人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒表达载体转染兔骨髓间充质干细胞*

背景：采用GatewayTM技术构建腺病毒载体,显著弥补了外源性细胞因子局部应用的缺陷。 目的：观察人骨形态发生蛋白2重组腺病毒表达载体(Ad-BMP-2/GFP)转染兔骨髓间充质干细胞后骨形态发生蛋白2的表达情况。 方法：密度梯度离心联合贴壁培养法,分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞;GatewayTM技术构建的Ad-BMP-2/GFP腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞。 结果与结论：RT-PCR检测转染诱导后的细胞表达成骨细胞特异性产物骨钙素;转染后兔骨髓间充质干细胞在mRNA水平和蛋白水平均有人骨形态发生蛋白2的表达。结果表明构建的Ad-BMP-2/GFP可高效转染兔骨髓间充质干细胞,骨形态发生蛋白2在细胞中能高效表达。     

多孔磷酸钙骨水泥与转染骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞复合修复股骨髁骨缺损

BACKGROUND: Bone morphogenetic protein (BMP) can improve the osteogenesis capacity of tissue-engineered bone. However, how to prolong BMP release is a key for constructing tissue-engineered bone. OBJECTIVE: To study the repair effect of porous calcium phosphate cement (CPC) with bone marrow mesenchymal stem cells transfected with BMP-2 gene on bone defects. METHODS: After modeling of bilateral femoral condyle bone defects, 12 model rabbits were given implantation of porous CPC with bone marrow mesenchymal stem cells transfected with BMP-2 on the left (experimental group) and given implantation of porous CPC with bone marrow mesenchymal stem cells on the right (control group). Bilateral femoral condyles were taken and analyzed histologically at 4 and 12 weeks after implantation. RESULTS AND CONCLUSION: Better osteogenesis including more newly formed bone tissues and faster scaffold absorption was observed in the experimental group compared with the control group at 4 and 12 weeks after implantation. The area of newly formed bone tissues at different time and rate of bone formation at 12 weeks were significantly higher in the experimental group than in the control group (P < 0.001, P < 0.05). These findings indicate that transfer of BMP-2 into bone marrow mesenchymal stem cells combined with porous CPC could increase repair of bone defects.     

腺病毒介导骨形态发生蛋白2诱导兔骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:天然骨形态发生蛋白2在体内无法实现缓释、持续诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,如何获得内源性骨形态发生蛋白2蛋白是目前研究的热点.目的:探讨腺病毒介导人骨形态发生蛋白2转染兔骨髓间充质干细胞的成骨分化能力及其可能机制.方法:采用腺病毒介导人骨形态发生蛋白2基因转染第3代兔骨髓间充质干细胞,转染后48 h采用qR...     

骨形态发生蛋白7转染骨髓间充质干细胞再生骨组织

背景：骨形态发生蛋白7具有促进骨髓间充质干细胞分裂增殖的作用,在诱导新骨形成方面有重要的研究意义。 目的：观察携带人骨形态发生蛋白7慢病毒载体转染后骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白7蛋白及mRNA的表达。 方法：提取并培养大鼠骨髓间充质干细胞,通过形态学和细胞表面标记进行鉴定;构建携带人骨形态发生蛋白7的慢病毒载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞,提取RNA后采用RT-PCR的方法检测骨形态发生蛋白7 mRNA水平相对表达量的变化,Western blotting检测骨形态发生蛋白7蛋白水平相对表达量的变化。 结果与结论：成功构建了携带骨形态发生蛋白7基因的慢病毒载体PLV-sfGFP(2A)-BMP7,重组载体质粒成功转染至大鼠骨髓间充质干细胞中,转染组的骨形态发生蛋白7 mRNA和蛋白表达高于空载体组和空白组,差异有显著性意义(P < 0.05),说明外源性骨形态发生蛋白7基因被有效整合到骨髓间充质干细胞并进行表达。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

骨髓间充质干细胞在骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙载体上的成骨

背景：将生长因子复合到支架上构建复合材料可同时具备骨诱导和骨传导作用。 目的：观察骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙复合载体对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导成骨的影响。 方法：取生长状态良好的第2代SD大鼠骨髓间充质干细胞悬液,分3组培养：实验组将细胞悬液滴加到骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙复合材料表面,对照组在细胞悬液中加入骨形态发生蛋白2,空白对照组正常培养。 结果与结论：3组细胞随培养时间延长逐渐增多,实验组细胞数量最多,明显多于对照组及空白对照组(P < 0.05)。实验组培养不同时间点碱性磷酸酶活性高于对照组及空白对照组(P < 0.05)。体外实验显示骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙复合载体可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。     

pIRES-骨形态发生蛋白2质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞后的 持续表达

背景：重组人骨形态发生蛋白2已被广泛应用于骨组织工程治疗骨缺损或骨不连,但是直接应用外源性骨形态发生蛋白2修复骨缺损效果不理想。 目的：观察转染pIRES-骨形态发生蛋白2的大鼠骨髓间充质干细胞持续合成并分泌骨形态发生蛋白2的情况。 方法：全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,脂质体介导下将真核表达质粒pIRES-骨形态发生蛋白2导入大鼠骨髓间充质干细胞。 结果与结论：ELISA结果显示,随着pIRES-骨形态发生蛋白2转染时间的延长,大鼠骨髓间充质干细胞分泌的骨形态发生蛋白2逐渐增多,至转染后10~12 d达高峰,转染后15 d,仍可见较多骨形态发生蛋白2的表达。说明转染pIRES-骨形态发生蛋白2的大鼠骨髓间充质干细胞可持续稳定分泌骨形态发生蛋白2。     

人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞后的细胞增殖

背景：利用重组腺病毒载体转染外源性基因到组织工程骨的种子细胞是骨缺损基因治疗研究的热点。 目的：用人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞,以探讨基因转染对人骨髓基质干细胞增殖的影响。 方法：将Ad-hBMP2-IRES-hFGF2转染至人骨髓基质干细胞中,荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR方法观察人骨形态发生蛋白2 cNDA和人成纤维细胞生长因子2 cNDA在人骨髓基质干细胞中的转录情况,Wester blot 方法检测人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2蛋白表达情况,锥虫蓝测定细胞活力,流式细胞仪分析其对细胞增殖的影响。 结果与结论：转染后人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达,细胞活力无明显变化,流式细胞仪分析细胞周期中增殖细胞比例明显增加。说明该双基因可高效转染人骨髓基质干细胞,且促进细胞增殖。     

携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞及其成脂分化

背景：胰岛素是成脂诱导剂的重要组成成分。然而胰岛素存在半衰期,会随着体内代谢不断灭活及降解,植入体内的细胞或材料无法像体外那样以更换培养液来达到目的。实验拟通过转染胰岛素基因,使转染后的干细胞稳定分泌胰岛素,促进其成脂分化。 目的：探讨携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞后对其成脂分化能力的影响。 方法：取第3代人脐带间充质干细胞,以感染复数为20转染腺病毒载体。实验分为4组：对照组为第4代人脐带间充质干细胞;实验组1为腺病毒转染的第4代人脐带间充质干细胞;实验组2为第4代人脐带间充质干细胞+成脂诱导液;实验组3为腺病毒转染的第4代人脐带间充质干细胞+成脂诱导液。 结果与结论：转染48 h后实验组1和实验组3的人脐带间充质干细胞在荧光显微镜下显现弱荧光,72 h后荧光较强。经脂肪诱导培养液培养14 d后,实验组1,2,3油红O染色后显微镜下呈红色,对照组未见脂滴形成,实验组1可见一些细小脂滴形成;实验组3与实验组2相比,脂滴大且多,定量分析显示,实验组3油红O染色阳性的面积和吸光度大于实验组2(P < 0.05)。由此说明携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞后可促进其成脂能力。     

转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因共转染骨髓干细胞

背景：骨形态发生蛋白2及转化生长因子β是骨再生中重要的因子,提高其表达可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。 目的：构建携带转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的慢病毒载体,观察其在骨髓间充质干细胞中的表达情况。 方法：应用重组慢病毒技术构建同时携带转化生长因子β3、骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒表达载体,并用其转染体外培养的第3代兔骨髓间充质干细胞,以转染携带转化生长因子β3或骨形态发生蛋白2单一基因的慢病毒或单独慢病毒的骨髓间充质干细胞作为对照。转染后1周分别提取各组细胞的总RNA和蛋白进行检测。 结果与结论：荧光显微镜下见转染转化生长因子β3和(或)骨形态发生蛋白2基因3 d的骨髓间充质干细胞发绿色荧光,转染效率达90%以上。RT-PCR和Western blot结果显示,转染转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2 mRNA和蛋白的表达均高于单一基因转染组及空白对照组。可见应用慢病毒可成功将转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因转染至骨髓间充质干细胞并实现其高效表达,且两种基因具有协同促表达作用。     

骨髓间充质干细胞复合异体骨修复松质骨缺损

背景：有研究表明骨髓间充质干细胞及异体骨可促进骨缺损的修复,但骨髓间充质干细胞复合异体骨对于松质骨缺损的修复效果至今少有报道。 目的：观察骨髓间充质干细胞复合异体骨修复兔松质骨缺损效果。 方法：在新西兰大白兔双侧股骨外侧髁造成0.6 cm×1.2 cm 的松质骨缺损,一侧设为模型组,骨缺损处植入复合骨髓间充质干细胞的异体骨,另一侧设为对照组,单纯植入异体骨。 结果与结论：植入后4,8,12周,大体观察、X射线检查和苏木精-伊红染色观察结果显示,模型组在新骨成长方面,缺损区修复方面均优于对照组。植入后12周,模型组骨缺损区可见大量骨小梁形成及成熟的板层骨组织,骨缺损基本修复。对照组骨缺损区仅可见大量编织骨形成,骨缺损尚未得到有效修复。模型组Lane-Sandhu法X射线结合组织学观察评分高于对照组(P < 0.05)。生物力学检测结果显示,植入后12周,模型组股骨髁最大压力载荷、载荷/应变比值均高于对照组(P < 0.05),最大应变位移较对照组低(P < 0.05)。结果证实,骨髓间充质干细胞复合异体骨可有效修复兔股骨髁松质骨缺损,且修复效果明显优于单纯异体骨移植。     

骨形态发生蛋白12诱导骨髓间充质干细胞构建组织工程肌腱

背景：以往肌腱损伤的修复方法有端端吻合、自体肌腱移植、同种异体肌腱或人工肌腱移植等,但均有其各自缺点。 目的：探讨以家兔骨髓间充质干细胞为种子细胞,骨形态发生蛋白12诱导,聚羟基乙酸复合材料作为支架材料,预构组织工程化肌腱重建家兔跟腱缺损的可能性。 方法：家兔抽取股骨近端骨髓,分离所得细胞传代至第2代,加入10 μg/L骨形态发生蛋白12诱导分化,并与Ⅰ型胶原溶液按一定比例移植于预张的聚羟基乙酸缝线上预制组织工程化肌腱备用。将家兔制备成跟腱缺损模型,分别采用不同方法修复跟腱缺损：组织工程化肌腱修复,Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸缝线修复,丝线行端端修复。修复12周对各组肌腱行形态学、力学及组织病理学观察。 结果与结论：修复12周家兔肌腱组织病理切片：组织工程化肌腱组可见大量梭形纤维母细胞顺应力学方向排列均匀分布于胶原中,纤维细胞明显增多,胶原致密;Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸缝线组可见部分纤维组织增生伴少许肉芽组织形成,胶原纤维呈松散网丝状,细胞排列紊乱分布不均;丝线组可见纤维组织旁见大量肉芽组织形成。修复12周家兔肌腱生物力学强度：骨形态发生蛋白12+聚羟基乙酸重建肌腱的力学强度明显优于Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸组,与丝线缝合组差异无显著性意义;但骨形态发生蛋白12+聚羟基乙酸重建肌腱的力学强度低于正常肌腱。提示以自体骨髓间充质干细胞作为种子细胞,骨形态发生蛋白12诱导,以聚羟基乙酸为支架,可望构建组织工程化肌腱。构建的组织工程肌腱具有一定的生物力学特性,能用于修复跟腱缺损。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向血管平滑肌样细胞的诱导分化

背景：有研究表明,血管外膜成纤维细胞被激活早期参与动脉粥样硬化及血管再狭窄的形成,另有研究表明,骨髓间充质干细胞有部分黏附分化参与血管重塑,实验拟从血管外膜成纤维细胞与骨髓间充质干细胞之间相互作用的角度,来探讨动脉硬化及血管损伤后再狭窄过程中的可能机制。 目的：观察骨髓间充质干细胞与血管外膜成纤维细胞直接接触培养后,骨髓间充质干细胞形态改变及表达血管平滑肌肌动蛋白的情况。 方法：将骨髓间充质干细胞(DAPI标记细胞核)与外膜成纤维细胞按一定的比例混合培养7 d,细胞单独培养作对照,显微镜下观察细胞形态变化,免疫荧光检测骨髓间充质干细胞平滑肌肌动蛋白表达的情况。 结果与结论：骨髓间充质干细胞与血管外膜成纤维细胞共培养后,可见骨髓间充质干细胞的细胞核蓝染(DAPI标记细胞核)、胞浆红染(平滑肌肌动蛋白阳性)的双标细胞出现,且随培养时间的延长,骨髓间充质干细胞的平滑肌肌动蛋白表达阳性率明显增高。结果可见与血管外膜成纤维细胞直接接触有诱导骨髓间充质干细胞向血管平滑肌样细胞分化的趋势。     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景：以骨髓间充质干细胞构建组织工程气管尚缺乏理想的特异性表面标志物,对其鉴定主要依赖细胞形态学、细胞表型及诱导分化的功能进行分析。 目的：体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察在特定条件下向气管软骨细胞分化的潜能。 方法：无菌环境取兔骨髓,经全骨髓贴壁筛选法分离培养细胞至第2代,流式细胞术鉴定第1、第2代细胞表面抗原CD44、CD45的表达。无菌环境取气管,经酶消化法分离培养气管软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞蛋白聚糖的合成。在使用转化生长因子β1的基础上,将骨髓间充质干细胞与气管软骨细胞通过Transwell小室非接触式共培养,倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色鉴定蛋白聚糖的合成,荧光实时定量PCR鉴定Ⅱ型胶原和蛋白聚糖 mRNA的表达。 结果与结论：分离、培养的细胞呈长梭形、不规则形聚集生长,传代后细胞生长速度明显增快,呈鱼群状聚集生长。第1代有96.97%的细胞表达CD44、13.72%的细胞表达CD45,第2代有99.11%的细胞表达CD44、8.54%的细胞表达CD45。气管软骨细胞甲苯胺蓝染色阳性。在诱导后,骨髓间充质干细胞形态逐渐由长梭形变为三角形或不规则形,表达软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白聚糖 mRNA基因,甲苯胺蓝染色示阳性。结果表明全骨髓贴壁筛选法可成功分离培养骨髓间充质干细胞,第2代纯度较高,且在特定诱导条件下具有分化为气管软骨细胞的潜能。     

沉默caspase-3基因影响骨髓间充质干细胞的增殖和凋亡

背景：缺血缺氧的心肌微环境导致植入的细胞存活率低。 目的：观察沉默caspase-3基因对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和体外缺血缺氧环境下凋亡的影响。 方法：构建靶向caspase-3的shRNA重组慢病毒并转染骨髓间充质干细胞为转基因组,以正常细胞组和空载体组做对照,采用MTS法检测各组细胞增殖情况。建立缺血缺氧模型,real-time PCR和免疫组织化学分别检测缺血缺氧环境各组细胞的caspase-3 mRNA和蛋白表达水平,应用流式细胞术检测不同缺血缺氧时间点(0,6,12,24,48 h)各组细胞的凋亡率。 结果与结论：重组慢病毒成功转染骨髓间充质干细胞,且细胞增殖活性升高(P < 0.05)。缺血缺氧环境下,转基因组细胞caspase-3在mRNA和蛋白表达水平相比对照组下降(P < 0.05)。沉默caspase-3能显著降低骨髓间充质干细胞的凋亡率(P < 0.05),且随着缺血缺氧时间的延长凋亡率缓慢升高。结果提示,沉默caspase-3能加快骨髓间充质干细胞的生长速度和提高在体外缺血缺氧环境下的抗凋亡能力。     

MRI活体示踪心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞的移植

背景：干细胞移植的疗效和安全性评估均需要对体内干细胞的存活、分布、迁徙、增殖及分化进行连续监测。 目的：观察MRI示踪超顺磁性氧化铁标记的骨髓间充质干细胞在缺血心肌组织的分布、迁徙情况。 方法：直接贴壁法分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞,获得的细胞进行免疫鉴定。以新型超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞,体外MRI成像确定其体内示踪的可行性。标记后锥虫蓝拒染试验、MTT比色试验分别检测标记细胞的活力、增殖情况。60只SD大鼠随机分为3组,制备大鼠心肌梗死模型2周后再次开胸移植含标记骨髓间充质干细胞的PBS混合液、含未标记骨髓间充质干细胞的PBS混合液和等量PBS。于移植后第1天、第3周行MRI检查,动态观察移植细胞的分布、迁徙,并根据MRI图像定位选择性行CD90免疫组化检查。 结果与结论：骨髓间充质干细胞标记后,普鲁士蓝染色见胞浆内蓝色铁颗粒,标记效率为99%,标记细胞与未标记细胞间锥虫蓝拒染率、MTT吸光度差异无显著性意义。体外MRI可检测到标记细胞,并在T2WI及T2W/FFE序列上呈低信号。细胞移植1 d后,在T2WI及T2W/FFE序列上可见标记细胞在梗死心肌边缘呈类圆形低信号;移植3周后,移植区域信号边界模糊,范围扩大,对比度降低。CD90免疫组化检测证实移植细胞可由梗死边缘向梗死区域迁徙。结果可见新型超顺磁性氧化铁可成功对大鼠骨髓间充质干细胞进行标记,细胞标记后可被MRI检测。     

柚皮甙诱导兔骨髓间充质干细胞的成骨特征

背景：骨碎补能在促进骨生长且取得了良好的临床疗效,其主要成分柚皮甙能否诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化？ 目的：用柚皮甙诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化。并观察柚皮甙诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的能力。 方法：用贴壁筛选法对兔骨髓间充质干细胞进行分离培养。对生长良好的第3代骨髓间充质干细胞分别用50 μg/L的柚皮甙和经典成骨诱导剂向成骨方向进行诱导,分别进行成骨鉴定。 结果与结论：经典成骨诱导液、柚皮甙诱导液都能使骨髓间充质干细胞向成骨方向分化,基质分泌增多,形成钙结节。用酶联免疫检测仪检测柚皮甙诱导组和经典成骨诱导组细胞吸光度值未见明显的差异。同时检测柚皮甙诱导液和L-DMEN细胞培养液的吸光度值发现两者差异无显著性意义(P > 0.05)。证实柚皮甙可成功诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化,无明显毒性作用。     

热休克汗腺细胞诱导人骨髓间充质干细胞的表型转化

背景：未休克汗腺细胞与骨髓间充质干细胞的共培养和休克汗腺细胞与骨髓间充质干细胞的直接共培养均对骨髓间充质干细胞的表型改变无影响。 目的：在体外建立热休克汗腺细胞模型和骨髓间充质干细胞与汗腺细胞间接共培养体系;分析共培养前后骨髓间充质干细胞的形态学、细胞表型的变化情况,探讨骨髓间充质干细胞向汗腺细胞分化的可行性。 方法：体外分别分离培养、扩增并鉴定骨髓间充质干细胞和汗腺细胞,建立汗腺细胞体外热休克模型,继续孵育3-5 d,收集上清液作为条件培养基对骨髓间充质干细胞分化诱导,对比共培养5,10 d骨髓间充质干细胞形态学变化;应用免疫组织化学和流式细胞仪法检测对比共培养10 d后骨髓间充质干细胞细胞表型的改变。 结果与结论：①骨髓间充质干细胞表面标志 CD29、CD44、CD105阳性,汗腺细胞表面标志CK7、CK8、CK18、CK19、CEA阳性。②骨髓间充质干细胞诱导分化后细胞表型的改变：被诱导的细胞中CEA、CK7、CK8和CK19 染色阳性,而对照组没有检测到CEA、CK7、CK8和CK19染色阳性的细胞;流式细胞仪检测CEA、CK7、CK8和CK19的阳性率分别是60.67%,53.34%,54.11%和58.62%。说明实验成功诱导骨髓间充质干细胞,并获得汗腺细胞表型;通过建立适当的体外汗腺诱导培养体系,中胚层的骨髓间充质干细胞可以通过跨胚层分化途径转变为汗腺细胞。