹夜蛾离体细胞对Bt Cry1Ac毒素的抗性发展及其交互抗性

以CrylAc活性毒素逐代筛选抗性粉纹夜蛾离体细胞BTI-TN-5B1抗性发展速度呈S形曲线，经56代选择后，抗性比上升至1280倍。在去除选择压力后，抗性比逐渐下降。低水平抗性细胞抗性衰退较快，而高水平抗性细胞抗性衰退较缓慢。抗性比衰退至1．5倍的细胞在复筛后抗性比恢复较快。抗性细胞对苏云金杆菌工程菌GC-91(BtGC-91)、苏云金杆菌鲇泽亚种(B.t.atoazai)和苏云金杆菌库斯塔克亚种(B．t．kurstaki)的复合毒素晶体的活性毒素都具有较高的交互抗性，但对农药无交互抗性，对杆状病毒的敏感性也没发生变化。     

Bt毒素相关受体的研究进展

最近,苏云金芽孢杆菌毒素相关受体的研究取得了一些突破,提出了Bt毒素新的作用模型,并发现了Bt毒素一类新的受体。本文综述了相关研究的最新进展。     

小菜蛾中肠氨肽酶N2在昆虫细胞中的表达

利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac baculovirus expression system)表达获得小菜蛾 Plutella xylostella(L.)中肠氨肽酶N2(aminopeptidase N,APN2)蛋白,成功建立了该蛋白在昆虫细胞中的表达体系。将对Cry1Ac毒素敏感和已产生抗性的小菜蛾中肠APN2基因插入表达载体pFAST Bac HTB中,并在草地夜蛾 Spodoptera frugiperda 细胞系(Sf9)中进行了重组表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白免疫印迹技术(Western-blotting)结果显示,在107 kDa处有1条特异性蛋白条带。研究表明,小菜蛾中肠APN2基因可在Sf9细胞中成功表达,这为继续研究其功能及抗性的关系奠定了基础。     

粉纹夜蛾离体细胞对Bt Cry1Ac毒素的抗性发展及其交互抗性

以Cry1Ac活性毒素逐代筛选抗性粉纹夜蛾离体细胞BTI-TN-5B1,抗性发展速度呈S形曲线,经56代选择后,抗性比上升至1 280倍.在去除选择压力后,抗性比逐渐下降.低水平抗性细胞抗性衰退较快,而高水平抗性细胞抗性衰退较缓慢.抗性比衰退至1.5倍的细胞在复筛后抗性比恢复较快.抗性细胞对苏云金杆菌工程菌GC-91(Bt GC-91)、苏云金杆菌鲇泽亚种(B.t.awazai)和苏云金杆菌库斯塔克亚种(B.t.kurstaki)的复合毒素晶体的活性毒素都具有较高的交互抗性,但对农药无交互抗性,对杆状病毒的敏感性也没发生变化.     

沙蚕毒素类杀虫剂作用机制及其抗性的研究进展

本文对沙蚕毒素类杀虫剂的研究历史、对害虫的作用机制、害虫对沙蚕毒素类杀虫剂的抗性及其抗性治理研究进展等作了介绍。     

球形芽孢杆菌杀蚊毒素的作用方式和蚊虫的抗性特征

球形芽孢杆菌（Bacillussphaericus）是一种对蚊幼虫有毒杀作用的好气芽孢杆菌。高毒力菌株在芽孢形成过程中能产生有51．4和41．9kDa蛋白组成的伴孢晶体。蚊幼虫取食芽孢／晶体混合物后,晶体蛋白被降解形成活性蛋白而结合到中肠上皮细胞的特异性结合位点上,最后导致蚊幼虫死亡;低毒力菌株和部分高毒力菌株在其营养体生长阶段可产生可溶性的100、30．5和38．5kDa的Mix毒素（Mtx1、Mtx2和Mix3）。该毒素同晶体毒素和其它杀虫毒素无同源性,其杀蚊作用机理不详。在实验室和野外长期高选择性压力下,蚊幼虫会通过中肠上皮细胞二元毒素特异性结合位点的改变而对球形芽孢杆菌产生不同水平的抗性,其抗性特性是由位于染色体上的单一隐性基因决定的。本文简述了球形芽孢杆菌的杀蚊毒素的作用方式及抗性蚊虫的抗性特性。     

不同种松树对松树蜂毒素抗性的初步研究

松树蜂(Sirex noctilio Fabricius)是一种重要的国际检疫性蛀干害虫。目前在我国松树蜂潜在寄主范围内,不同树种对松树蜂毒素抗性之间的差异尚不明确。本文以室内栽培的2~3 a生油松、樟子松、红松、湿地松、马尾松及雪松这6种树种为供试寄主,培育3个月后分别接种毒素、毒素真菌混合液并测定每株枝条针叶的RGB值以及叶绿素含量。结果表明,形态上油松和樟子松幼苗接种毒素、毒素真菌混合液后一段时间内,均出现了比较明显的针叶枯黄、脱落的现象,且混合组长势萎蔫,脱落严重,对照组无明显变化。马尾松幼苗只有接种混合液后变化明显,雪松、红松、湿地松接种后长势强劲,长出新芽。从数值化的角度,油松和樟子松幼苗接种毒素、毒素和真菌混合液后,针叶的RGB值减小及叶绿素含量值显著降低。马尾松幼苗只有接种混合液后,RGB值和叶绿素含量才减小。雪松、红松、湿地松接种毒素以及毒素真菌混合液后,RGB值及叶绿素含量均没有明显变化。以上可以看出樟子松和油松对于松树蜂毒素、毒素真菌混合液的抗性较弱,马尾松对松树蜂毒素具有一定的抗性,对毒素真菌混合液的抗性较弱,红松、湿地松、雪松对两者都具有一定的抗性。该结果可为明确松树蜂在我国潜在的寄主范围及寄主选择性提供科学依据。     

黏虫对Cry1Ab蛋白的抗性遗传规律及与其他蛋白的交互抗性

为转Bt作物抗性治理策略的有效实施提供依据,采用遗传杂交和毒力生测方法评价黏虫Mythimna separata Cry1Ab蛋白抗性品系对Cry1Ab蛋白的抗性显性度,明确调控抗性基因的位置和数目以及对Cry1F和Vip3Aa19蛋白的敏感性。结果显示,Cry1Ab蛋白对黏虫正交F₁代和反交F₁代的LC₅₀分别为15.30μg/g和12.91μg/g,抗性为常染色体调控;在浓度2.5～50.0μg/g范围内黏虫对Cry1Ab蛋白的抗性显性水平随着浓度的变化而变化,即在2.5μg/g时黏虫对Cry1Ab蛋白的抗性为不完全显性遗传,在50.0μg/g时黏虫对Cry1Ab蛋白的抗性为不完全隐性遗传。黏虫对Cry1Ab蛋白的抗性受多基因调控。另外,黏虫Cry1Ab抗性品系对Cry1F和Vip3Aa19蛋白未产生交互抗性,抗性倍数分别为0.9和1.1。     

我国棉铃虫对Bt蛋白Cry1Ac抗性现状及分子机制研究进展

棉铃虫Helicoverpa armigera是一种全球性的重要农业害虫,主要为害棉花、玉米和大豆等作物。长期种植单价Bt棉花（表达Cry1Ac蛋白）会使棉铃虫田间种群承受单一、持续的选择压力,必然会导致棉铃虫对Cry1Ac的抗性发生演化。该文概述我国棉铃虫田间种群对Cry1Ac的抗性现状、自然庇护所对棉铃虫Cry1Ac抗性演化的延缓作用以及棉铃虫对Cry1Ac抗性的遗传多样性,并对今后我国关于棉铃虫Bt抗性的治理对策进行了展望。     

Cry1Ac抗性亚洲玉米螟对四种Bt蛋白的交互抗性

种Bt蛋白Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1Ah和Cry1Ie对敏感品系ACB-BtS和抗性品系ACB-AcR的毒力,结果显示,ACB-AcR对Cry1Ah的相对抗性倍数达14.9倍,有显著的交互抗性;对Cry1Ab的相对抗性倍数为4.3倍,交互抗性水平较低;对Cry1Ie的相对抗性倍数为0.9,即无交互抗性.4种蛋白对抗、感品系的EC50表明,ACB-AcR品系对Cry1Ac蛋白产生了显著的抗性,相对抗性达到32.6倍,对Cry1Ah和Cry1Ab有低水平的交互抗性,而对Cry1Ie没有交互抗性.     

Developmental studies of transgenic maize expressing Cry1Ab on the African stem borer, Busseola fusca; effects on midgut cellular structure

BACKGROUND: Busseola fusca is a major pest of maize in Africa but unfortunately is difficult to control using chemical insecticides. Insect‐resistant transgenic crops may provide an alternative viable strategy to control this pest. RESULTS: Recombinant Cry1Ab (1%) reduced larval weight by 60% over the trial period, while larval weight in the control group increased by 25%; no effects on mortality were observed. Insect survival, developmental rate and pupal and adult weight were significantly reduced (P < 0.05) on maize expressing Cry1Ab (MON810) compared with the non‐transformed parental line. These differences were more pronounced with second‐instar larvae than with third‐instar larvae. Leaf area consumed by Bacillus thuringiensis (Bt)‐fed larvae was significantly lower (0.5 cm² larva^?1 day^?1) compared with the area consumed by control‐fed insects (3.3 cm² larva^?1 day^?1). EM studies revealed that consumption of Bt maize deleteriously affected gut integrity. Effects were observed in columnar cells of the midgut epithelium, with the cytoplasm becoming highly vacuolated; the microvilli were disorganised, the mitochondria were abnormal and there was an increase in the number of lysosomal bodies. The rough endoplasmic reticulum had also become dilated. CONCLUSION: This study confirms the potential for Bt maize, when used as part of an IPM programme, for control of B. fusca. Copyright © 2011 Society of Chemical Industry     

球形芽胞杆菌Cry48Aa/Cry49Aa杀蚊毒素与致倦库蚊中肠上皮细胞复合物的结合特性

Cry48Aa/Cry49Aa毒素是近年来在球形芽胞杆菌IAB59中发现的新型双组分毒素,仅对库蚊具有较高的毒杀作用并能杀死二元毒素(Bin)抗性库蚊,是一种比较有潜力的新型杀蚊毒素蛋白,但目前对Cry48Aa/Cry49Aa毒素的作用模式还不清楚。本研究将cry48Aa和cry49Aa基因在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株中表达,纯化毒素的生测结果表明该复合毒素对Bin毒素敏感和抗性致倦库蚊均表现较高的毒杀作用,毒力无显著差异。生物素标记的毒素与致倦库蚊BBMF特异性结合试验表明Cry48Aa和Cry49Aa毒素与两蚊虫品系BBMF都具有较高的结合特异性,Cry48Aa结合能力较高,其解离常数(Kd)分别为(9.5±1.8)和(13.9±2.3)nmol/L;Cry49Aa的解离常数分别为(25.4±3.8)和(28.1±4.2)nmol/L。异源竞争结合试验结果表明Cry48Aa毒素则可以有效地和Cry49Aa毒素竞争结合BBMF蛋白上的结合位点,其IC₅₀分别为(22.1±3.7)和(15.4±2.6)nmol/L,而Cry49Aa不能竞争封闭Cry48Aa毒素与两蚊虫品系BBMF蛋白的结合位点,其IC₅₀均大于17μmol/L。该研究结果可为揭示Cry48Aa/Cry49Aa毒素的作用机制提供一定的研究基础。     

美国白蛾hcapn3基因的克隆及HcAPN3蛋白与Cry1Ac结合特性分析

通过比对分析已知昆虫氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)氨基酸序列并结合本实验室的美国白蛾(Hyphantria cunea)中肠iTRAQ结果,设计了hcapn3基因特异引物,获得hcapn3基因片段。通过RACE-PCR技术获得美国白蛾中肠氨肽酶N基因(hcapn3)全长序列(GenBank登录号为KJ013598)。Blastp分析表明,获得的氨肽酶属于氨肽酶N3家族,命名为HcAPN3。序列分析显示HcAPN3包括952个氨基酸残基,具有典型的谷氨酸锌化氨肽酶(Gluzincin)结构域和羧基端(ERAP1_C)结构域。利用Bac to Bac表达系统在昆虫细胞中表达108kDa的HcAPN3蛋白。在原核表达系统中表达58kDa的Gluzincin结构域和49kDa ERAP1_C的结构域蛋白。Ligand Blot分析结果显示,HcAPN3蛋白及Gluzincin结构域可与Cry1Ac蛋白特异性结合,但ERAP1_C结构域未能与Cry1Ac结合。本研究首次克隆了美国白蛾氨肽酶基因并分析了HcAPN3与Cry1Ac的结合特性,为下一步功能研究提供基础。