蜜蜂麻痹病病毒研究进展

早在一百多年前已发现成年蜜蜂的“麻痹”症状,在蜂群中有一些成年蜜蜂表现异常,它们的翅与躯体颤抖不能飞翔,几天以后很快死亡。长久以来,许多学者认为蜜蜂麻痹病的病原体可能是病毒,但一直未得到证实。直到1963年,Bailey等才首先分离出两种蜜蜂麻痹病病毒,并用分离出来的两种病毒注射感染健康蜜蜂,几天内蜜蜂出现麻痹症状,失去飞翔能力。其中一种病毒感染的蜜蜂,出现颤抖症状,几天后死亡,作者称这种病毒为慢性蜜蜂麻痹病病毒(CBPV)。另一种病毒感染的蜜蜂出现麻痹症状后1～2天内很快死亡,称为急性蜜蜂麻痹病病毒(ABPV)。后来,在成年蜜蜂的提取液内,又发现了一种与上述病毒抗血清不起反应的病毒颗粒,这种病毒注射     

慢性蜜蜂麻痹病毒半套式PCR检测方法的建立

参考NCBI(National Center of Biotechnology Information)已发表的慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)的全基因序列,设计3条检测CBPV的特异性引物,建立CBPV半套式PCR(Polymerase Chain Reaction)检测方法,对其外引物退火温度(52、54、56和58℃)、内引物退火温度(48、50、52和54℃)、引物浓度(0.1、0.2和0.4mmol/L)和ExTaq酶体积(0.25、0.5和1μL)进行优化,并对优化后的方法进行了特异性、敏感性验证,同时,利用该方法对20份临床样品进行检测。结果表明,该半套式PCR最佳外引物退火温度、内引物退火温度、引物浓度和ExTaq酶体积分别为56℃、50℃、0.2mmol/L和0.25μL;感染CBPV与健康蜜蜂、急性蜜蜂麻痹病毒(Acute paralysis virus,ABPV)、中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood bee virus,CSBV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)、蜜蜂残翼病毒(Deformed wing virus,DWV)的cDNA均无交叉反应,检出最低下限为10-3pg;从20份临床样品中检出4份阳性。说明建立的CBPV半套式PCR检测方法具有快捷、敏感、特异等优点,可用于CBPV感染的临床诊断和流行病学调查。     

蜜蜂以色列急性麻痹病毒(IAPV)研究进展

2006年冬季至2007年春季,美国发生了大范围的蜜蜂突然消失现象,类似的情况也发生在欧洲的部分地区,引发了严重的授粉危机。科学家对此展开了深入细致的研究并推测以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysisvirus,IAPV)很可能是蜂群崩溃失调病(colony collapse disorder,CCD)的致病因素。随着研究的深入,对CCD的致病因素及其发生机制有了更深入的认识,并趋向于认为多方面的致病因素可能导致了CCD的发生。本文综述了目前国内外对IAPV的研究进展。     

慢性蜜蜂麻痹病毒Ch1株的编码区测序及其序列的分析

对中国分离株慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)Ch1编码区全基因序列进行克隆、测序、分析。利用RT-PCR方法和生物信息学软件,对本实验室分离到的Ch1株CBPV编码区的基因序列进行克隆,测序,与GenBank收录的CBPV毒株进行同源性比较,并以RdRp为靶基因构建了遗传进化树。结果显示,CBPV Ch1株的编码区由RNA1(GenBank No.KU950353)和RNA2(GenBank No.KU950354)两部分构成,全长5 979个核苷酸。其中RNA1片段全长3 674个核苷酸,编码3个开放阅读框,RNA2片段全长2 305个核苷酸,编码4个开放阅读框,RNA2片段中ORF2和ORF3,可能编码两个结构蛋白,分别命名为SP1和SP2。RNA1和RNA2核苷酸序列与2005年法国分离株Fr2核苷酸序列同源性最高,分别为96.1%和95.5%,但预测蛋白SP1核苷酸序列同源性与2006年乌拉圭分离株Ur1核苷酸序列同源性最高(96.9%)。基于RdRp为靶基因进行了遗传进化分析表明,Ch1株与Fr2株位于同一分支,且在该区域,Ch1株与Fr2株的核苷酸序列同源性最高(96.5%)。本实验成功分离到一株CBPV(KU950353,KU950354),并命名为Ch1株,完成了Ch1株CBPV的编码区的序列测定以及核苷酸序列与推导的氨基酸序列同源性比较及遗传进化分析,为研究CBPV的致病机制和免疫机制提供重要信息。     

引致河蟹颤抖病的病毒的核酸定性

对河蟹(中华绒螯蟹)“颤抖病”病毒及其核酸进行了电镜观察。纯化病毒经负染后由电镜观察显示,病毒粒子呈球状,有囊膜和纤突,直径约为150nm。纯化病毒经核酸酶降解杂核酸后,加入8mol/L尿素释放病毒核酸,经水相法展开后,用覆有碳膜的铜网取样,再经染色和真空镀膜,于电镜下观察。病毒核酸呈单股线状,底片经光学精确放大后,测定了核酸分子的长度,根据经验公式计算出病毒核酸分子量为5.05×106。抽提的病毒核酸在0.8%琼脂糖凝胶电泳中呈单一条带,大小为15~16kb,经核酸酶酶切显示,核酸对DNaseI不敏感,对RNase、MungBeanNuclease敏感,根据以上特性判断,该核酸为ssRNA。     

检测蜜蜂急性麻痹病毒TaqMan实时荧光RT-PCR方法的建立和初步应用

[背景] 蜜蜂急性麻痹病毒（Acute Bee Paralysis Virus,ABPV）是一种高毒力的蜜蜂病毒,可以引起蜜蜂的大批死亡和蜂群衰竭。[目的] 建立一种快速、灵敏的ABPV实时荧光RT-PCR检测方法。[方法] 根据ABPV衣壳蛋白基因保守序列设计引物和探针,通过对引物、探针浓度和退火温度等反应条件进行优化,建立基于TaqMan探针检测ABPV的实时荧光RT-PCR方法,并对方法的灵敏性、特异性和稳定性进行验证。[结果] ABPV实时荧光RT-PCR检测方法在9.8×10¹-9.8×10⁸ copies/μL之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R²为0.998,扩增效率为103.8%。该方法的检测灵敏度为9.8 copies/μL;对其他蜜蜂病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性;重复性试验结果显示组内和组间的变异系数分别为0.19%-0.80%和0.57%-1.07%,重复性良好。对2018年-2019年在福建地区采集的70份蜜蜂样品进行ABPV检测,阳性率为2.86%。[结论] 建立的ABPV实时荧光RT-PCR检测方法能用于该病的实验室检测、流行病学调查和疫情监测。     

北京地区六种蜜蜂病毒病的流行病学研究

【目的】对蜜蜂的6种病毒:以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus,IAPV)、残翅病毒(Deformed wing virus,DWV)、囊状幼虫病病毒(Sacbrood virus,SBV)、急性蜜蜂麻痹病毒(Acute bee paralysis virus,ABPV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)、慢性麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)在北京地区的流行情况进行调查,以期为该地区蜜蜂病毒病的防控提供一定的理论依据。【方法】应用多重RT-PCR法确定上述6种病毒在该地区的感染情况,并通过序列分析确定特异性。【结果】在所有检测样本中均未检测到急性麻痹病病毒和慢性麻痹病病毒,感染率最高的是以色列急性麻痹病毒,其次是残翅病毒。检测的样本普遍存在混合感染。【结论】以色列急性麻痹病毒、残翅病毒、囊状幼虫病病毒、黑蜂王台病毒4种病毒可能在北京地区广泛分布。     

引致河蟹颤抖病的病毒的核酸定性

对河蟹(中华绒螯蟹)"颤抖病"病毒及其核酸进行了电镜观察.纯化病毒经负染后由电镜观察显示,病毒粒子呈球状,有囊膜和纤突,直径约为150nm.纯化病毒经核酸酶降解杂核酸后,加入8mol/L尿素释放病毒核酸,经水相法展开后,用覆有碳膜的铜网取样,再经染色和真空镀膜,于电镜下观察.病毒核酸呈单股线状,底片经光学精确放大后,测定了核酸分子的长度,根据经验公式计算出病毒核酸分子量为5.05×106.抽提的病毒核酸在0.8%琼脂糖凝胶电泳中呈单一条带,大小为15～16kb,经核酸酶酶切显示,核酸对DNase I不敏感,对RNase、Mung Bean Nuclease敏感,根据以上特性判断,该核酸为ssRNA.     

小鹅瘟病毒核酸链型与结构蛋白分析

采用简易方法从鹅胚中分离纯化的小鹅瘟病毒(GPV)样品相当纯净,以致在电镜下呈晶格排列。用负染色技术观察病毒的形态结构,病毒直径为18～20nm,无囊膜。病毒颗粒含有4种结构蛋白,其分子量分别为88、78、66和51kd。根据病毒的核酸链型分析,小鹅瘟病毒含有单链核酸。此结果支持了小鹅瘟病毒属于细小病毒属的结论。     

慢性前列腺炎及其不育患者前列腺液的厌氧菌研究

本文报告95例(24～40岁)慢性前列腺炎(Chronic ProstatitisCP)患者前列腺液(简称EPS)的厌氧菌培养结果。厌氧菌培养阳性49例(51.57％),共分离出26种65株厌氧菌,分离率从高至低依次为拟杆菌(41.65％),消化链球菌(29.23％)、消化球菌(9.23％)和小韦荣氏球菌(4.62％),还有梭杆菌、衣氏放线菌、丙酸杆菌和真杆菌。这些厌氧菌种类与男性尿道口和女性生殖道正常菌群的厌氧菌相似,提示这些厌氧菌是泌尿生殖道正常菌群,也可能是条件致病菌。对照组(24～38岁)的正常男性15例的EPS厌氧菌培养均阴性。对上述CP患者中的69例生育力与厌氧菌培养阳性率比较,对照组15例,CP患者生育组34例和不育组35例,三个组之间患者EPS的厌氧菌阳性率经统计学处理有非常显著性差异(P<0.01)、CP不育组与对照组有非常显著性差异(P<0.01),而CP生育组与对照组无显著性差异(P>0.05)。提示厌氧菌可能不仅是慢性前列腺炎的致病菌之一,而且可能还与慢性前列腺炎所致的不育有关。     

山羊关节炎—脑炎病毒结构蛋白分析及其相应抗体在山羊体内的消长规律

对山羊关节炎－脑炎病毒（ＣＡＥＶ）结构蛋白进行了分析，主要蛋白有ＧＰ１２５、ＧＰ９０、ＧＰ７０、ＧＰ４５、Ｐ２８、Ｐ１６和Ｐ１４。同时检测了ＣＡＥＶ实验感染山羊后的ＧＰ１２５、ＧＰ９０和Ｐ２８抗体在机体内的消长情况。     

水稻矮缩病毒第一号组份基因和编码蛋白的序列分析

水稻矮缩病毒（RiceDwarfVirus,简称RDV）是我国南方水稻病毒病的重要病原,属植物呼肠孤病毒。从中国福建分离物中克隆了基因组第一号片段（S1）的全长cDNA并对其进行全序列分析,结果表明RDV福建分离物S1克隆片段全长4422bp,含有一个长4332bp的开放阅读框架,编码一个由1444个氨基酸组成的多肽（P1）,分子量为164kD．根据基因序列,对推测的P1氨基酸序列分析表明,序列中含有依赖于RNA的RNA聚合酶（RNA-dependentpolymerase-RDRP）保守序列：motifＩ（DXXXXD）、motifⅡ（SGXXXTXXXN）和motifⅢ（GDD）,除此之外,在模式Ⅲ后还存在一个很保守的区域EXXKXY。由此说明RDVS1编码的蛋白P1可能是病毒的一种RDRP。将RDV福建分离物引核苷酸和编码蛋白氨基酸序列与日本流行株系相比,同源性分别为95％和97％。RDV福建分离物S1序列已被DenBank接受,号码为U73201。     

大菜粉蝶颗粒体病毒对菜粉蝶幼虫取食、生长、发育的影响

菜粉蝶幼虫在一、二、三、四龄初期饲以大菜粉蝶颗粒体病毒(PbGV),食量减少99.3—38.4%;四龄末或五龄初饲毒,食量反而比健虫高出36.3%和87.2%。幼虫感病后取食期的缩短或延长是食量变化的主要原因。幼虫病死前脱皮过程先被抑制,其结果往往使得死亡时所处的龄期明显延长。幼虫在四龄末饲毒后,由于五龄期延长,食量增加,其死亡前达到的最高体重平均为357.9毫克,远高于健虫化蛹前的最高体重。PbGV对菜粉蝶化蛹也有明显影响。幼虫在五龄前饲毒,一般不能化蛹。五龄第1—3天饲毒,化蛹率26.4—87.9%,第4天饲毒对化蛹无影响。本文结果对应用PbGv防治菜粉蝶幼虫危害以及对该病毒的大量增殖均具指导意义。     

鼻咽癌组织中Epstein－Barr病毒潜伏感染膜蛋白基因片段的克隆及分析

从两例鼻咽癌（ＮＰＣ）病人的活检组织切片中,用ＰＣＲ方法扩增出ＥＢ病毒潜伏感染膜蛋白（ＬＭＰ）基因的ＥｘｏｎⅠ、ＩｎｔｒｏｎⅠ、ＥｘｏｎⅡ和ＩｎｔｒｏｎⅡ共５００ｂｐ的片段,克隆入载体ｐＧＥＭ－３ｚｆ（＋）′,测定核苷酸序列,其中有一个样品所测序列段与台湾株相似,另一个样品则与Ｅ９５－８极为相似。由此可知,中国大陆南方的ＮＰＣ组织中ＥＢＶ－ＬＭＰ基因存在不同的变异。     

丙型肝炎病毒核壳蛋白抗原的化学合成及其在血清学诊断中的应用

选取丙型肝炎病毒(HCV)核壳蛋白区两个可能含有优势抗原表位的19和16氨基酸的肽殴(C-19肽和C-16肽),利用固相多肽合成技术进行了化学合成。经用反相高压液相层析(HPLC)及脉冲液相多肽测序技术检定合成肽产品的纯度及序列后,以C-19和C-16肽作为包被抗原组装成检测HCV血清抗体的ELISA诊断试剂。用所组装的合成肽试剂检测中国药品生物制品检定所提供的HCV标准参比血清,并比较利用该试剂和美国Abbott实验室生产的HCV第二代EIA诊断试剂平行检测109份献血员血清的结果,表明C-19肽能够特异、重复、灵敏地检出HCV血清抗体,可以作为我国第一代HCV诊断试剂的合成肽抗原。     

甜菜坏死黄脉病毒内蒙分离物RNA3序列分析及编码25kD蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）内蒙分离物的总ＲＮＡ为模板,通过反转录－ＰＣＲ扩增获得ＢＮＹＶＶＲＮＡ３全长ｃＤＮＡ。将其克隆到ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）上,得到重组质粒ｐＧＢＹ５６。序列分析结果表明,内蒙分离物ＲＮＡ３基因组全长为１７７５ｎｔ,其中包含３个开放阅读框架,分别编码２５ｋＤ蛋白、４．６ｋＤ蛋白和一种由５９个氨基酸组成的Ｎ蛋白。与法国Ｆ２分离物、德国Ｇ１分离物和日本Ｓ分离物相比,其核苷酸序列的同源性分别为９６．４％、９６．８％和９７．３％。将２５ｋＤ蛋白编码基因克隆到ｐＪＷ２上,构建了该基因的原核表达载体。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析结果表明,２５ｋＤ蛋白基因在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中经温度（４２℃）诱导后,可特异地表达２５ｋＤ蛋白