卡托普利对缺氧/复氧乳鼠心室肌细胞游离钙的影响及其离子通道机制

目的：观察卡托普利晚期预处理对缺氧/复氧乳鼠心室肌细胞游离钙的影响及其离子通道机制。方法:建立培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型。设正常对照组、缺氧/复氧组、缺氧预适应组和卡托普利组。经Flou-3/AM负载染色后，采用流式细胞分析技术，测定细胞内钙离子浓度(［Ca²⁺］i)；利用膜片钳技术，观察L-型钙通道和钠钙交换电流的变化。结果:（1）缺氧/复氧时，［Ca²⁺］i和Na⁺/Ca²⁺交换电流高于正常对照组（P<0.01），L-型钙电流（I_Ca-L）峰值下降，I-V曲线上移，半数失活电压(V_0.5)减小，ICa-L失活曲线左移。（2）晚期预处理和卡托普利使缺氧/复氧时［Ca²⁺］i低于缺氧/复氧组（P<0.01）；I_Ca-L增加，I-V曲线下移，V_0.5增大及稳态失活曲线右移；Na⁺/Ca²⁺ 交换电流减少；但［Ca²⁺］i和Na⁺/Ca²⁺交换电流高于对照组（P<0.05）。（3）卡托普利组与缺氧预适应组比较上述指标均无显著差异 。结论：心肌细胞缺氧/复氧，通过Na⁺/Ca²⁺交换电流的异常增加可引起［Ca²⁺］i的异常升高及其钙超载；卡托普利通过轻度增加Na⁺/Ca²⁺交换电流及其［Ca²⁺］i而触发晚期预处理，抑制后续缺氧/复氧引起的Na⁺/Ca²⁺交换电流及其［Ca²⁺］i的异常增加。     

附子多糖保护缺氧/复氧乳鼠心肌细胞及其抗内质网应激的机制研究

目的: 观察附子多糖对缺氧/复氧后心肌细胞的保护,并探讨附子多糖的保护机制是否与其抑制内质网应激反应有关。方法: 建立乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型,将乳鼠心肌细胞分为正常对照组、缺氧/复氧组(缺氧3 h后复氧6 h)和不同浓度附子多糖(0.1 g/L、1 g/L、10 g/L、20 g/L)+缺氧/复氧组。MTT法测定心肌细胞存活率,流式细胞术检测心肌细胞凋亡率,Western blotting分析葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)及caspase-12的表达,荧光定量PCR进一步检测CHOP及caspase-12 mRNA表达。结果: 缺氧复氧后,心肌细胞中内质网应激反应标志蛋白GRP78表达增加,内质网应激凋亡相关蛋白CHOP及caspase-12蛋白和mRNA表达亦明显升高。与缺氧/复氧组相比较,附子多糖预处理24 h后可以有效抑制缺氧/复氧引起的GRP78、 CHOP和caspase-12的表达上调,增加心肌细胞的存活率,抑制心肌细胞凋亡的发生。附子多糖的保护效应呈剂量依赖形式,10 g/L剂量时达到峰值。结论: 附子多糖保护缺氧/复氧后心肌细胞的可能机制与其抑制内质网应激所介导的细胞凋亡途径相关。     

参附注射液对缺氧复氧损伤心肌的保护作用及机制研究

随着心肌缺血治疗过程中多种血管再通技术的广泛应用。由此引起的心肌再灌注损伤(myocardial reperfusion injury；MRI)问题亦日趋突出。因而探索心肌缺血再灌注损伤的机制和防治措施，已成为当今医学研究的热点之一。     

抗衰老Klotho蛋白减轻大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的:观察抗衰老Klotho蛋白对大鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的作用并探讨其作用机制。方法:建立大鼠乳鼠心肌细胞H/R模型,并将心肌细胞分为正常对照组、H/R模型组和不同浓度(0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L)Klotho作用H/R组。观察各组心肌细胞H/R前后搏动频率变化,利用MTT方法检测细胞存活率;测定各组心肌细胞H/R后LDH、CK、AST的漏出量及MDA含量、SOD活性;流式细胞术检测各组心肌细胞的凋亡率;real-time PCR检测各组心肌细胞中内质网应激标记及凋亡相关分子GRP78、CRT和CHOP和caspase-12 mRNA的表达情况;Western blot法检测心肌细胞内内质网应激凋亡蛋白CHOP和caspase-12蛋白表达及Akt磷酸化水平。结果:与正常对照组相比,H/R模型组中心肌细胞搏动频率和细胞存活率显著下降,细胞凋亡率显著升高(P0.05);LDH、CK、AST和MDA含量升高而SOD活性显著降低(P0.05);GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA表达显著增高(P0.05);CHOP和caspase-12蛋白表达随之增高而Akt的磷酸化水平显著降低(P0.05)。与H/R模型组相比,抗衰老Klotho蛋白作用H/R心肌细胞后,心肌细胞搏动频率和细胞存活率显著升高,细胞凋亡率逐渐降低(P0.05),LDH、CK、AST和MDA含量下降而SOD活性显著增高(P0.05),GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA的表达逐渐降低(P0.05),CHOP和caspase-12蛋白表达也随之降低,而Akt磷酸化水平显著增加(P0.05)。结论:抗衰老Klotho蛋白能够提升H/R损伤后心肌细胞的存活率,抑制细胞凋亡,通过抵抗氧化应激和过度内质网应激反应发挥作用,并与激活Akt磷酸化有关。     

甘氨酸受体在甘氨酸抗心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用机制研究

目的：探讨甘氨酸受体在心脏保护中的作用及甘氨酸受体的性质。方法：利用原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞建立心肌缺氧/复氧(A/R)模型，并用甘氨酸受体阻断法和消除细胞外氯离子法, 测定各组培养心肌细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）及一氧化氮（NO）的含量、钙离子浓度和心肌细胞凋亡率。结果：A/R组用甘氨酸处理后SOD活性、NO含量升高，MDA含量、［Ca²⁺］_i、细胞凋亡率降低，与A/R组比较显著差异。分别用甘氨酸受体阻断剂士的宁和消除细胞外氯离子处理后，甘氨酸的上述保护作用明显减弱，与A/R组比较无显著差异。结论：甘氨酸能抑制缺氧/复氧乳鼠心肌细胞的自由基生成、抑制钙超载，减轻心肌细胞的凋亡并增加细胞内SOD等保护蛋白和NO的合成而发挥细胞保护作用。甘氨酸的细胞保护作用可能是通过甘氨酸受体发挥作用的，甘氨酸受体的本质可能是甘氨酸门控氯离子通道。     

丙泊酚减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤

目的 探讨丙泊酚(Pro)通过调控JNK/p38 MAPK通路对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响.方法 将细胞分为对照(control)组、缺氧/复氧(A/R)组、缺氧/复氧+Pro低、中、高剂量(A/R+Pro-L、A/R+Pro-M、A/R+Pro-H)组、缺氧/复氧+Pro+p38 MAPK通路抑制剂(A/R+...     

HBSP减轻急性缺氧复氧大鼠心肌细胞损伤

目的研究促红细胞生成素衍生肽(HBSP)对急性缺氧/复氧心肌细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。方法体外培养H9C2乳鼠心肌细胞系,建立缺氧(3 h)/复氧(3 h)模型。实验分为对照组、缺氧/复氧组(A/R)、A/R+HBSP组。测定培养细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)含量;用annexin-V与PI双染法及流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率;分离细胞质与线粒体,用Western blot法检测线粒体内和胞浆中的细胞色素C蛋白的表达,用caspase试剂盒检测心肌细胞caspase-9及caspase-3的表达。结果与正常对照组比较,A/R组细胞存活率和线粒体内细胞色素C蛋白水平明显下降(P0.01),而凋亡率、caspase-9、caspase-3活性及胞质内细胞色素C蛋白水平均显著升高(P0.01)。结论HBSP对缺氧复氧乳鼠心肌细胞具有明显的保护作用,其机制可能与抑制线粒体途径介导的细胞凋亡有关。     

缺氧/复氧对培养SD乳大鼠心肌细胞端粒酶逆转录酶的影响

目的了解缺氧／复氧对培养SD乳大鼠心肌细胞端粒酶逆转录酶（TERT）表达的影响。方法采用real—time quantitative PCR与免疫组化方法检测培养SD乳大鼠心肌细胞在对照组，缺氧6h，复氧24、48h，心肌细胞TERT表达的改变。结果与对照组相比，缺氧／复氧可以使培养SD乳大鼠心肌细胞在缺氧6h、复氧24、48h心肌细胞TERT在mRNA与蛋白水平表达明显增强，与对照组相比有统计学意义（P〈0．01）。结论缺氧／复氧可以使培养SD乳大鼠心肌细胞TERT表达明显增强，可能对抗缺氧／复氧造成端粒缩短而诱导的细胞衰老。     

黄连素对缺氧复氧诱导大鼠心肌细胞内Nrf2/Keap1的影响

目的　探讨黄连素(BR)对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤后凋亡的影响及其作用机制。 方法　将培养的H9c2心肌细胞随机分为：正常对照组(NC组)、单纯药物组(BR组)、缺氧/复氧组(H/R组)、药物低剂量LBR组(1.5×10-6 mol/L)及高剂量HBR组(1.5×10-4 mol/L)。处理结束后,用MTT比色法检测H9c2心肌细胞的活力,用Hoechst33258染色检测细胞核形态的变化,用Western blot法检测Nrf2, Keap1蛋白的表达。 结果　与NC组比较,单纯BR对H9c2心肌细胞无影响。与H/R组比较,低、高剂量BR组细胞的活力明显上升(65.2±1.6%; 82.3±1.4%) (P<0.01),心肌细胞的凋亡率明显减少(P<0.05),Western blot的结果显示,BR可明显促进抗氧化相关蛋白Nrf2表达,抑制Keap1的表达。 结论　 BR对H9c2心肌细胞H/R损伤后的凋亡具有显著的抑制作用,可能与其促进抗氧化核转录因子Nrf2表达有关。     

酸枣仁总皂甙抗心肌细胞缺氧—复氧损伤作用及其机理

按Ｌａａｎｓｅ‘ｓ方法建立培养心肌细胞缺氧－复氧模型，以粘附式细胞仪检测细胞内脂质过氧化物及Ｃａ＾２＋。结果发现酸枣仁总皂甙能显著降低细胞内脂过氧化物荧光强度及Ｃａ＾２＋荧光比率，改善心肌细胞超微结构，证明酸枣仁总皂甙有保护心肌细胞，抗氧反常作用，这可能与其清除脂质过氧化物及抗Ｃａ＾２＋超载有关。     

ATP敏感性钾通道在硫化氢抑制高糖引起的心肌细胞损伤中的作用

目的:研究ATP敏感性钾通道(KATP通道)在硫化氢(H2S)抑制高糖引起心肌损伤中的作用。方法:应用Western blot法检测心肌细胞KATP通道蛋白的表达水平;CCK-8试剂盒测定心肌细胞存活率;Hoechst33258染色测定凋亡细胞数量的变化;JC-1染色法测定线粒体膜电位(MMP)。结果:应用高糖(35 mmol/L葡萄糖)处理H9c2细胞1~24 h,其中6 h、9 h、12 h和24 h均能明显下调KATP通道蛋白的水平,12 h和24 h KATP水平降至最低。在HG处理心肌细胞12 h前,应用400μmol/L硫氢化钠(Na HS,为H2S的供体)预处理30 min明显抑制高糖对KATP通道蛋白表达的下调作用。100μmol/L线粒体KATP通道开放剂二氮嗪和50μmol/L非选择性KATP通道开放剂吡拉地尔(Pin)及Na HS预处理均显著抑制高糖引起的心肌细胞损伤,使细胞存活率升高,凋亡细胞数量及MMP丢失减少。相反,100μmol/L线粒体KATP通道阻断剂5-羟基癸酸和1 mmol/L非选择性KATP通道阻断剂格列本脲均能明显阻断上述Na HS的心肌细胞保护作用。结论:KATP通道介导了H2S对高糖引起的心肌细胞损伤的抑制作用。     

硫化氢对缺氧诱导的大鼠皮层神经元损伤的保护作用

 目的:探讨硫化氢(H 2S)对缺氧诱导的皮层神经元损伤的影响及作用机制。方法:将SD大鼠皮层神经元在2% O 2、5% CO 2、93 % N 2、37 ℃培养箱培养24 h,建立细胞缺氧模型。以硫氢化钠（NaHS）作为H 2S的供体,应用CCK-8分析细胞活性;采用荧光探针DCFH-DA检测神经元活性氧(ROS)含量;用Rh123染色测定线粒体膜电位(MMP);采用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒分析神经元LDH释放率,反映神经元的损伤情况。结果:(1)缺氧引起神经元ROS含量和LDH释放率升高,NaHS预处理可抑制缺氧所致神经元ROS含量和LDH释放率的升高;(2)缺氧降低神经元MMP和细胞活性,NaHS和活性氧清除剂NAC预处理均显著抑制缺氧所致神经元MMP和细胞活性的降低。结论:缺氧增加神经元ROS含量,降低神经元MMP和细胞活性,而H 2S通过其抗氧化作用,减轻缺氧所致神经元的损伤。     

西洋参茎叶总皂苷通过抑制过度内质网应激减轻大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的: 观察西洋参茎叶总皂苷 (PQS) 对缺氧/复氧 (H/R) 心肌细胞的保护作用,并从内质网应激 (ERS)的角度探讨其分子机制。方法: 建立心肌细胞缺氧/复氧 (H/R) 损伤模型,以台盼蓝染色法、乳酸脱氢酶活性以及流式细胞术检测细胞损伤及凋亡情况;以RT-PCR和Western blotting方法,检测ERS标志分子葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)、钙网蛋白 (CRT)、C/EBP同源蛋白 (CHOP)、caspase-12及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果: 和H/R组心肌细胞相比,PQS+H/R组:(1) 细胞凋亡率降低4.19% (P<0.05),存活率升高21.2% (P<0.05),LDH活性降低66.58% (P<0.05);(2) Bcl-2 mRNA和蛋白表达分别升高30.9%和48.0% (P<0.05),Bax mRNA和蛋白表达分别降低39.7%和48.4% (P<0.05);(3) GRP78 mRNA和蛋白表达分别降低61.6%和37.7% (P<0.05),CRT mRNA和蛋白表达分别降低35.7%和52.2% (P<0.05); CHOP mRNA和蛋白表达分别降低57.0%和51.7% (P<0.05);剪切后的caspase-12蛋白表达降低34.9% (P<0.05)。结论: PQS可减轻H/R诱导的心肌细胞损伤,其机制是降低H/R诱导的GRP78、CRT mRNA和蛋白表达,抑制CHOP、caspase-12等内质网凋亡通路激活,从而抑制过度ERS介导的细胞凋亡。     

硫化氢通过抑制坏死性凋亡对抗高糖引起的H9c2心肌细胞损伤

 目的: 探讨硫化氢(hydrogen sulfide,H₂S)能否通过调控坏死性凋亡(necroptosis)对抗高糖(HG)引起的H9c2心肌细胞损伤。方法: 应用Western blot法检测心肌细胞内能反映坏死性凋亡的RIP3蛋白和cleaved caspase-3蛋白的水平;细胞计数盒测定心肌细胞存活率;双氯荧光素染色荧光显微镜照相法检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平;罗丹明123染色荧光显微镜照相法测定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP);Hoechst 33258核染色荧光显微镜照相法测定凋亡细胞的数量。结果: 应用HG(35 mmol/L葡萄糖)处理H9c2心肌细胞3 h、6 h、9 h、12 h和24 h均能明显地上调RIP3蛋白的表达水平,其中24 h时RIP3蛋白水平增加最明显。400μmol/L硫氢化钠(NaHS;为H₂S的供体)预处理或坏死性凋亡的特异性阻断剂necrostatin-1(Nec-1;100μmol/L)共处理心肌细胞均能明显地抑制HG对RIP3蛋白表达的上调作用。此外,NaHS预处理或Nec-1共处理心肌细胞均显著地抑制HG引起的心肌细胞损伤,使细胞存活率升高,ROS生成及MMP丢失减少。另一方面,400μmol/L NaHS预处理心肌细胞能使凋亡细胞数量及cleaved caspase-3表达明显减少。结论: H₂S可通过抑制坏死性凋亡保护心肌细胞,对抗高糖引起的损伤。     

外源性硫化氢减轻小鼠阻塞性肾损伤

目的:探讨外源性硫化氢(H2S)在小鼠阻塞性肾损伤中的保护作用及可能机制。方法:将8周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、手术组和H2S组,每组5只,单侧输尿管结扎(UUO)构建肾阻塞模型,H_2S组小鼠腹腔注射H_2S供体硫氢化钠(Na HS),手术组和假手术组小鼠注射等体积的生理盐水,每天1次。7 d后处死小鼠,取出肾脏,提取RNA行RT-PCR检测3组小鼠肾脏内源性H_2S催化酶mRNA表达的差异;组织HE染色观察3组小鼠肾脏的组织结构的变化;Masson染色检测3组小鼠肾脏纤维化的差异;检测血浆胱抑素C含量来反映肾小球滤过能力;Western blot检测LC3、beclin-1和纤连蛋白(FN)蛋白表达的变化。结果:与假手术组相比,手术组小鼠肾脏中胱硫醚β-合成酶(CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(CSE)和3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-MST)的mRNA表达显著降低,胶原纤维显著增多,而H_2S组小鼠肾组织胶原纤维又比模型组显著减少。与假手术组相比,手术组小鼠肾脏中FN的蛋白表达显著升高,而H_2S组小鼠的FN表达量比手术组小鼠显著降低;与假手术组相比,手术组和H_2S组小鼠肾组织细胞中LC3-II和beclin-1蛋白表达均显著增高,而H_2S组小鼠肾组织细胞中LC3-II和beclin-1蛋白表达又显著高于手术组。结论:外源性H_2S可能通过上调细胞自噬而减轻UUO小鼠的肾纤维化。     

外源性硫化氢对小鼠原代肝细胞内脂质自噬分解的影响

目的:研究硫化氢(H2S)供体GYY4137释放的外源性H2S对小鼠原代肝细胞内脂质自噬分解的影响。方法:采用2步原位灌流法分离C57BL/6小鼠原代肝细胞并分为4组:用正常培养基培养正常组细胞;模型组用含1.2 mmol/L油酸(溶于10%的BSA)的培养基培养48 h;H2S组和炔丙基甘氨酸(PAG)组则用1.2 mmol/L油酸(溶于10%的BSA)的培养液培养48 h,然后换无血清无酚红的RPMI-1640培养液(同时分别给予1 mmol/L GYY4137和200μmol/L PAG)处理6 h。收集各组细胞做LC3免疫荧光染色,拍摄荧光和相差图片;Western blot检测肝细胞中LC3-Ⅰ/Ⅱ的蛋白表达量;透射电镜观察肝细胞超微结构。结果:和模型组相比,H2S组肝细胞内LC3荧光颗粒和蛋白表达量增加,自噬溶酶体数量增加,细胞内空泡增多。结论:外源性H2S可促进脂肪变性肝细胞内脂质自噬分解。     

硫化氢对臭氧致小鼠气道炎症的影响

目的:研究硫化氢(H_2S)对臭氧(O_3)暴露所致小鼠气道炎症的影响,并探究其机制。方法:32只C57BL/6小鼠随机分为正常对照(control)组、O_3组、硫氢化钠(NaHS)+O_3组以及NaHS组。第1、3、5天将O_3组和NaHS+O_3组小鼠置于2.14 mg/m~3O_3环境中暴露3 h,同时control组和NaHS组置于新鲜空气中暴露3 h。每次暴露前30 min,NaHS+O_3组和Na HS组小鼠腹腔注射Na HS(14μmol/kg)。末次暴露24 h后测定小鼠气道反应性,收集支气管肺泡灌洗液用于炎性细胞计数和总蛋白测定,收集肺组织标本行HE染色观察形态改变。测定肺组织中IL-6、IL-8、丙二醛(MDA)和NF-κB p65蛋白水平。结果:与control组相比,O_3组的气道反应性、炎性细胞数、总蛋白浓度和炎症评分,以及IL-6、IL-8、MDA和NF-κB p65蛋白水平明显增高,NaHS+O_3组则明显低于O_3组。结论:H_2S显著减轻了O_3暴露所致气道炎症反应,可能与抑制脂质过氧化和降低NF-κB表达相关。     

缩醛基毛冬青提取化合物R4对缺氧/复氧大鼠心肌细胞的保护作用

目的: 探讨缩醛基毛冬青提取化合物R4对缺氧/复氧损伤心肌细胞的保护作用及其机制。方法: 采用原代培养的新生大鼠心肌细胞建立缺氧/复氧损伤模型,实验分为正常细胞培养组和缺氧/复氧损伤模型组、缺氧/复氧损伤+缩醛基毛冬青提取化合物R4(5、10、20 μmol/L)组和缺氧/复氧损伤+ verapamil(5 μmol/L)组。用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性,硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛(MDA)含量,MTT染色法测定线粒体脱氢酶活性改变,化学比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)活性变化, Griess法测定一氧化氮(NO)的含量。结果: 缩醛基毛冬青提取化合物R4可显著提高缺氧/复氧损伤心肌细胞内SOD的活性及细胞内线粒体脱氢酶活性,能显著抑制LDH的活性、MDA的生成以及提高NO的含量,并能明显抑制心肌细胞凋亡。结论: 缩醛基毛冬青提取化合物R4具有明显抗缺氧/复氧损伤、保护心肌细胞的作用。     

硫化氢对肠缺血再灌注损伤大鼠回肠上皮细胞凋亡的影响

 目的: 探讨硫化氢(H₂S)对大鼠缺血再灌注(I/R)损伤回肠上皮细胞线粒体形态和功能及凋亡的影响。方法: 24只雄性Wistar大鼠随机分为假手术(sham)组、I/R组和I/R+NaHS组。建立大鼠肠I/R损伤模型。在灌注前10 min时经I/R+NaHS组大鼠尾静脉注入100 μmol/kg NaHS后按1 mg·kg^-1·h^-1输注直到再灌注2 h,实验结束后取回肠标本测定回肠上皮细胞形态和呼吸功能指标。敏感硫电极法测定血浆H₂S含量。RT-PCR检测回肠组织Bcl-2和Bax mRNA表达,Western blot 检测总caspase-3、活化型caspase-3、细胞色素C(Cyt C)、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果: I/R组线粒体的面积、体积密度、最大直径、最小直径、等效直径以及活化型caspase-3、Cyt C和Bax表达均显著大于I/R+NaHS和sham组(P<0.01)。I/R组线粒体数量、周长、比表面、面积密度和粒子数密度、血浆H₂S、R₃、R₄、RCR、P/O和Bcl-2表达均显著小于I/R+NaHS和sham组(P<0.01)。结论: 硫化氢下调活化型caspase-3、Cyt C和Bax的蛋白水平,上调Bcl-2表达,对I/R损伤大鼠回肠上皮细胞线粒体形态和功能均有保护作用。