金线莲ISSR反应体系的建立与优化

目的针对台湾金线莲ISSR反应的特点,建立一个稳定性高、重现性好,适合金线莲ISSR遗传差异分析的反应体系。方法确立金线莲ISSR初始反应体系并对引物进行初筛;设定反应体系中各因子的不同浓度并进行PCR扩增,依据稳定性高、重现性好的原则,对该反应体系进行调整与优化,最终建立稳定可靠的ISSR反应体系。结果首次建立了金线莲ISSR反应的最适体系(25μL):1×PCR buffer,2 mmol/L MgCl2,200μmol/L dNTP Mixture,0.2μmol/L引物,1 U Taq酶,DNA模板约20 ng;扩增程序:94℃充分变性7 min,94℃变性30 s,52℃退火45 s,72℃延伸2 min,45个循环后,最后72℃延伸10 min。结论所建立的金线莲ISSR反应体系具有稳定性高、重现性好、标记位点清晰、检测多态性能力强等特点,可以较好地应用于野生金线莲的居群差异研究及经长期组培繁殖后金线莲无菌苗的遗传变异研究。     

何首乌ISSR—PCR反应体系的建立与优化

目的 建立和优化ISSR-PCR反应体系.方法 通过单因素实验研究ISSR反应体系中主要成分(模板、Taq DNA聚合酶、Mg2 、引物、dNTPs)以及退火温度对扩增结果的影响.结果 建立了适合何首乌ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在25μl反应体系中,内含1×Taq酶配套缓冲液、100ng模板、1.5 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L Mg2 、0.6μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTPs.扩增程序为94℃预变性5 min;然后是94℃变性45s,(据不同引物的退火温度)复性1 min,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃延伸7 min,4℃保存.结论 这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行何首乌鉴定及种质资源遗传多样性分析提供了一个标准化程序.     

利用综合评分法优化柴胡ISSR-PCR反应体系

目的研究柴胡ISSR-PCR的最佳反应体系。方法应用综合评分法,对Taq酶、Mg2+、引物、总DNA和dNTPs 5种ISSR反应成分进行优选。结果优化反应体系为:25μL反应体系中含有1×buffer、Taq酶1.0 U、Mg2+2.5 mmol.L-1、引物0.4μmol.L-1、DNA 75 ng、dNTPs 0.3 mmol.L-1。结论综合评分法优化柴胡ISSR反应体系可行,为下一步试验提供了可靠参数。     

保康柴胡种质资源的ISSR研究

目的通过ISSR分子标记技术考察保康柴胡与不同品种柴胡间的亲缘关系。方法从60条引物中筛选出7条合适的引物,对不同品种的柴胡进行ISSR分析,构建聚类系统树状图。结果 7条引物共扩增出81条条带,其中多态性条带79条,占97.5%,聚类分析显示同产地内遗传特性相对稳定,但种内遗传变异明显。讨论保康安家湾柴胡种质较好,值得推广。     

三角叶黄连ISSR反应体系的建立与优化

目的 针对三角叶黄连ISSR的反应特点,建立稳定可靠的ISSR-PCR分子标记反应体系,为进一步研究三角叶黄连的种质资源遗传多样性奠定基础.方法 通过筛选引物并设定影响三角叶黄连ISSR-PCR反应诸因子的不同梯度,检测其不同反应体系的扩增效果,分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立三角叶黄连ISSR-PCR稳定可靠的反应体系.结果 建立了可用于三角叶黄连ISSR-PCR分析的最适宜的反应体系:25 μLPCR反应体系中,内含10×PCR Buffer 2.5 μL,1.5 mmol/L Mg~(2+),200 μmol/L dNTP,0.3 μmol/L 引物,40 ng模板,1.0 U Taq DNA聚合酶.扩增程序为94℃预变性5 min,然后进行35个循环:94℃变性30 s,(据不同引物的退火温度)复性60 s,72℃延伸90 s,循环结束后72℃延伸7 min,4℃保存.结论 所建立的三角叶黄连ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力强、重复性好等特点,可以较好地应用于三角叶黄连的种质资源遗传多样性及居群鉴别的研究.     

南、北五味子ISSR鉴别研究

目的：为准确鉴别南五味子和北五味子寻找一种新的鉴别手段。方法：采用ISSR(Inter Simple Sequence Repeats)技术对南、北五味子基因组DNA进行PCR扩增。结果：9个ISSR引物中有3个扩增出多态性好的条带，根据其琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA带型差异可迅速区分南、北五味子。结论：ISSR技术是在分子水平上鉴别南、北五味子的一种行之有效的方法。     

柴胡与狭叶柴胡的特异性引物PCR鉴别方法

目的设计专用于柴胡与狭叶柴胡鉴别的ARMS特异性引物,为柴胡、狭叶柴胡的药材鉴别提供分子鉴定依据。方法根据柴胡、狭叶柴胡与其他柴胡属植物的r DNA ITS序列,寻找柴胡与狭叶柴胡的序列特异性位点,设计用于进行柴胡与狭叶柴胡分子鉴别的特异性引物。结果该特异性引物为柴胡、狭叶柴胡的鉴别提供了分子鉴定依据,可从多种药材及中成药(蜜丸、水蜜丸)中快速、准确地检测出柴胡、狭叶柴胡。结论运用特异性引物PCR法能有效地从植物和中成药(蜜丸及水丸)中鉴别出柴胡与狭叶柴胡,该方法具有准确、高效、省时、简便的特点。     

北京地区野生柴胡种质资源的ISSR研究

目的:通过ISSR分子标记技术考察北京地区野生柴胡不同种质资源之间的亲缘关系。方法:从43条引物中筛选出8条合适的引物,对北京地区不同产地采集的15份野生柴胡种质资源进行ISSR分析,构建聚类系统树状图。结果:8条引物共扩增出130条条带,其中多态性条带114条,占87.7%,聚类分析显示北京地区野生柴胡遗传多样性较高,并存在明显的种内遗传变异。结论:北京地区野生柴胡呈现一定的地域性分布趋势,应加以保护,初步认为百花山山腰及山脚柴胡值得推广种植,研究为北京地区柴胡种质亲缘关系研究及栽培品种的选育奠定了基础。     

正交试验优化黄连ISSR反应体系的研究

目的:优化黄连(味连,Coptis chinensis Franch.)ISSR反应体系。方法:利用正交试验设计,从Mg2 、dNTP、引物、BSA4种因素3个水平进行优化。结果:确立了适合黄连ISSR分析的反应体系,即在25μL反应体系中,内含1×PCR buffer、1.5mmol/L Mg2 、200μmol/L dNTP、0.4μmol/L引物、40ng模板、1U TaqDNA聚合酶。结论:利用此优化反应体系能得到清晰、稳定的图谱。     

黄连药材DNA提取及RAPD反应体系的优化

目的探索黄连药材DNA的提取并对其RAPD反应体系进行优化。方法采用目前较为流行的苯酚法、CTAB法、高盐低pH值法,通过电泳、紫外分光光度仪检测及RAPD扩增效果确定黄连药材基因组DNA提取的最佳方法。结果CTAB法为黄连药材基因组DNA提取的最佳方法,建立了适合黄连药材的RAPD反应体系:25μL体系中内含1×PCRbuffer、2mmol/LMg2 、100~150μmol/LdNTP、20ng引物、40ng模板、1UTaq酶。结论CTAB法及黄连药材的RAPD反应体系可以用于黄连药材的RAPD分析。     

地龙ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的 建立和优化地龙ISSR-PCR反应体系.方法 以地龙药材为实验试材,采用异丙醇沉淀法提取了地龙总DNA模板,对地龙ISSR-PCR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选.结果 建立了标记位点清晰、稳定、重复性好,可用于地龙ISSR分析的最佳反应体系,50 μl体系中含有:1×Taq酶配套缓冲液,DNA模板50 ng,2.5U Taq DNA聚合酶,2 mmol/L MgCl2,0.8 μmol/L引物,0.2 mmol/L dNTPs.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,(据不同引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃延伸5 min,反应结束后,4℃保存.结论 这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行地龙类药用动物鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了基础.     

阳春砂ISSR-PCR反应体系的建立和优化

目的 建立起适合阳春砂的ISSR-PCR反应体系.方法 综合运用单因素实验和L9(34)正交实验两种方法,对DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶等因素进行优化,以及采用温度梯度筛选引物的退火温度.结果 最终获得的阳春砂的最优ISSR-PCR体系为:总体积为20 μl,其中包括10×Ex Taq Buffer(含15 mmol·L-1 Mg2+)2 μl,25 ng DNA模板,0.50 μmol·L-1引物,0.75 mmol·L-1 dNTPs和1.0 U Ex Taq酶.通过温度梯度筛选出引物UBC808的最佳退火温度为52.0 ℃.结论 这一优化体系为阳春砂的ISSR分析奠定了基础.     

麻花秦艽ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的:建立麻花秦艽的简单重复序列区间-聚合酶链反应(ISSR-PCR)最佳反应体系,为该药材的种质鉴定及遗传多样性等研究提供参考。方法:运用单因素试验和正交试验优选麻花秦艽的ISSR-PCR反应体系中DNA模板用量,Mg2+浓度,dNTPs浓度,TaqDNA聚合酶用量和引物浓度等参数,确定麻花秦艽每条引物的最佳退火温度。结果:ISSR-PCR最佳反应体系(20μL)为模板DNA1μL(36mg·L-1),10×PCR缓冲液(含Mg2+)1.75μL(20mmol·L-1),dNTPs0.8μL(10mmol·L-1),Taq酶0.1μL(0.5%)及引物0.6μL(10mmol·L-1);筛选出12条多态性高、扩增稳定的ISSR引物,UBC-809引物的最佳退火温度55.5℃。扩增出的7条带中多态性带为6条,多态性位点比率85.71%。结论:建立的麻花秦艽ISSR-PCR反应体系稳定可靠,位于500bp处的条带为非多态性条带,可作为该种属的特征性条带。     

南北柴胡HPLC-ELSD指纹图谱的研究

目的:采用HPLC-ELSD法分别建立南、北柴胡的指纹图谱,并进行真伪鉴别。方法:样品的甲醇提取液采用TOSOH TSKgel ODS-100V C18(4.6mm×15cm,5μm)色谱柱分析,乙腈-水梯度洗脱,流速:1.0 mL/min柱温:25℃,检测器为蒸发光散射检测器(ELSD)。并对结果进行相似度评价和主成分分析。结果:建立了含有11个共有峰的北柴胡HPLC-ELSD指纹图谱和含有14个共有峰的南柴胡HPLC-ELSD指纹图谱。伪品的相似度低,可以通过指纹图谱进行真伪鉴别。结论:该方法能快速可靠的鉴别和区分南、北柴胡,可以用于柴胡的质量控制。     

综合评分法优化柴胡RAPD-PCR反应体系

目的采用综合评分法优化柴胡RAPD-PCR的反应体系.方法以柴胡基因组DNA为模板,应用L16(4 5)正交表.研究了Taq酶、Mg2 、随机引物、dNTPs和模板DNA 5种RAPD反应组分浓度变化对扩增结果的影响.结果优化反应体系为25 μL反应体系中含有1 × buffer、Taq 酶1.5 U、Mg2 2.5 mmol/L、引物0.4 μmol/L、dNTPs 0.15 mmol/L、模板DNA50ng.结论综合评分法能客观高效的优化柴胡RAPD反应体系.     

乌头简单序列重复区间扩增条件的优化

目的保证乌头ISSR—PCR的稳定性、提高对乌头遗传多样性，亲缘关系分析、种质鉴定的可靠性。方法收集西南地区23个乌头材料，以Mg^2＋，dNTP，引物和聚合酶建立L9（3^4）正交设计，并同时考察模板和甲酰胺浓度及退火温度，建立适宜的ISSR—PCR体系。结果以Mg^2＋2．0mmol／L、dNTP0．25mmol／L、引物0．3μmol／L、rTaq酶1u、模板1．5ng／μl、甲酰胺2％及退火温度（Tm-3）℃的ISSR反应体系最优。结论实验建立的ISSR—PCR体系反应稳定，能用于乌头6^TSSR奔析     

人工栽培与野生北柴胡的粉末显微鉴定比较

目的 比较栽培柴胡与野生北柴胡的粉末显微特征.方法 采用显微镜对其粉末进行辨识.结果 栽培品种北柴胡和野生北柴胡都含有比较多分泌管以及分泌物,但野生北柴胡中的分泌管和分泌物明显比栽培品种北柴胡粉末中少.结论 上述特征可作为栽培北柴胡与野生北柴胡显微学鉴定依据.